犬SLAM基因真核表达载体的构建及在MDCK细胞中的稳定表达

为了构建稳定表达犬信号淋巴细胞激活因子(SLAM)的MDCK细胞系,该研究从犬外周血淋巴细胞中克隆了犬瘟热病毒(Canine distemper virus,CDV)细胞受体SLAM基因,将鉴定正确的SLAM基因插入到高效真核表达载体pcDNA3.1(+)中.采用脂质体转染的方式将重组质粒pcDNA3.1/SLAM转染到MDCK细胞中,采用G418加压筛选及有限稀释法克隆,获取稳定表达SLAM的MDCK细胞株.结果表明,成功构建了SLAM的真核表达载体pcDNA3.1/SLAM,并通过G418筛选获得了稳定表达SLAM的细胞系MDCK.     

口蹄疫病毒VP1基因重组慢病毒载体的构建及VP1基因稳定表达细胞系的建立

【目的】构建口蹄疫病毒VP1基因重组慢病毒载体FG9-VP1,并建立稳定表达VP1基因的BHK-21细胞系。【方法】采用RT-PCR技术从口蹄疫病毒材料中扩增出VP1基因,并将其连入慢病毒载体FG9中,经PCR、酶切和测序鉴定正确后,转染BHK-21细胞,96h后经流式细胞分选筛选GFP阳性细胞,细胞增殖后经WB检测VP1基因的表达。【结果】VP1基因重组慢病毒载体FG9-VP1测序正确,转染BHK-21细胞经流式细胞仪筛选的GFP阳性细胞后可稳定表达VP1基因。【结论】VP1基因重组慢病毒载体构建成功并获得了稳定表达VP1基因的BHK-21细胞系。     

稳定表达鸡恒定链基因的P815细胞株的建立与鉴定

[目的]获得稳定表达鸡恒定链基因（Ii）的P815细胞株。[方法]利用PCR方法获取鸡Ii链基因,利用脂质体转染P815细胞,加入G418筛选阳性细胞克隆,最后利用RT-PCR进行鉴定。[结果]通过PCR获得鸡Ii基因,大小为672 bp,进一步定向插入真核表达载体,构建重组质粒pEGFP-C1-Ii,经双酶切鉴定后转染P815细胞,通过多次克隆获得含鸡Ii链基因并能稳定表达的阳性细胞株,经RT-PCR再次鉴定,并命名为P815-Ii。[结论]获得了稳定表达鸡Ii的P815细胞株,为进一步研究Ii的结构与功能奠定了基础。     

细胞外信号调节激酶5RNA干扰稳定细胞系的建立

ERK5通路是丝裂原活化蛋白激酶(MAPK)信号通路家族成员之一,是一种非典型的MAPK通路,也叫做大MAPK通路(Big MAPK/BMK1),可以被各种刺激因素激活,与多种细胞反应(如细胞增殖、分化、转化及凋亡等)及机体多种生理病理过程(如脑发育、癌症及糖尿病等)密切相关.采用RNA干扰的方法,用构建的ERK5干扰质粒干扰ERK5表达,通过RT-PCR和Western-blotting的方法分别在RNA和蛋白水平上来检测ERK5的表达,鉴定干扰效率;通过G418对转染了干扰质粒的鼠恶性黑色素瘤细胞(B16F10细胞)进行稳定筛选,得到ERK5 RNA干扰的B16F10稳定细胞系,为后期的动物实验做准备.

Abstract：

ERK5 (extracellular-regulated kinase 5) signal pathway is a member of the MAPK family. It is an atypical MAPK signal pathway and is also named Big MAPK/BMK1. ERK5 signal pathway can be activated by various stimulating factors, and is closely associated with many kinds of cell responses, such as proliferation, differentiation, transformation and apoptosis. It is also related to the processes of physiological and pathological reactions including the development of brain, cancer and diabetes. In this study,RNAi (RNA interference) was applied to decrease the expression of ERK5. The expression of ERK5 was detected by RT-PCR and Western-blotting. B16F10 cells transformed by constructed ERK5 shRNA plasmids were stably screened using G418, and an ERK5 RNAi B16F10 stable cell line was obtained, whichwas ready for further animal experiments.     

表达犬瘟热病毒融合蛋白基因重组腺病毒的构建与鉴定

利用pVAX1载体的表达元件CMV启动子和poly(A)多聚腺苷酸信号构建了含犬瘟热病毒融合蛋白基因(F)的重组犬腺病毒。首先,利用酶切、连接等实验方法构建了含CDV启动子F蛋白基因表达盒的转移质粒pVAXΔE3LPF。再以含CAV-2SY株全基因组的pPoly2-CAV-2为载体,构建重组质粒pCAV-2-pVAXLPF,利用脂质体介导方法转染MDCK细胞,转染3次后,细胞出现了典型的犬腺病毒感染样病变。电镜负染和切片观察、酶切、PCR扩增及测序鉴定的结果表明,成功构建了含犬瘟热病毒融合蛋白基因的重组犬腺病毒,表达的融合蛋白分子质量为72ku。在MDCK细胞上连续传30代试验表明重组病毒CAV-2-pVAXLPF具有良好的遗传稳定性。     

抗犬瘟热病毒单克隆抗体杂交瘤细胞株的建立

[目的]筛选出稳定分泌抗犬瘟热病毒单克隆抗体的杂交瘤细胞株。[方法]用纯化的犬瘟热病毒(CDV)抗原免疫BALB/c小鼠,取脾细胞与SP2/0骨髓瘤细胞融合,经间接ELISA和有限稀释法克隆杂交瘤细胞。研究了杂交瘤细胞的稳定性和染色体数,测定了单克隆抗体的效价并鉴定其特异性和亚型。[结果]经反复筛选和亚克隆后,共获得3株能稳定分泌抗CDV单克隆抗体的杂交瘤细胞株。3株单抗对CDV均有较高的特异性,与犬传染性肝炎病毒、犬细小病毒均不反应。3株杂交瘤细胞的腹水效价为1∶(8 000~128 000),细胞培养上清效价为1∶(256~512),染色体数为80~100。3株单克隆抗体重链均属于IgG1,轻链均属于κ链。[结论]该研究为研制CDV快速检测试剂盒奠定了基础。     

犬瘟热病毒F蛋白基因片段的克隆与表达及其表达产物抗原性的初步鉴定

本研究采用RT-PCR法扩增出犬瘟热病毒标准疫苗株的融合蛋白基因(F基因)片段约1499 bp,克隆到pMD18-T载体,酶切鉴定后用一对特异性的引物扩增约732 bp的F蛋白基因片段。并把该基因定向克隆到原核表达载体pET-28a( )中,转化到宿主菌BL21(DE3)后进行了表达并纯化了该表达产物,Western印迹显示表达产物有良好的抗原性。     

犬瘟热病毒OP株核蛋白基因的克隆与表达

以犬瘟热病毒OP株感染Vero细胞收获病毒提取的RNA为模板,根据已发表的犬瘟热病毒OP株序列设计两对引物,RT-PCR扩增出核蛋白基因的822、897bp片段。将PCR产物定向克隆进pGEX-6p-1载体中谷胱甘肽-S-转移酶基因的下游,再将重组质粒转化进宿主菌BL_(21)中,在37℃、1.0mmol·L~(-1)IPTG的诱导下,核蛋白基因分段获得了良好的表达,表达产物经聚丙烯酰胺凝胶电泳鉴定,确定其表达融合蛋白质的相对分子质量分别为52、54ku。将表达产物回收后混合免疫小鼠,间接免疫荧光试验显示免疫小鼠的血清能与病毒感染的细胞呈现特异反应,表明体外表达核蛋白基因保留了天然蛋白部分的抗原性。     

犬瘟热病毒核衣壳蛋白N基因的真核表达及鉴定

根据GenBank发表的犬瘟热病毒N基因全序列,设计合成了1对特异扩增CDVN基因的引物。以山东泰安分离的CDV-FOX-TA株细胞毒中提取病毒RNA来制模板,利用RT-PCR扩增出了1.6kb的N基因,将其克隆到pIREShyg载体上,构建了pIRES-N真核表达载体。然后通过磷酸钙共沉淀法转染CHO-K1细胞,通过潮霉素筛选得到阳性克隆,间接免疫荧光实验（IFA）鉴定N基因在CHO细胞中的表达,并用RT-PCR方法从转录水平证实N基因在CHO-K1细胞中的表达,最终建立了CHO/CDV-N细胞株,为犬瘟热病毒的血清学检测和基因疫苗的研制奠定了基础。     

犬瘟热病毒株的分离鉴定及遗传变异分析

[目的]分离鉴定吉林地区一株犬瘟热病毒,为犬瘟热的防治提供依据。[方法]应用Vero细胞从疑是患犬瘟热藏獒脏器组织中分离病毒,并进行分子病毒学鉴定,进一步对该犬瘟热病毒株的血凝素蛋白（H）基因序列进行分析。[结果]确定该犬瘟热分离株为A-sia-Ⅰ型犬瘟热,命名为ZA10-JL。[结论]对进一步研究犬瘟热,预防以及流行病学调查都有重要的参考作用。     

表达犬瘟热H基因重组伪狂犬病毒的构建及生物学特性研究

[目的]构建表达犬瘟热Onderstepoort株H蛋白的重组伪狂犬病毒,并研究其生物学特性。[方法]通过RT-PCR方法获得Onderstepoort株H基因,插入pcDNA3.1（＋）建立好完整的真核细胞表达盒并将此表达盒亚克隆到转移载体p8AA上。在此基础上再将报告基因LacZ的表达盒插入转移载体,命名为p8AAZH。将p8AAZH与伪狂犬病毒（PRV）Bartha-K61株基因组共转染至BHK-21细胞中进行基因重组包装出毒,待细胞病变后收集病毒液。通过蓝色蚀斑筛选、PCR、电镜观察以及Westernblot,筛选纯化重组病毒并鉴定目的基因的表达。同时在BHK-21细胞上测定重组病毒的生长曲线。[结果]获得了表达H蛋白的重组伪狂犬病毒,重组病毒与亲本Bartha-K61株的生长曲线、病变特征相一致。[结论]成功构建了表达犬瘟热Onderstepoort株H蛋白的重组伪狂犬病毒,H基因的插入不影响重组病毒的增殖特性,为犬瘟热活病毒载体疫苗的研制与开发打下基础。     

表达犬瘟热H基因重组伪狂犬病毒的构建及生物学特性研究

[目的]构建表达犬瘟热Onderstepoort株H蛋白的重组伪狂犬病毒,并研究其生物学特性。[方法]通过RT-PCR方法获得On-derstepoort株H基因,插入pcDNA3.1（＋）建立好完整的真核细胞表达盒并将此表达盒亚克隆到转移载体p8AA上。在此基础上再将报告基因LacZ的表达盒插入转移载体,命名为p8AAZH。将p8AAZH与伪狂犬病毒（PRV）Bartha-K61株基因组共转染至BHK-21细胞中进行基因重组包装出毒,待细胞病变后收集病毒液。通过蓝色蚀斑筛选、PCR、电镜观察以及Western blot,筛选纯化重组病毒并鉴定目的基因的表达。同时在BHK-21细胞上测定重组病毒的生长曲线。[结果]获得了表达H蛋白的重组伪狂犬病毒,重组病毒与亲本Bartha-K61株的生长曲线、病变特征相一致。[结论]成功构建了表达犬瘟热Onderstepoort株H蛋白的重组伪狂犬病毒,H基因的插入不影响重组病毒的增殖特性,为犬瘟热活病毒载体疫苗的研制与开发打下了基础。     

犬瘟热病毒分离技术研究进展

由犬瘟热病毒感染引发的犬瘟热是多种动物共患的重要传染疾病。病毒分离技术是对该疾病诊断和病原研究方面的必要手段和基础。目前,多种不同动物来源的原代细胞、传代细胞及稳定表达犬瘟热病毒受体——信号淋巴细胞激活因子的细胞系在犬瘟热病毒分离研究中均得到广泛应用。综述当前犬瘟热病毒分离技术的研究进展,并对不同分离方法优缺点进行比较分析。     

犬瘟热病毒的分离与鉴定

[目的]分离与鉴定犬瘟热病毒(CDV)的石河子流行株。[方法]对临床症状疑似犬瘟热和血清学(ELISA)检测为阳性的自然发病犬,取其淋巴结为病料,接种于非洲绿猴肾细胞系(Vero),进行病毒的分离;用RT-PCR检测感染CDV分离株特异性核酸。[结果]病料接种Vero细胞产生明显的细胞病变(CPE),用RT-PCR技术可扩增出CDV特异性核酸,扩增出的基因片段与预期设计的长度相同,所扩增的CDV分离株H基因片段与CDV C54标准强毒株核苷酸同源性为98.4%。[结论]该研究成功分离并鉴定了CDV石河子流行株,为犬瘟热(CD)的确诊提供了依据。     

犬瘟热病毒研究进展

从犬瘟热病毒的生物学特性、主要基因组及结构肽、在细胞上的繁殖、检测方法、免疫及防治研究进展方面进行了综述,并在此基础上对今后的研究方向进行了探讨.     

一株貉源犬瘟热病毒核衣壳蛋白的原核表达

根据GenBank中犬瘟热病毒(CDV)核衣壳蛋白(N)基因的核苷酸序列设计合成1对引物,经RT-PCR从病毒总RNA中扩增出约1600bp的片段,将此片段克隆于pMD18-Tsimple载体。经测序分析表明,与其它毒株N基因序列的同源性很高。再将其定向克隆于原核表达载体pPROEXTMHTa中,转化感受态E.coli BL21细胞,经IPTG诱导表达分子量约63Ku的重组N蛋白。     

犬瘟热病毒水貂株的分离与鉴定

从疑似犬瘟热病死水貂的肝脏中分离出1株病毒,并进行了系统的鉴定。结果表明:该毒株接种于Vero传代细胞后,出现了典型而有规律的病变;其病毒理化特性与犬瘟热病毒相同;致细胞病变作用可被兔抗CDV阳性血清阻断;间接免疫荧光试验表明接种病毒的BHK-21细胞出现特异性的亮绿色荧光,而正常细胞则未见绿色荧光;对提取接种病料后的Vero细胞培养物中的总RNA进行RT-PCR扩增,得到了324bp和1053bp的目的片段,证明该毒株为CDV。     

犬瘟热病毒F蛋白单克隆抗体的制备及鉴定

[目的]获得犬瘟热病毒F蛋白特异性单克隆抗体。[方法]用纯化的大肠杆菌BL21表达的犬瘟热病毒重组F蛋白作为抗原,免疫BALB/c小鼠,采用传统的杂交瘤技术制备单克隆抗体。用ELISAI、FA、Western-blot、细胞中和试验鉴定各株单抗的生物学特性。[结果]获得7株稳定分泌犬瘟热F蛋白单克隆抗体的杂交瘤细胞株(2D6,3E10,3A2,5B7,5F6,6H8,9B6);单抗亚类鉴定结果分别为IgG2a,IgG1,IgG2b,IgG1,IgG1,IgG2a和IgG1;细胞中和试验初步证实2株单抗(5B7,9B6)具有中和犬瘟热病毒感染Vero细胞的作用,中和效价分别为1∶320和1∶640;经ELISA相加试验证实7株单抗的作用位点不同,其中2D6,5F6的作用位点非常相近。[结论]该研究成功制备了7株抗犬瘟热F蛋白特异性单抗,为进一步研究犬瘟热病毒F蛋白和临床诊断打下良好的基础。