利用a凝集素在酿酒酵母表面展示CALB及工业化培养基发酵条件优化

[目的]探索南极假丝酵母脂肪酶B更加经济、简便的固定化方法。[方法]根据南极假丝酵母脂肪酶B的成熟多肽序列,人工合成calb基因。将其克隆到质粒pYD1中的AGA2基因下游,获得的重组质粒pYD1-CALB,转化S.cerevisiaeEBY100菌株,并利用酿酒酵母工业化培养基发酵。[结果]成功构建表面展示CALB的酵母工程菌株;重组菌株连续传代10次表达酶活力基本保持不变,具有良好的遗传学稳定性;经工业化培养基发酵优化后,25℃发酵48 h,CALB水解活力可达4.25 U/ml,冻干粉活力可达147.82 U/g干细胞。[结论]利用酿酒酵母表面展示系统固定化南极假丝酵母脂肪酶B具有可行性,且工业化培养基的使用降低了发酵成本。     

糖化酵母糖化酶基因在酿酒酵母中的克隆与表达

[目的]使酿酒酵母高效表达糖化酵母糖化酶基因.[方法]利用PCR技术从糖化酵母中扩增出大小为2700 bp左右的带有启动子的糖化酶基因STA1.通过限制性内切酶BspDI与Acc65I双酶切,将目的基因STA1连接到穿梭质粒pRS416中构建重组质粒pRS416-sta1,转化酿酒酵母通过筛选.[结果]糖化酶活性最高为120 U/ml,酶的最适温度为60℃,最适pH为5.0,在酶催化反应2h后,酶剩余活力能达到约90％.[结论]通过基因工程手段得到高效表达糖化酶基因的酿酒酵母工程菌株.     

源于Paecilomyces sp. FLH30内切β-1,3(4)葡聚糖酶基因在毕赤酵母中的表达

[目的]β-1,3(4)-葡聚糖酶是一种重要的工业用酶,广泛地应用于饲料业、酿造业及纺织业.[方法]以来源于Paecilomyces sp.FLH30的葡聚糖酶基因为研究对象.据毕赤酵母GS115对密码子的简并性和偏爱性,对来源于淡紫拟青霉(Paecilomyces lilacinus)β-1,3(4)-葡聚糖酶基因进行了优化,通过全基因技术合成了全长基因GLUnm并构建重组酵母表达载体pPIC9K-GLUnm,用SacI线性化重组质粒pHC9K-GLUnn,电击转化至毕赤酵母GS115中进行表达.[结果]通过表型筛选,遗传霉素抗性筛选,经PCR鉴定表明,葡聚糖酶基因整合至酵母染色体DNA中.在试管中经甲醇诱导表达,并测定葡聚糖酶酶活性.在试管水平表达的酶活性是0.68 IU/mL,即可以认为在摇瓶表达水平的初始酶活性为0.68 IU/mL,将此菌株在摇瓶水平表达,酶活性在表达84h为最高,是11.26 IU/mL.[结论]重组β-1,3(4)-葡聚糖酶的最适pH为5.0,最适反应温度为50℃,在pH 5.0 ～8.0,温度37～50℃的条件下较稳定.     

热纤梭菌内切β-1,4-葡聚糖酶的克隆与表达

将来源于热纤梭菌(Clostridium thermocellum)A TCC 27405的编码内切β-1,4-葡聚糖酶的结构基因(eelD)与热激表达载体pHsh连接,得到重组表达载体pHsh-celD,并将重组表达载体pHsh-celD转入到大肠杆菌Eseheriehia eoli BL21-CodonPlus(DE3)-RIL中.结果表明,该重组酶的分子质量为66 ku,与预期大小相符.基于表达载体pHsh的重组表达系统具有诱导表达简便、诱导方式廉价的优点,且重组酶热稳定性非常好,对该酶的大规模发酵应用具有重要意义.     

密码子优化烟曲霉壳聚糖内切酶基因在毕赤酵母中的高效表达

[目的]烟曲霉(Aspergillus fumigatus)壳聚糖内切酶基因(Chitosanase,EC.3.2.1.132)(csn)的高效表达研究。[方法]根据毕赤酵母密码子的偏爱性对壳聚糖内切酶的基因进行了优化,利用连续延伸PCR方法扩增全长csn基因,构建重组质粒pPIC9k-csn,将重组质粒pPIC9k-csn线性化后转化毕赤酵母GS115,分析重组蛋白的表达,测定其酶活性,并对其酶解产物成分进行分析。[结果]实现了密码子优化后的壳聚糖内切酶的高效表达,重组菌株比野生菌株所产的壳聚糖内切酶活性提高了近20倍。[结论]该研究成功实现了烟曲霉壳聚糖内切酶基因在毕赤酵母中的高效表达,为工业化大规模生产壳聚糖酶奠定了基础。     

热纤维素梭菌内切葡聚糖苷酶基因在枯草芽孢杆菌的表达

对热纤维素梭菌Clostridium thermocellum内切葡聚糖苷酶基因CelG及其信号肽序列进行了克隆及表达研究.以热纤维素梭菌总DNA为模板,经PCR扩增获得目的,并连接到大肠杆菌-枯草杆菌穿梭质粒pSW1载体,获得质粒pSW1-CelG;用感受态转化法将获得质粒pSW1-CelG转化到枯草芽孢杆菌BGSC中进行分泌表达,获得了大小约56KD的蛋白片段,且具有生物活性,证明CelG基因克隆成功并正确表达.     

Brazzein基因的合成及pGAPZαA-Bra表达载体的构建

[目的]为Brazzein基因在酵母SMD1168中转化和表达奠定基础。[方法]利用重叠延伸PCR(SOE-PCR)合成Brazzein基因,将其连接到pMD18-T载体上,构建克隆载体pMD18-T-Bra。分别用XhoI和XbaI限制内切酶对克隆质粒pMD18-T-Bra和酵母表达载体pGAPZαA进行酶切,并在T4DNA连接酶作用下,将回收的目的基因连接到pGAPZαA载体上,构建重组质粒pGAPZαA-Bra。[结果]通过PCR扩增获得了约188 bp的Brazzein类似物的编码序列,将其克隆到pMD18-T质粒,用XhoI和XbaI双酶切后,连接到pGAPZαA载体,成功构建了重组表达载体pGAPZαA-Bra。Brazzein基因其中各碱基未发生突变,整个表达载体阅读框正确无误。[结论]利用基因工程的方法生产Brazzein是可行的。     

玉米ZmPsaH基因真核表达载体的构建及转化

[目的]PsaH是光合系统Ⅰ(PSI)中的一个亚基,在植物光合系统中起着重要的作用.为研究玉米ZmPsaH基因在抗逆中的作用提供基础.[方法]构建玉米ZmPsaH基因真核表达载体是了解玉米中该基因功能的重要途径之一.利用RT-PCR技术扩增得到大小约为420 bp的玉米ZmPsaH基因,经限制性内切酶SalⅠ和NotⅠ进行消化,将目的基因与真核表达质粒pREP-5N连接,获得重组真核表达质粒ZmPsaH-5N.[结果]通过菌落PCR、双酶切及测序等方法进行鉴定,重组真核表达质粒ZmPsaH-5N构建成功.制备酵母感受态,将重组质粒电击转入酵母中,酵母菌落PCR结果显示电击转化成功.[结论]成功构建了玉米ZmPsaH基因真核表达载体,并且成功转化了酵母.     

玉米ZmCPK12基因真核表达载体的构建及转化

[目的]CDPK是一类依赖于Ca2+而不依赖CaM及磷脂的蛋白激酶,或类钙调素结构域的蛋白激酶,是植物和低等动物所特有.研究为玉米CDPK基因家族在抗逆中的作用提供基础.[方法]构建玉米ZmCPK12基因真核表达载体是了解玉米中该基因功能的重要途径之一.实验利用RT - PCR技术扩增得到大小为1 533 bp的玉米ZmCPK12基因,经限制性内切酶SalI和NotI进行消化,将目的基因与真核表达质粒pREP -5N连接,获得重组真核表达质粒ZmCPK12 - 5N.[结果]通过菌落PCR、双酶切及测序等方法进行鉴定,重组真核表达质粒ZmCPK12-5N构建成功.制备酵母感受态,将重组质粒电击转人酵母中,酵母菌落PCR结果显示电击转化成功.[结论]成功构建了玉米mCPK12基因真核表达载体,并且成功转化了酵母.     

黄芩中FNSII-1与CHS-2真核表达载体的构建

[目的]FNSII-1与CHS-2分别是黄芩叶与根中合成黄芩活性物质通路中的关键酶基因,本试验拟通过构建FNSII-1和CHS-2与载体pYES-dest52的重组质粒,进行酵母真核表达,为探索黄芩活性物质体外大规模合成途径奠定基础。[方法]通过设计特异性引物,RT-PCR扩增目的基因,利用Gateway重组技术将目的基因FNSII-1和CHS-2整合至目的载体pYES-dest52上得到重组质粒,随后将其转到酿酒酵母INVSc1菌株中,通过SDS-PAGE检测分析并确定酵母蛋白表达最佳条件。[结果]经RT-PCR扩增得到的目的基因FNSII-1与CHS-2,其片段长度分别为1 491bp、1 205bp,与理论值相符。重组质粒经测序与比对,2个基因与其相应NCBI数据库的信息相似性分别为94.18%和91.77%。酵母菌株在5种不同OD600值下蛋白均能稳定表达。[结论]本研究成功构建了pYES-dest52-FNSII-1和pYES-dest 52-CHS-2重组载体和FNSII-1和CHS-2蛋白表达体系,为黄芩中活性物质的体外合成奠定基础。     

嗜热梭菌内切纤维素酶的表达及其酶特性研究

通过PCR克隆了嗜热梭菌内切纤维素酶基因,该基因ORF为1 947 bp,经Blast分析,该序列与嗜热梭菌同源性最高(93%),构建了内切纤维素酶大肠杆菌基因工程菌. SDS-PAGE电泳结果表明,在分子量77 000左右有表达蛋白条带,该工程菌最适酶活性为90 U/ml,是出发菌的2.8倍,最适温度在60 ℃左右,最适pH为8.     

苏云金芽孢杆菌几丁质酶基因chiA在枯草芽孢杆菌中的分泌表达

[目的]研究来源于苏云金芽孢杆菌的几丁质酶基因chiA在枯草芽孢杆菌中的表达情况。[方法]以苏云金芽孢杆菌染色体DNA为模板,PCR扩增获取几丁质酶基因chiA,将其与枯草芽孢杆菌表达载体pHSG连接,构建重组菌,经IPTG诱导后,检测培养液中的几丁质酶活性。[结果]扩增得到几丁质酶基因chiA大小为2.5 kb。构建的重组菌对底物[4-MU-(GlcNAc)3]显示出一定的水解活性,培养液酶活约为2.8 U/ml,而pHSG空质粒转化子在同样条件下其培养液没有明显酶活。该重组酶的最适pH值为6.5,最适反应温度为50℃,与苏云金芽孢杆菌自身产生的几丁质酶性质一致。[结论]几丁质酶基因chiA能在枯草芽孢杆菌中成功表达,表达产物可成功分泌到细胞外。     

内切葡聚糖酶基因在穿梭载体中的表达研究

将无信号肽编码序列的内切葡聚糖酶基因(GenBankNo.DQ782954)与表达载体PMK4连接后转化大肠杆菌DH5α,筛选出阳性转化子DH5α-PMK4-egls,并将提取的质粒转化到枯草芽孢杆菌WB600原生质体内,获工程菌WB600-PMK4-egls。同时,通过刚果红染色和SDS-PAGE分析表明,该基因在枯草芽孢杆菌中得到了表达。通过优化培养基因工程菌,胞外上清液中的酶活力达998U,该酶促反应的最适温度为60℃,最适pH为6.0,且pH在4.5～7.5,温度在30℃～65℃范围内,可保持最高酶活的70%以上。     

水稻SGR酵母双杂交诱饵载体的构建及鉴定

[目的]揭示SGR基因的作用机理。[方法]构建水稻SGR基因在酵母双杂交体系中的诱饵载体,并对其表达进行鉴定,将目的基因SGR与诱饵质粒载体pGBKT7通过双酶切定向重组构建诱饵质粒pGBKT7-SGR,将pGBKT7-SGR转入酵母菌株Y187中,利用Western印迹法检测其在酵母中的表达,通过缺陷性培养基培养进行自激活检测。[结果]将鉴定正确的重组质粒测序结果与SGR基因比较,序列完全一致,阅读框分析正确。载体pGBKT7-SGR在酵母菌株Y187中可以正确表达出融合蛋白。重组诱饵pGBKT7-SGR质粒对酵母无毒性,其表达产物不能激活酵母菌株Y187的营养缺陷型报告基因。[结论]该重组诱饵质粒可用于酵母双杂交体系,该研究为从cDNA文库筛选水稻诱饵蛋白SGR的互作蛋白奠定了基础。     

耐热纤维素酶基因工程菌发酵条件优化

[目的]为耐热纤维素酶基因工程菌的规模化生产奠定基础。[方法]采用正交试验对内切纤维素酶重组菌的发酵条件进行优化,测定菌体生长的生物量、内切纤维素酶活性。[结果]结果表明,重组菌的最佳发酵条件为:添加10.0 g/L麸皮、10.0 g/L硫酸铵、10.0 g/L玉米浆、1.5 g/L碳酸钙,产酶量达69.42 U/ml。在重组菌产酶期添加20 g/L的乳糖时单位发酵液中的酶活性最高,是未优化前产酶量的2.1倍。[结论]研究耐热纤维素具有重要的实用价值。     

一种来源于Bispora betulina的酸性木聚糖酶基因克隆及其酶学性质研究

利用简并PCR和TAIL-PCR技术从嗜酸性真菌Bispora betulina中克隆得到一个酸性木聚糖酶基因xyn11BB。该基因全长1 207 bp,含有三段内含子、一段外显子和一个终止密码子,编码由297个氨基酸组成的蛋白质,推测蛋白质含有一个CBM1结构域。将不带原基因信号肽编码序列的cDNA基因以正确阅读框架克隆到表达载体pPIC9上,并在毕赤酵母(Pichia pastoris)GS115中诱导表达,其表达活性达121.15 U/mL。重组蛋白经硫酸铵分级沉淀和阴离子交换柱纯化后达到电泳纯。对其酶学性质分析表明,重组木聚糖酶最适温度为50℃,最适pH为4.5,在酸性条件下具有良好的活性和稳定性,可作为饲料用酶的备选。     

rhtB基因过表达苏氨酸工程菌发酵过程的优化控制(英文)

[目的]构建了负责运输苏氨酸至胞外的转运蛋白的关键基因rhtB过表达的苏氨酸发酵菌M122,考察不同的碳源、氮源及pH对该重组菌产L-苏氨酸的影响。[方法]选用不同的碳、氮源对L-苏氨酸生产菌株的发酵过程进行分析,对发酵培养基的碳、氮源及pH进行优化。[结果]定向改造后苏氨酸发酵菌对营养物质的利用效率增加,使用蔗糖作为碳源发酵时,摇床培养L-苏氨酸产量为28.1g/L;以(NH4)2SO4或酵母粉作为氮源发酵时,L-苏氨酸产量分别为27.8和28.2g/L,均优于使用其他氮源时苏氨酸的产量。对发酵的最适pH研究表明,中性条件下更有利于菌体的生长和L-苏氨酸的产生。[结论]确定了苏氨酸发酵菌M122的最佳碳源为蔗糖,最佳氮源为(NH4)2SO4或酵母粉,最适pH为7.0。     

鸟传染性支气管炎病毒类木瓜蛋白酶基因的克隆和表达

[目的]为探究鸟传染性支气管炎病毒(IBV)的感染和复制过程及其防治提供信息和途径。[方法]以鸟IBV的cDNA为模板,利用PCR技术克隆IBV类木瓜蛋白酶基因。将回收片段与pGEX-6p-1载体连接并转入大肠杆菌DH5α中。在IPTG诱导下将克隆的重组质粒在大肠杆菌BL21中进行表达,经纯化获得目标蛋白。[结果]克隆的类木瓜蛋白酶基因全长为924 bp,编码308个氨基酸的完整开放读码框。它与Genbank中IBV M41毒株类木瓜蛋白酶基因的序列完全一致,证实该基因为IBV的类木瓜蛋白酶基因。在IPTG诱导下,BL21菌株成功表达目标基因和GST融合蛋白,融合蛋白约为60 kD。经纯化和酶切后所得蛋白产物的分子量约为34 kD。[结论]该基因的成功克隆和表达为有关蛋白结构与功能的研究奠定了基础。