贵州白山羊MyoG基因启动子区序列克隆及生物信息学分析

【目的】本研究旨在解析肌细胞生成素(MyoG)基因启动子区序列的结构特性及其转录调控机制。【方法】以贵州白山羊血液基因组DNA为模板,设计2对引物,采用PCR扩增、Sanger测序技术获得MyoG基因启动子区序列,通过DNAStar和Mega 5.0软件分别进行不同物种MyoG基因启动子区序列相似性比对及系统进化树构建,利用生物信息学软件预测分析该序列核心启动子区、转录因子结合位点、顺式作用元件、CpG岛等结构特征。【结果】贵州白山羊MyoG基因启动子区序列长2 334 bp,包括2 092 bp的5′-侧翼序列和242 bp的外显子1,GC含量略低于AT含量。通过不同物种比对分析,贵州白山羊MyoG基因启动子区序列与绵羊、牛、猪、人、小鼠和鸡同源序列相似性分别为98.34%、96.15%、77.76%、74.15%、57.63%和43.04%。系统进化树结果表明,贵州白山羊与绵羊和牛的亲缘关系较近,与鸡的亲缘关系最远。生物信息学结构预测发现,贵州白山羊MyoG基因转录起始位点位于翻译起始密码子ATG上游50 bp, 5′-侧翼区存在1个潜在的启动子区域和1个CpG岛,含有1个TATA...     

鸡内皮素3(EDN3)基因启动子区序列生物信息学分析

为解析鸡内皮素3(EDN3)基因启动子区序列的结构特征及其转录调控机制，本研究基于NCBI数据库中鸡EDN3基因5′侧翼区与外显子1共计2 052 bp核苷酸序列，利用不同在线软件对其核心启动子区域、顺式作用元件、转录因子结合位点及CpG岛等结构进行生物信息学预测分析，并通过DNASTAR Lasergene 17.3和MEGA 5.0软件进行不同物种EDN3基因启动子区序列相似性比对及系统进化树构建。结果表明：鸡EDN3基因起始密码子上游592～2 000 bp为可能的候选核心启动子区；5′侧翼区633 bp和1 547 bp存在2个潜在的转录起始位点T和A;该基因启动子区存在2个CAAT-box、3个GC-box、6个TATA-box、9个E-box和3个CpG岛结构域。综合多种在线软件预测，鸡EDN3基因启动子区存在Sp1、C/EBPα和NF-1等转录因子结合位点。鸡EDN3基因启动子区序列与环颈雉、鹌鹑、岩雷鸟、棕硬尾鸭、凤头潜鸭、山羊、绵羊、牛、猪和人的相似性为38.8%～90.3%;系统进化树表明，鸡与鹌鹑亲缘关系最近，与猪亲缘关系最远。研究结果为进一步探明鸡色素沉积关联E...     

猪肌分化因子1基因启动子区多态性及生物信息学研究

为揭示猪肌分化因子(myogenic differentiation 1,MyoD1)基因启动子区多态性,本试验分别以野猪×从江香猪二元杂交猪、杜×长×大外三元杂交猪及贵州宗地花猪为研究对象,采用DNA池和直接测序技术,筛选MyoD1基因5'UTR及部分第1外显子区SNP位点,利用生物信息学软件预测SNP位点对核心启动子区、CpG岛和转录因子结合位点的影响。结果表明,在MyoD1基因5'UTR及部分第1外显子区筛查到3个SNPs位点,分别为A-39G、T+150C和C+227G;生物信息学软件预测发现,A-39G位点附近出现重要转录因子结合位点消失和新位点生成;CpGIslandsearcher软件分析得到多态位点突变前后CpG岛大小及GC含量发生改变,据此推测猪MyoD1基因5'UTR区域的A-39G位点对调控启动子功能元件有重要影响。     

大白猪MYOD1、AKT3基因启动子区多态性及生物信息学分析

为探究MYOD1和AKT3基因启动子区的多态性及其可能存在的影响基因表达的分子调控机制,试验采用PCR直接测序的方法对大白猪MYOD1和AKT3基因启动子区的多态性进行检测,同时利用生物信息学分析方法预测了大白猪MYOD1和AKT3基因的核心启动子区、CpG岛和转录因子结合域。结果显示,MYOD1基因共预测到5个核心启动子区、1个CpG岛区域和10个转录因子结合域,且第5个核心启动子区位于CpG岛区域内;AKT3基因共预测到6个核心启动子区,未发现CpG岛的存在。通过直接测序的方法检测到MYOD1基因在G-361T处存在1个SNP突变,但在本试验群体中只发现1种基因型,同时该突变位点位于第1个核心启动子区内;AKT3基因在启动子区T-1709C处存在1个SNP突变,包括TT、TC和CC 3种基因型,其中TT基因型为优势基因型,T为优势等位基因。遗传多态性分析提示,该突变位点多态信息含量(PIC)介于0.25～0.5之间,表现为中度多态。本研究初步探究了大白猪MYOD1和AKT3基因启动子区的多态性并预测了启动子区可能的调控因子和调控元件,为进一步研究MYOD1、AKT3基因对肌肉生长发育的调控机制及将突变位点作为遗传标记用于分子选育提供指导和依据。     

牦牛FKBP6基因启动子区克隆、鉴定与分析

本研究旨在了解牦牛FKBP6基因5′调控区和启动子区特征,为探讨牦牛和犏牛睾丸组织中FKBP6基因差异表达机制提供依据。利用克隆测序获得牦牛FKBP6基因5′调控区序列,采用生物信息学方法分析其序列特征;采用双荧光素酶报告基因系统鉴定牦牛FKBP6基因核心启动子区,利用生物信息学软件预测与精子发生有关的转录因子结合位点。通过克隆测序和序列拼接获得了1 354bp的牦牛FKBP6基因5′调控区序列,与普通牛的一致性为99.71%;牦牛FKBP6基因5′调控区序列含有潜在的启动子区、典型的CAAT-Box和CpG岛,但未见TATA-Box;荧光素酶活性分析发现,牦牛FKBP6基因的核心启动子区位于5′调控区的-263~-167nt区域,含有CAAT-Box、E-Box、CTCF和CREB等与精子发生相关的转录因子结合位点。牦牛FKBP6基因核心启动子的鉴定和精子发生相关转录因子结合位点的发现为进一步研究牦牛睾丸组织中FKBP6基因的表达调控奠定了基础。     

贵州黑山羊细胞因子诱导的SH2包含蛋白基因5′调控区SNP研究

本试验为改善贵州本地优良品种贵州黑山羊生长性能,寻找生长相关基因细胞因子诱导的SH2（Src-homology 2）包含蛋白(cytokine inducible SH2-containing protein, CISH)启动子区多态性位点,并研究其对启动子功能元件的影响。将贵州本地优良品种贵州黑山羊构建DNA池,直接测序筛选SNP位点,生物信息学软件预测核心启动子区域、转录因子、CpG岛。结果发现,CISH基因5′调控区存在1个SNP位点为G-95C,得到CISH基因核心启动子区和CpG岛,SNP位点导致附近转录因子新位点产生和原来结合位点消失,但并不改变CpG岛大小。CISH基因5′调控区存在1个对启动子功能元件有较大影响的SNP位点,研究结果为进一步确定CISH基因启动子功能奠定基础。     

鸡NLRC5基因启动子多态性分析

为了研究NLRC5基因启动子区的SNP及其对启动子功能元件的影响,采用目标捕获测序和PCR产物直接测序的方法对27个鸡品种和2种细胞的NLRC5基因启动子区进行SNP检测,总共检测到37个SNP位点,其中斗鸡未发现SNP存在,SNP9存在于除斗鸡以外的其他鸡种和细胞。生物信息学软件预测得到NLRC5基因启动子区转录因子结合位点和CpG岛,SNP位点对转录因子结合位点和CpG岛大小均有影响,表明NLRC5启动子区SNP可能通过不同方式影响基因表达调控。     

猪SelS基因启动子区的克隆及序列分析

本研究旨在克隆和分析猪硒蛋白S基因(Selenoprotein S,SelS)启动子序列,并初步探讨潜在转录因子结合位点对其表达的影响.通过SON-PCR技术克隆猪SelS基因启动子序列,利用PromoterScan、Promoter 2.0等在线工具预测其启动子特征,利用细菌脂多糖(Lipopolysaccharides,LPS)刺激PK15细胞,研究NF-kappaB转录因子对猪SelS基因启动子活性的影响.试验获得了猪SelS基因约3kd的启动子序列,部分序列比对发现猪、人、牛和小鼠物种间相似性仅7%～51%.预测猪SelS基因转录起始位点在-398 bp,猪和人SelS基因启动子存在系列保守的转录因子结合位点,包括NF-kappaB、CCAAT box、SP1、USF等,但均未发现典型的TATA box.细胞试验表明,NF-kappaB转录因子可以上调猪SelS基因的表达.结果提示,物种间SelS基因启动子相似性较低,但猪和人SelS基因的转录因子非常保守,LPS诱导试验提示,猪SelS基因表达可能受NF-kappaB转录因子的调控.     

贵州地方山羊BMPR-ⅠB基因启动子区多态性及生物信息学分析

为探究骨形态发生蛋白受体ⅠB(bone morphogenetic protein receptorⅠB,BMPR-ⅠB)基因启动子区多态性及其与繁殖性状的相关性,本试验以贵州3个地方山羊品种(黔北麻羊、贵州黑山羊及贵州白山羊)为研究对象,通过构建混合DNA池PCR产物直接测序技术筛选SNPs位点,并采用多种生物信息学软件预测SNPs位点对核心启动子区、CpG岛和转录因子结合位点的影响。结果显示,BMPR-ⅠB基因启动子区存在4个SNPs位点:g.29893005 TC、g.29893016 CT、g.29893729 CG和g.29894370 CT。生物信息学软件预测得到BMPR-ⅠB基因核心启动子区和CpG岛,SNPs位点导致转录因子结合位点发生改变,g.29893005 TC和g.29893016 CT突变使原来的转录因子结合位点Sp1消失;g.29893729 CG突变使原来转录因子结合位点AP-1消失,从而产生新的转录因子结合位点USF;g.29894370 CT突变产生新的转录因子结合位点C/EBPalp,使原来的转录因子结合位点Sp1改变为C/EBPalp和Sp1。由此推测,SNPs位点对调控启动子功能元件可能存在重要影响。     

牛α-乳清蛋白基因5'调控区多态性研究

试验选择品种差异较大的贵州荷斯坦奶牛和务川黑牛构建不同DNA池,设计1对引物分别扩增2个牛种α-乳清蛋白(alpha-lactalbumin, LALBA)基因5'调控区及第1外显子部分序列总长1126 bp。结果表明,LALBA基因5'调控区存在5个SNPs位点:T-114C、C-166T、A-225C、C-344T、T-778C,T-114C仅在务川黑牛表现多态性。生物信息学软件预测LALBA基因核心启动子区及转录因子结合位点,SNP位点导致11个转录因子结合位点消失,其中1个位于核心启动子区,产生5个新的转录因子结合位点。突变前后RNA二级结构发生明显改变,目标序列未发现CpG岛。     

大白猪MYOD1、AKT3基因启动子区多态性及生物信息学分析

为探究MYOD1和AKT3基因启动子区的多态性及其可能存在的影响基因表达的分子调控机制，试验采用PCR直接测序的方法对大白猪MYOD1和AKT3基因启动子区的多态性进行检测，同时利用生物信息学分析方法预测了大白猪MYOD1和AKT3基因的核心启动子区、CpG岛和转录因子结合域。结果显示，MYOD1基因共预测到5个核心启动子区、1个CpG岛区域和10个转录因子结合域，且第5个核心启动子区位于CpG岛区域内；AKT3基因共预测到6个核心启动子区，未发现CpG岛的存在。通过直接测序的方法检测到MYOD1基因在G-361T处存在1个SNP突变，但在本试验群体中只发现1种基因型，同时该突变位点位于第1个核心启动子区内；AKT3基因在启动子区T-1709C处存在1个SNP突变，包括TT、TC和CC 3种基因型，其中TT基因型为优势基因型，T为优势等位基因。遗传多态性分析提示，该突变位点多态信息含量（PIC）介于0.25~0.5之间，表现为中度多态。本研究初步探究了大白猪MYOD1和AKT3基因启动子区的多态性并预测了启动子区可能的调控因子和调控元件，为进一步研究MYOD1、AKT3基因对肌肉生长发育的调控机制及将突变位点作为遗传标记用于分子选育提供指导和依据。     

秦川牛PLAG1基因启动子克隆及转录因子预测

【目的】探究秦川牛多形性腺瘤基因1(pleomorphic adenoma gene 1,PLAG1)的组织表达规律,并克隆其启动子区序列,预测分析其关键转录因子结合位点,为探究其转录调控机制提供理论参考。【方法】采集3头20月龄秦川牛成年公牛心脏、肝脏、脾脏、肺脏、肾脏、皮下脂肪、背最长肌、瘤胃组织,用实时荧光定量PCR方法检测PLAG1基因在不同组织中的相对表达量,同时克隆PLAG1基因上游启动子区序列,利用生物信息学软件预测PLAG1基因转录起始位点及启动子核心区域,分析、筛选核心启动子区域的关键转录因子结合位点。【结果】PLAG1基因在秦川牛各组织中均有表达,且在背最长肌中的表达量显著高于其他组织(P<0.05)。PLAG1基因启动子序列全长1 861 bp,生物信息学预测分析发现PLAG1基因核心启动子区位于-297―+42 bp,存在高度保守的Krüppel样因子5(KLF5)、cAMP反应元件结合蛋白1(CREB1)和早期生长反应因子1(EGR1)转录因子结合位点,且CpG岛位于PLAG1基因核心启动子区域内。【结论】PLAG1基因在肌肉组织中高表达,其核心启动子区...     

贵州地方山羊BMPR-ⅠB基因启动子区多态性及生物信息学分析

为探究骨形态发生蛋白受体ⅠB（bone morphogenetic protein receptor ⅠB，BMPR-ⅠB）基因启动子区多态性及其与繁殖性状的相关性，本试验以贵州3个地方山羊品种（黔北麻羊、贵州黑山羊及贵州白山羊）为研究对象，通过构建混合DNA池PCR产物直接测序技术筛选SNPs位点，并采用多种生物信息学软件预测SNPs位点对核心启动子区、CpG岛和转录因子结合位点的影响。结果显示，BMPR-ⅠB基因启动子区存在4个SNPs位点：g.29893005 T > C、g.29893016 C > T、g.29893729 C > G和g.29894370 C > T。生物信息学软件预测得到BMPR-ⅠB基因核心启动子区和CpG岛，SNPs位点导致转录因子结合位点发生改变，g.29893005 T > C和g.29893016 C > T突变使原来的转录因子结合位点Sp1消失；g.29893729 C > G突变使原来转录因子结合位点AP-1消失，从而产生新的转录因子结合位点USF；g.29894370 C > T突变产生新的转录因子结合位点C/EBPalp，使原来的转录因子结合位点Sp1改变为C/EBPalp和Sp1。由此推测，SNPs位点对调控启动子功能元件可能存在重要影响。     

3个品种猪MEF2D基因启动子多态及其生物信息学分析

研究以从江香猪、杜×长×大外三元杂交猪及贵州宗地花猪为研究对象,采用混合DNA池结合直接测序技术筛选猪MEF2D基因5'UTR及第1外显子区SNPs位点;同时利用生物信息学软件分析SNPs位点对核心启动子区、Cp G岛和转录因子结合位点的影响。结果表明:在猪MEF2D基因5'UTR区共筛查到4个SNPs位点,分别为A-511G、T-453A、T-242G和T-180A;生物信息学软件预测发现T-453A和T-242G位点附近有重要转录因子结合位点消失和新位点生成,据此推测猪MEF2D基因5'UTR区的T-453A和T-242G位点对调控启动子功能元件可能存在重要影响。     

牛GDF9基因5'侧翼区克隆及生物信息学分析

生长分化因子9(GDF9)是转化生长因子B(TGF-β)超家族的一个新成员,对哺乳动物卵泡的发育有重要的调控作用.本研究克隆了牛GDF9基因5,侧翼区1 370 bp的基因组序列,生物信息学分析表明,该区域的平均GC含量为38.5%,利用CpG岛在线预测软件CpGProD分析表明,牛GDF9基因5'侧翼区没有CpG岛;利用Promter在线工具分析发现牛GDF9基因可能存在2个启动子位点,一个在翻译起始密码子前353bp处,另一个在翻译起始密码子前683 bp处;利用TFSiteScan在线程序分析发现该区域有98个潜在的转录因子结合位点,其中包括一些真核生物启动子的核心元件.如1个TATA-bo、4个GC-box等,表明该区域是转录因子结合位点比较密集的区域.     

牛αs2酪蛋白、k酪蛋白基因启动子区多态性研究

为研究牛CSN1S2、CSN3基因启动子多态性.选择品种差异较大的贵州荷斯坦奶牛和务川黑牛构建不同DNA池,设计特异性引物分别扩增2个牛种CSN1S2、CSN3基因5’调控区及第1外显子部分序列.结果表明:CSN1S2基因5’调控区存在3个SNPs位点:A-253T、A-317G、A-407G,CSN3基因5,调控区发现4个SNPs:T-79G、G-415G、T-421C、T-658G,2个牛品种在不同位点的多态性有显著差异.生物信息学软件预测CSN1S2、CSN3基因核心启动子区及转录因子结合位点,CSN1S2基因A-253T、A-317G位于预测核心启动子区.SNP位点造成CSN3基因7个转录因子结合位点消失,而产生10个新的转录因子结合位点.对于CSN1S2、CSN3基因,突变前后RNA二级结构有明显改变,目标序列均未发现CpG岛.研究结果为进一步确定其启动子功能奠定试验基础.     

山羊腺苷单磷酸脱氨酶1基因启动子区单核苷酸多态性研究

为筛选腺苷单磷酸脱氨酶1(adenosine monophosphate deaminase 1,AMPD1)基因启动子区单核苷酸多态性(SNP)及研究其对启动子功能元件的影响,试验选择小香羊、黔北麻羊、努比山羊构建不同DNA池,直接测序结合BLAST筛选SNP位点。结果表明,AMPD1基因启动子区存在5个SNPs位点,分别为:T-614A、G-326A、G-309A、T-287C和T-165C。生物信息学软件预测得到AMPD1基因核心启动子区和转录因子结合位点,SNPs位点导致9个转录因子结合位点消失,而产生7个新的转录因子结合位点。AMPD1基因RNA二级结构在突变后显著改变,但未检测到CpG岛区域。     

牛GDF9基因5′侧翼区克隆及生物信息学分析

生长分化因子9(GDF9)是转化生长因子β(TGF-β)超家族的一个新成员,对哺乳动物卵泡的发育有重要的调控作用。本研究克隆了牛GDF9基因5′侧翼区1 370 bp的基因组序列,生物信息学分析表明,该区域的平均GC含量为38.5%,利用CpG岛在线预测软件CpGProD分析表明,牛GDF9基因5′侧翼区没有CpG岛;利用Promoter在线工具分析发现牛GDF9基因可能存在2个启动子位点,一个在翻译起始密码子前353bp处,另一个在翻译起始密码子前683 bp处;利用TFSiteScan在线程序分析发现该区域有98个潜在的转录因子结合位点,其中包括一些真核生物启动子的核心元件,如1个TATA-box、4个GC-box等,表明该区域是转录因子结合位点比较密集的区域。     

牛STAT1基因启动子区多态性研究

 为筛选STAT1基因启动子区SNP及研究其对启动子功能元件的影响。选择品种差异较大的贵州荷斯坦奶牛和务川黑牛构建不同DNA池,直接测序筛选SNP位点。结果表明：STAT1基因5&;apos;调控区及第1外显子存在3个SNPs位点,分别为：T-537G、T-508A、C+10T。生物信息学软件预测得到STAT1基因核心启动子区和转录因子结合位点,SNP位点导致1个转录因子结合位点消失,而产生10个新的转录因子结合位点。CpG岛范围未受到突变位点影响,但STAT1基因RNA二级结构在突变后显著改变。研究结果为进一步确定STAT1启动子功能奠定试验基础。     

ssc-miR-152生物信息学及对未成熟猪睾丸支持细胞功能的分析

为研究ssc-miR-152生物信息学特征及对未成熟猪睾丸支持细胞功能的影响，本研究通过NCBI数据库确定ssc-miR-152在猪基因组中的位置，通过MethPrimer和EMBOSS在线软件分析ssc-miR-152上游序列CpG岛，使用Netural Network Promoter Predictio和Promoter-2.0预测其启动子区域，结合AliBaba 2.1和AnimalTFDB3.0软件预测其转录因子结合位点；Clustal W软件分析ssc-miR-152在物种间的保守性，采用CCK-8、流式细胞术和实时荧光定量PCR技术检测细胞增殖、周期及凋亡情况，运用miRanda、EIMMO、TargetScan和PITA在线软件预测ssc-miR-152的靶基因并取交集，并对预测的靶基因进行GO功能及KEGG通路分析，最后利用Cytoscape构建TF-miRNA-mRNA互作网络。结果表明：ssc-miR-152位于猪12号染色体反义链的24 292 249～24 292 328位置，其转录起始位点在上游序列200 bp处，启动子范围为393～4 619，并在该范围内...