犬黑皮质素受体4真核表达载体的构建及表达

[目的]构建带myc和His标签的犬黑皮质素受体4真核表达载体并在MDCK细胞中进行表达。[方法]以犬MC4R基因组DNA为模板PCR扩增目的基因编码区,将扩增产物进行T-A克隆;酶切、测序鉴定成功后将目的基因亚克隆到真核表达载体pcDNA3.1-myc-His/A。重组体pcDNA3.1-myc-His/A-cMC4R经酶切和测序鉴定;采用FuGENE HD介导转染技术将重组体导入MDCK细胞;转染后继续培养72 h,提取细胞内总RNA,RT-PCR鉴定目的基因的表达;提取细胞总蛋白,Western Blot检测蛋白表达。[结果]构建带标签的pcDNA3.1-myc-His/A-cMC4R重组真核表达载体,测序结果与GenBank公布的序列相似性为99%。RT-PCR和Western Blot检测到目的基因表达。[结论]成功构建犬真核表达载体pcDNA3.1-myc-His/A-MC4R,重组体能在MDCK细胞中表达。     

犬MC4R突变体D90N真核表达载体的构建及表达

[目的]构建犬黑皮质素受体4（MC4R）突变体D90N真核表达载体,并在MDCK细胞中进行表达。[方法]以犬MC4R基因组DNA为模板,应用重叠PCR扩增MC4R突变体D90N目的基因,将扩增产物进行T-A克隆;酶切、测序鉴定成功后将目的基因亚克隆到真核表达载体pcDNA3.1-myc-His/A。重组体pcDNA3.1-myc-His/A-cMC4R-D90N经酶切和测序鉴定;采用FuGENEHD介导转染技术将重组体导入MDCK细胞;转染后继续培养72.0h,提取细胞内总RNA,用RT-PCR鉴定目的基因的表达;提取细胞总蛋白,用WesternBlot检测蛋白表达。[结果]构建带标签的pcDNA3.1-myc-His/A-cMC4R-D90N重组真核表达载体,测序结果显示含有D90N突变位点。RT-PCR和Western Blot检测到目的基因表达。[结论]成功构建犬真核表达载体pcDNA3.1-myc-His/A-cMC4R-D90N,重组体能在MD-CK细胞中表达。     

犬黑皮质素受体4真核表达载体的构建及在COS-7细胞中的表达

[目的]构建犬黑皮质素受体4真核表达载体并在COS-7细胞中进行瞬间表达。[方法]以犬MC4R线性DNA为模板,进行引物设计,PCR特异性扩增,扩增产物连接到pMD18-T载体上,酶切鉴定后测序。将该片段亚克隆到真核表达载体pcDNA3.1(+)。重组体pcD-NA3.1(+)-MC4R经过酶切和测序鉴定。采用FuGENE HD介导转染技术将pcDNA3.1(+)-MC4R导入COS-7细胞,提取细胞内总RNA,RT-PCR扩增犬MC4R基因的全长cDNA编码序列。[结果]克隆犬MC4R基因的全长cDNA序列,并以pcDNA3.1(+)表达载体为骨架,构建真核表达载体,测序的扩增片段与GenBank公布的模板序列经Blast比对相似性为99%。采用G418筛选,获得带有pcDNA3.1(+)-MC4R的COS-7细胞。[结论]成功构建犬真核表达载体pcDNA3.1(+)-MC4R,重组体能在真核细胞中表达。     

新孢子虫NcGRA2基因真核表达质粒的构建及其在293细胞内的表达

[目的]为了构建新孢子虫NcGRA2基因的真核表达载体,探讨重组载体在体外细胞的表达.[方法]从含有NcGRA2基因的重组质粒pGEX-4T1-NcGRA2中,用限制性内切酶进行酶切获得带有粘性末端的NcGRA2基因片段.经琼脂糖凝胶电泳切胶回收NcGRA2基因片段,与pcDNA3.1载体连接.将构建的真核表达质粒pcDNA3.1-NcGRA2转染到293细胞中表达.[结果]经酶切分析和序列测定,证实了重组质粒的正确连接.经免疫荧光抗体试验验证pcDNA3.1-NcGRA2能在293细胞中表达NcGRA2蛋白.[结论]获得重组质粒pcDNA3.1-NcGRA2,并能在体外细胞中表达NcGRA2蛋白,为进一步研究核酸疫苗的动物免疫试验奠定了基础.     

犬瘟热病毒水貂分离株F基因真核表达载体的构建与表达

为了构建犬瘟热病毒F基因真核表达载体,利用RT-PCR方法扩增出水貂源犬瘟热病毒分离株的F基因,将其克隆至pMD-18T载体上,用BamHⅠ和KpnⅠ进行双酶切,回收目的基因。将目的基因亚克隆至pcD-NA3.1(+)中,获得真核重组质粒pcDNA3.1-CDVF。通过脂质体介导法将pcDNA3.1-CDVF转染至BHK-21细胞中,并利用间接免疫荧光试验和RT-PCR法检测pcDNA3.1-CDVF在BHK-21细胞中的表达情况。结果表明,真核重组表达质粒pcDNA3.1-CDVF构建成功,F基因可在BHK-21细胞中表达。     

犬细小病毒VP2基因真核表达质粒的构建与瞬时表达

[目的]构建犬细小病毒(CPV)VP2基因真核表达质粒,为研究核酸疫苗奠定基础.[方法]根据CPVVP2基因序列设计特殊引物,采用PCR方法从疑似"犬细小病毒"的患犬粪便基因组中扩增VP2基因,将其克隆至真核表达载体pcDNA3.1(+),测序验证后,小白鼠尾静脉注射瞬时表达VP2基因,8 h后取小白鼠肝脏提取总RNA,进行RT-PCR扩增.[结果]在病犬粪便基因组中扩增得到1 755 bp的VP2基因片段,并构建了真核表达质粒pcDNA3.1(+)-VP2,从瞬时表达的小白鼠肝脏总RNA中可扩增到目的条带.[结论]成功构建了犬细小病毒VP2基因真核表达重组质粒,并在小白鼠体内进行了瞬时表达.     

真核表达载体pcDNA3.1(+)-GFP-MC1R的构建及在羊驼毛囊干细胞中的表达

旨在构建含有MC1R基因的pcDNA3.1(+)真核重组表达载体,为进一步研究MC1R的生物学功能奠定基础。应用RT-PCR技术从羊驼皮肤cDNA文库中扩增MC1R基因全长cDNA,然后通过双酶切将MC1R基因全长cDNA克隆到真核表达载体pcDNA3.1(+),然后采用脂质体法转染体外培养的羊驼毛囊干细胞后,通过G418筛选培养,建立稳定的转染体系,直接荧光观察pcDNA3.1/MC1R融合蛋白在细胞中的分布定位,并通过Western Blot方法检测MC1R在羊驼毛囊干细胞中的表达。结果表明,成功构建了pcDNA3.1/MC1R重组表达载体,并且发现试验组的毛囊干细胞中表达MC1R蛋白显著高于空白组(P0.05)。成功构建了含有绿色荧光蛋白基因的真核表达载体pcDNA3.1/MC1R,且MC1R基因在羊驼毛囊干细胞中获得表达。     

真核表达载体pcDNA3.1（＋）-vp28的构建及其在细胞中的表达

[目的]为研究对虾白斑综合征病毒（WSSV）囊膜蛋白与虾细胞之间的作用机制奠定基础。[方法]采用PCR扩增方法构建含白斑综合征病毒囊膜蛋白VP28的真核表达重组载体pcDNA3.1（＋）-vp28,用磷酸钙共沉淀法将重组质粒转染到293T细胞中,采用SDS-PAGE和Western blot检测表达产物。[结果]VP28的PCR扩增产物在琼脂糖凝胶电泳中呈现出1条634bp左右的条带,与GenBank中vp28的序列完全一致。对pcDNA3.1（＋）-vp28转染后的阳性单克隆菌落进行PCR鉴定、扩大培养和质粒提取,并对所得质粒进行HindⅢ和BamⅢ双酶切,获得了5409和610bp左右的2条带,与预期结果一致;所获扩增产物与vp28序列完全一致,说明重组质粒pcDNA3.1（＋）-vp28被成功转染到293T细胞中;SDS-PAGE和Westernblot检测结果显示,pcDNA3.1（＋）-vp28在293T细胞中的表达产物与预期结果相符。[结论]pcDNA3.1（＋）-vp28在293T细胞中可成功表达VP28。     

弓形虫AMA1蛋白真核表达载体的构建及免疫活性检测

[目的]构建弓形虫AMA1基因的真核表达质粒,研究其在体外细胞中的表达情况。[方法]运用PCR方法和克隆技术,构建pcD-NA3.1-AMA1重组质粒;利用脂质体介导转染法,将该重组质粒导入HEK-293细胞,用Western blotting法检测其在体外的表达情况。[结果]从弓形虫RH株cDNA中扩增出AMA1基因片段,成功构建重组表达质粒pcDNA3.1-AMA1,转染AMA1基因的HEK-293细胞表达产物经Western blotting鉴定,其分子量约为70kD,能被特异性免疫血清所识别。[结论]构建的真核表达质粒pcDNA3.1-AMA1能在HEK-293细胞中表达,为下一步弓形虫DNA疫苗的研究奠定了基础。     

小鼠Foxc2质粒载体的构建及功能鉴定

构建pcDNA3.1-Foxc2真核表达载体,并以脂质体转染3T3-L1前体脂肪细胞,探究Foxc2对脂代谢的影响。取孕后15d小鼠腹部脂肪组织提取总RNA,用PCR扩增Foxc2全长序列并连接至pMD18-T载体,测序正确后克隆至pcDNA3.1(+)真核表达载体,成功构建pcDNA3.1-Foxc2重组质粒载体。重组质粒转染3T3-L1前体脂肪细胞系,以未转染和空载体转染作为对照,通过RT-PCR和Western blotting法检测Foxc2核酸及蛋白表达,同时检测3T3-L1前体脂肪细胞中脂代谢相关基因FAS、ATGL、HSL及PPARγ的表达。结果显示,重组质粒转染组细胞中Foxc2的核酸和蛋白水平均显著高于对照组。同时发现超表达Foxc2显著降低FAS表达,显著升高HSL及PPARγ的表达,但是对ATGL的表达无显著影响,表明Foxc2具有抑制脂肪沉积的功能。     

表达鹅细小病毒VP3基因重组腺病毒的构建与鉴定

[目的]构建表达鹅细小病毒 （GPV） VP3基因的重组腺病毒,为机体免疫试验和免疫效果评价奠定基础.[方法]以重组质粒pcDNA-VP3为模板,以GPV-VP3为目的基因,构建GPV-VP3重组腺病毒载体,通过转染获得能稳定表达GPV-VP3基因的重组腺病毒,通过IFA和Western-blot检测GPV-VP3基因的表达情况.[结果]扩增到的GPV-VP3基因全长为1 605 bp,线性化的重组腺病毒穿梭质粒pCR259-VP3能在QBI-HEK293细胞中瞬时表达GPV-VP3基因,表达蛋白的分子量约为60Ku.[结论]该重组腺病毒的构建将为GPV新型疫苗研发和后期体内试验奠定基础.     

猪轮状病毒VP4蛋白基因在大肠杆菌中的表达

[目的]研究猪的轮状病毒VP4蛋白基因在BL21大肠杆菌中的表达。[方法]以猪肺脏组织中分离的总RNA为模板,采用反转录聚合酶链式反应（1it—PCR）技术扩增VP4蛋白的部分基因,将PCR产物克隆到表达载体pGEX-4T-1中,构建原核表达质粒PGEX-4T-1-VP4并对重组质粒进行酶切和测序鉴定。将重组载体PGEx4T-1-VP4转化至大肠杆菌BL21（DE3）中进行诱导表达和SDS—PAGE分析,并对重组大肠杆菌进行可溶性分析。[结果]对猪肺脏组织中分离的总RNA进行RT—PCR扩增,获得875bp的VP4部分基因,重组质粒PGEX-4T-1-VP4经BamHI和Xho Ⅰ双酶切和测序鉴定后,插入的猪轮状病毒VP4的eDNA编码区序列与已公布的猪GenBank核酸序列比对结果为99．5％;将重组质粒pGEX-4T-1-VP4-一转化至大肠杆菌B121（DE3）中,经IPTG诱导和SDS-PAGE分析,可见约58kDa融合蛋白带。[结论]该研究为进一步研究轮状病毒的疫苗研制奠定了基础。     

稳定表达犬信号淋巴细胞激活因子基因细胞株的建立与鉴定

[目的]构建稳定表达犬瘟热病毒细胞受体———犬信号淋巴细胞激活因子(SLAM)的非洲绿猴肾细胞株(Vero)。[方法]采用RT-PCR方法从犬外周血淋巴细胞中扩增出SLAM基因,将其克隆到哺乳动物真核表达载体pcDNA3.1(+)中,构建重组质粒pcDNA3.1/SLAM。采用脂质体将pcDNA3.1/SLAM转染到Vero细胞中,利用G418加压筛选和纯化培养获得稳定表达SLAM的重组Vero细胞株。应用RT-PCR和间接免疫荧光试验检测SLAM的表达。[结果]重组蛋白SLAM在Vero细胞中获得表达,并且在不同代次的阳性细胞株中均能稳定表达目的蛋白。[结论]该研究建立了稳定表达犬SLAM的细胞株Vero/SLAM,为犬瘟热病毒的分离和生物学特性研究提供了平台。     

犬瘟热病毒N蛋白基因真核表达质粒的构建与瞬时表达

[目的]构建犬细小病毒(CPV) VP2基因真核表达质粒,为研究核酸疫苗奠定基础.[方法]参考GenBank中发表的CDV N蛋白基因序列设计引物,采用RT - PCR方法从疑似犬瘟热病犬全血样品中扩增CDV N蛋白基因,将其克隆至真核表达载体pcDNA3.1(+).经测序验证后,小白鼠尾静脉注射瞬时表达CDV N蛋白基因,8h取其肝脏提取总RNA,进行RT - PCR方法扩增.[结果]在病犬的全血样品中扩增得到1 572 bp的CDV N蛋白基因片段,并构建了真核表达质粒pcDNA3.1(+)- CDV N,从瞬时表达的小白鼠肝脏总RNA中可扩增到目的条带.[结论]构建了犬瘟热病毒N蛋白基因真核表达质粒,并在小白鼠体内进行了瞬时表达.