大连日本对虾5种流行病原体的调查

于2020年9月,采用套式PCR方法,对辽宁省大连市沙山、仙浴湾、大郑等8个地区 日本对虾血细胞虹彩病毒(SHIV)、白斑综合征病毒(WSSV)、传染性皮下及造血组织坏死病毒(IHHNV)、急性肝胰腺坏死病致病性副溶血弧菌(VPAHPND)和虾肝肠胞虫(EHP)5种病原携带情况进行检测.结果表明:WSSV和EHP阳性检...     

上海主养区凡纳滨对虾8种流行病病原监测及分析

为进一步掌握上海地区养殖凡纳滨对虾(Litopenaeus vannamei)病原的流行趋势及特点,定期对上海主养区的凡纳滨对虾开展了8种流行病病原监测及分析工作。51份样品的分子检测和细菌分离鉴定结果显示,有4种病原检测出阳性,其中虹彩病毒1(DIV1)阳性检出率为29.41%,传染性皮下及造血组织坏死病毒(IHHNV)为3.92%,致急性肝胰腺坏死病副溶血弧菌(VpAHPND)为1.96%,副溶血弧菌(Vp)为19.61%;而白斑综合征病毒(WSSV)、桃拉综合征病毒(TSV)、偷死野田村病毒(CMNV)、虾肝肠胞虫(EHP)等4种病原未检出。408项病原检测结果中,4种病原的阳性总样本数量为28份,总体阳性率为6.86%。结果表明,上海地区养殖凡纳滨对虾的病原携带率处于较低水平,DIV1、副溶血弧菌(Vp)是携带的主要病原。在实际生产中应根据病原流行特点,从苗种选购、养殖过程管理、药物选用等方面进行综合防控,减少病害发生。     

一对虾养殖场的多病原跟踪

本研究通过对一对虾养殖场定期采样,采用分子生物学鉴定方法,分别对对虾体内及水环境中弧菌(Vibrio sp.)、虾肝肠胞虫(Enterocytozoon hepatopenaei, EHP)及主要病毒性病原进行了跟踪检测,同时,检测了水环境中的氨氮及亚硝基氮含量的变化趋势。结果显示,该对虾养殖场中存在的主要病原为多种致病弧菌和EHP,未检测出对虾白斑综合征病毒(WSSV)、传染性肌肉坏死病毒(IMNV)、偷死野田村病毒(CMNV)及传染性皮下和造血组织坏死病毒(IHHNV);该养殖场中弧菌检出种类达到16种,其中,主要的弧菌种类有副溶血弧菌(Vibrio parahaemolyticus)、溶藻弧菌 (V. alginolyticus)、欧文氏弧菌(V. owensii)、创伤弧菌(V. vulnificus)、哈维氏弧菌(V. harveyi),且存在导致急性肝胰腺坏死病的副溶血弧菌(VPAHPND);养殖中期大棚养殖池水体氨氮及亚硝氮浓度分别达到(3.5±2.0)、(8.2±0.7) mg/L,显著高于室外养殖池水体氨氮及亚硝基氮浓度(P<0.05)。养殖期跟踪的7个虾池中,出现严重对虾病害的大棚养殖池比例达到100%,而室外养殖池仅出现轻度对虾病害,发病池比例为25%。根据研究结果推测,造成大棚养殖池对虾发病死亡的主要原因为养殖对虾感染弧菌及虾肝肠胞虫,同时,养殖密度大、水体氨氮及亚硝基氮浓度过高等在对虾病害发生中起到了协同作用。本研究结果可为当前对虾养殖病害防控技术提供理论支持和科学依据。     

病例研究：未知病因的凡纳滨对虾溞状幼体的病原和微生物组分析

从某对虾育苗场2个育苗池中分别采集了发生摄食下降、活力降低及死亡率增高等症状的未知疾病的凡纳滨对虾(Litopenaeus vannamei)溞状幼体3期(Z3)和1期(Z1)的样品。用PCR检测白斑综合征病毒(WSSV)、传染性皮下及造血组织坏死病病毒(IHHNV)、急性肝胰腺坏死病副溶血弧菌(VpAHPND)、桃拉综合征病毒(TSV)、传染性肌坏死病毒(IMNV)、黄头病毒(YHV)、虾肝肠胞虫(EHP)、偷死野田村病毒(CMNV)和虾血细胞虹彩病毒(SHIV)等9种已知病原为阴性。组织病理学诊断观察到肝胰腺小管上皮细胞内存在不明褐色团块。使用2216E培养基对致病菌分离鉴定,得到2株溶藻弧菌(Vibrio alginolyticus),浸浴感染悉生卤虫(Artemia franciscana)幼体后的平均存活率分别为58%和83%。采用Illumina HiSeq高通量测序方法对这2个溞状幼体样品中细菌16S rRNA基因的2个高变区(V3~V4)进行总细菌菌群的测序,分析揭示了未知病因病虾中细菌菌群的多样性和相对丰度,门水平上2个样品的优势菌群均包括变形菌门(Proteobacteria)、拟杆菌门(Bacteroidetes)和厚壁菌门(Firmicutes),但相对丰度有显著差异;在属水平上相对丰度最高的均为弧菌属(Vibrio),在2个样品中的丰度分别为74.3%和60.5%,此外,Z1样品相对高丰度(21.9%)的属为黏着杆菌属(Tenacibaculum)。育苗管理信息及上述病例分析结果提示,该疾病可能是由于在过期存放的幼体饲料质量下降所致的营养障碍情况下,有一定致病性的溶藻弧菌条件性感染所引起的疾病。     

患病南美白对虾病原的确定与药物治疗效果

2019年7月,天津市某南美白对虾(Litopenaeus vannamei)养殖池塘发生病害,其主要症状为体色微红,空肠空胃,肝胰腺萎缩。为分析病因,通过寄生虫和病毒检测、病原菌分离鉴定和药物敏感性测定等方法对患病南美白对虾及病原进行了研究。结果表明:从患病南美白对虾鳃丝中未发现大量寄生虫;传染性皮下及造血组织坏死病毒、白斑病毒、虹彩病毒和偷死野田村病毒检测结果为阴性,副溶血弧菌(Vibrio parahaemolyticus)和肝肠胞虫检测结果为阳性;肝胰腺中存在大量细菌,对优势菌落进行纯化并命名为DX-201901,根据生理生化特征和法国梅里埃细菌全自动鉴定系统将其鉴定为副溶血弧菌;菌株DX-201901对盐酸四环素、盐酸土霉素、硫酸链霉素和氟苯尼考等4种药物较为敏感,选择氟苯尼考为治疗药物,按25.0 mg/kg虾体重进行拌料投喂,每天投喂1次,连续投喂5 d,取得了较好的治疗效果。     

虾肝肠胞虫(EHP)现场快速高灵敏度检测试剂盒的性能评价研究

近年来,虾肝肠胞虫(Enterocytozoon hepatopenaei, EHP)流行使我国养殖对虾遭受严重经济损失,现场快速检测是EHP防控的重要技术保证。本研究对本实验室研发的EHP现场快速检测试剂盒的分析特异性(ASp)、分析灵敏度(ASe)、诊断特异性(DSp)、诊断灵敏度(DSe)、重复性和稳定性6项性能参数开展了系统评估。ASp测试显示,该试剂盒与对虾白斑综合征病毒(WSSV)、偷死野田村病毒(CMNV)、虾血细胞虹彩病毒(SHIV)、致急性肝胰腺坏死病副溶血弧菌(VpAHPND)、传染性皮下及造血组织坏死病毒(IHHNV)等5种对虾常见病原及健康对虾无交叉反应;ASe测试显示,该试剂盒检测下限为101 copies/反应;以EHP TaqMan RT-qPCR方法为标准,比较了试剂盒对298份临床样品的测试结果,试剂盒的DSp为99.2%、DSe为91.7%;试剂盒对EHP阴性样品及强阳性样品的检测重复率为100%,弱阳性样品检测重复率为95.8%;试剂盒在–20℃和–40℃条件下分别可保存7个月和12个月以上。本研究表明,本实验室研制的EHP现场快速检测试剂盒具操作简便、快速、灵敏度高、特异性强、重复性好和稳定性强等优点,可满足对虾养殖现场对EHP的高灵敏度检测。     

致急性肝胰腺坏死病副溶血弧菌(VpAHPND)自然感染三疣梭子蟹

近年来包括急性肝胰腺坏死病(AHPND)在内的多种新发疫病的流行,使我国甲壳类养殖业遭受了严重的经济损失。为了筛查导致山东潍坊某养殖场中一虾蟹混养池塘内患病三疣梭子蟹感染的可能病原,本研究采用分子生物学检测方法,对三疣梭子蟹样品进行了白斑综合征病毒(WSSV)、传染性皮下及造血组织坏死病毒(IHHNV)、虾血细胞虹彩病毒(SHIV)、致急性肝胰腺坏死病副溶血孤菌(Vp_(AHPND))、虾肝肠胞虫(EHP)、偷死野田村病毒(CMNV)、黄头病毒(YHV)和肝胰腺细小病毒(HPV)等8种病原的检测,并对样品进行了组织病理和原位杂交分析。分子生物学检测结果显示,患病三疣梭子蟹样品呈Vp_(AHPND)阳性,而呈现WSSV、IHHNV、SHIV、EHP、CMNV、YHV和HPV阴性。对样品进行Vp_(AHPND)套式PCR第二轮扩增产物的序列测定、比对和进化树分析,结果显示,扩增产物序列与致病副溶血弧菌质粒上pirA~(vp)毒力基因片段具有99%的同源性,该序列与已报道的多个致病副溶血弧菌PirA聚在进化树的同一主分支上。组织病理学分析显示,患病三疣梭子蟹的肝胰腺小管上皮细胞坏死,心肌纤维呈溶解样病变,鳃丝上皮柱突细胞明显坏死,胸神经节的神经细胞损伤严重,并且这些组织中还可见大量的细胞核固缩现象;原位杂交结果显示,肝胰腺、心肌、鳃组织及胸神经节中的病变部位均存在Vp_(AHPND)探针的蓝紫色杂交信号。以上表明,虾蟹混养池塘中三疣梭子蟹在自然状态下感染了Vp_(AHPND),并导致肝胰腺、心肌、鳃和胸神经节发生了严重病理损伤。本研究首次在养殖三疣梭子蟹中检测到Vp_(AHPND)感染并揭示了感染所致的病理变化,相关结果为揭示Vp_(AHPND)自然宿主种类和养殖三疣梭子蟹病害防控提供了基础信息。     

同时检测两种对虾病毒和4种弧菌的同步PCR方法的建立

通过检索、多重比对、分析和筛选GenBank中对虾白斑综合征病毒(WSSV)、传染性皮下和造血器官坏死病毒(IHHNV)、副溶血孤菌、创伤弧菌、哈维氏弧菌和溶藻胶弧菌的基因序列,设计了10对特异性引物,以已知毒株和菌株的DNA为模板进行PCR,均能扩增出与实验设计相符合的DNA片段,对PCR扩增条件进行优化,建立了可同时检测鉴别WSSV、IHHNV、副溶血弧菌、创伤弧菌、哈维氏弧菌和溶藻胶弧菌,并且能同时区分WSSV不同地理毒株的同步PCR方法.研究结果表明,该方法检测特异性好,检测通量大,适合于对虾多种病原的同时检测.     

一例日本囊对虾暴发性死亡的病原分析

为了阐明山东省潍坊市一对虾养殖场发生日本囊对虾暴发性死亡的原因,采用分子生物学检测方法,对发病对虾进行了白斑综合征病毒(white spot syndrome virus,WSSV)、桃拉综合征病毒(Taura syndrome virus,TSV)、黄头病毒(yellow head virus,YHV)、传染性皮下及造血组织坏死病毒(infectious hypodermal and hematopoietic necrosis virus,IHHNV)、传染性肌肉坏死病毒(infectious myonecrosis virus,IMNV)、偷死野田村病毒(covert mortality nodavirus,CMNV)及急性肝胰腺坏死病(acute hepatopancreatic necrosis disease,AHPND)7种病原的检测,且对发病对虾进行了常规组织病理学观察。同时采用16S r DNA细菌鉴定方法及浸泡回接感染实验对分离自发病对虾体内的可疑病原菌进行了分子鉴定及毒力测试。结果显示,发病对虾样品核酸检测呈现WSSV强阳性,IHHNV和CMNV为弱阳性,其他4种病原为阴性。组织病理学观察发现,在对虾的胃、鳃等上皮组织中存在WSSV包涵体,头部肌肉纤维出现离散。对分离编号为2901、2902、2903的3株优势可疑病原菌鉴定结果显示,3株菌分别与印度格里蒙菌、交替单胞菌及溶藻弧菌相似,相似度分别为99%、99%及100%。攻毒结果显示,3株可疑病原菌的LC50分别为9.8×107、1.1×108与2.3×108 CFU/m L,各细菌毒力均较弱,非导致对虾出现暴发性死亡的病原。研究表明,导致本次日本囊对虾暴发性死亡的病因与混合感染病原WSSV、IHHNV、CMNV有关,其中WSSV感染是造成日本囊对虾暴发性死亡的主因,研究结果可为解析当前养殖日本囊对虾疾病暴发及其成因提供参考。     

2022年滨州地区养殖对虾和海水鱼苗流行病学调查和风险评估

为了解滨州地区养殖对虾与海水鱼苗流行病学现状,掌握潜在风险,为水产养殖业健康有序发展提供科学依据,2022年,开展滨州市(无棣县、沾化区、博兴县)养殖对虾和海水鱼苗种主要病害监测,对虾苗种检测白斑综合征(WSD)、传染性皮下及造血组织坏死病毒病(IHHN)、虾肝肠胞虫病(EHP)、急性肝胰腺坏死病(AHPND)、对虾虹彩病毒病(DIV-1)、桃拉综合征(TS)、传染性肌肉坏死病(IMN);海水鱼苗种检测病毒性神经坏死病(VNN)等。本次监测了65份南美白对虾样品,分别都检测8种对虾病原,共检出5份病原阳性样品,并存在有2种甚至3种病原共感染情况。建议在对虾苗种引进、繁育、养殖过程中应进行全面的多病原监测,从源头上把好苗种质量关,保障对虾健康,促进对虾养殖业发展。     

三种对虾病毒在浙江省凡纳滨对虾中的流行性调查研究

对虾白斑综合症病毒、桃拉综合症病毒及传染性皮下与造血组织坏死病病毒是目前威胁对虾养殖业较为严重的3种病毒.分别从浙江省6个凡纳滨对虾的主养殖区随机采样对虾699尾,通过PCR检测对虾的病毒携带情况.检测结果显示,6个养殖地区传染性皮下造血组织坏死病病毒检测结果均呈阳性,总阳性率达100％;萧山、舟山、象山养殖场的对虾白斑综合症病毒检测结果有阳性,总阳性率为5.58％;6个养殖场均未检测出桃拉综合症病毒.表明浙江省凡纳滨对虾养殖区域的桃拉综合症病毒得到了有效控制,传染性皮下造血组织坏死病病毒和对虾白班综合症病毒有较高的感染率,而且存在混合感染的情况.     

FTA卡保存对虾传染性皮下和造血组织坏死病毒DNA洗脱方法的优化

传染性皮下和造血组织坏死病毒(infectious hypodermal and haematopoietic necrosis virus, IHHNV)是危害虾类健康养殖的重要病原,为寻找一种快捷保存及分离IHHNV DNA的方法,为后续研究提供完整的核酸材料,选用FTA (flinders technology associates)卡为保存介质,以FTA纯化试剂、TE (Tris-EDTA)缓冲液及去离子水为基础洗脱液,设计7种FTA卡黏附DNA洗脱方法,通过荧光定量PCR检测方法检验不同核酸洗脱分离效果及最低的点膜核酸量。结果显示,于4 mm2的FTA卡上,点样体积为2.5 μL,用洗脱液作为模板时,最低点膜核酸浓度需要1.47×104 copies/μL以上,可获得最佳的检测灵敏度和100%检出率的洗膜方法为50 μL TE缓冲液于95 ℃下浸洗5 min;用膜片做模板,点膜核酸浓度需要1.82×103 copies/μL以上,室温(20~25 ℃)条件下,用FTA纯化试剂洗脱3次,再用TE缓冲液洗脱2次,洗脱时间均为5 min,可获得最佳的检测灵敏度和100%的准确度。以FTA卡保存对虾白斑综合征病毒(white spot syndrome virus, WSSV)、虾肝肠胞虫(Enterocytozoon hepatopenaei, EHP)、虾十足目虹彩病毒1 (Decapod iridescent virus 1, DIV1)、偷死野田村病毒(covert mortality noda virus, CMNV)、致急性肝胰腺坏死副溶血弧菌(Vibrio parahaemolyticus, VpAHPND)核酸,测试所建洗脱方法的效果,证实了该方法对其他虾类病原核酸的洗脱具有通用性。该研究给出了FTA卡保存和洗脱IHHNV DNA的适用性方案,为野外对虾样品采集、病毒核酸样品跨区域传递的保存和运输条件提供了科学数据。     

十足目虹彩病毒(DIV1)环介导等温扩增(LAMP)检测方法的建立及应用

本研究以十足目虹彩病毒(Decapod iridescent virus 1, DIV1)主要衣壳蛋白基因为靶序列设计引物,建立了DIV1的环介导等温扩增(Loop-mediated isothermal amplification, LAMP)检测方法,并以pMD18-DIV1质粒标准品为模板对该方法的检测灵敏度、检测特异性等进行了评估。结果显示,此方法最适反应温度为64.4℃,优化后的25 μl反应体系中包含2.5 μl 10×Isothermal amplification buffer、4.0 mmol/L Mg2+、1.2 mmol/L dNTPs、6.4 U Bst 2.0 WarmStart® DNA聚合酶、0.8 μmol/L EvaGreen®和4.4 μl ddH2O。该方法检测灵敏度下限为3.54×102拷贝/反应;与虾肝肠胞虫(EHP)、致急性肝胰腺坏死病副溶血弧菌(VpAHPND)、对虾偷死野田村病毒(CMNV)、传染性皮下及造血组织坏死病病毒(IHHNV)、白斑综合征病毒(WSSV)、桃拉综合征病毒(TSV)和黄头病毒(YHV)等主要虾类病原没有交叉反应;具有较好的重复性和稳定性。以GeneFinder®替换EvaGreen®并将其预置于反应管内,结合上述扩增方法可实现对DIV1的现场快速高灵敏检测。本研究建立的DIV1-LAMP实时荧光定量和现场检测方法具有灵敏、特异和快速等特点,为近几年新发虾类病原DIV1的定性、定量以及现场快速检测提供了新的技术选择,有利于对虾养殖业中开展DIV1的监测、预警和防控。     

饲料添加益生菌对多病原阳性的凡纳滨对虾生长与存活的影响

采用假交替单胞菌(Pseudoalteromonas sp.) KL-3 2010和微小杆菌(Exiguobacterium sp.) KL-C2 2014作为益生菌,进行凡纳滨对虾(Litopenaeus vannamei)投喂实验,研究上述菌株对带毒对虾的生长与存活的影响。假交替单胞菌KL-3 2010对致急性肝胰腺坏死副溶血弧菌(Vibrio parahemolyticus) (VPAHPND 20130629002S01)有拮抗作用和胞外蛋白酶活性,微小杆菌KL-C2 2014有胞外蛋白酶活性。待试对虾经检测为白斑综合征病毒(WSSV)、致急性肝胰腺坏死病副溶血弧菌(VPAHPND)和虾肝肠胞虫(EHP)弱阳性。经过为期60 d的养殖实验,结果显示,与投喂普通颗粒饲料的对照组相比,投喂假交替单胞菌KL-3 2010的对虾存活率提高了213%±43% (P<0.01);投喂微小杆菌KL-C2 2014的对虾平均生长率提高了105.5%±28.1% (P<0.05);交替投喂2株菌的对虾存活率提高了184%±52% (P<0.05),平均生长率提高了70.6%±32.8%。肠道可培养优势菌研究表明,2株益生菌的投喂显著影响了对虾肠道优势菌群的种类。本研究为带毒虾苗的养殖提供一种有效的病害防控和促生长的手段。     

传染性皮下及造血组织坏死病毒致病性研究进展

传染性皮下及造血组织坏死病毒(IHHNV)是一种分布较广、危害较大的对虾病毒,已被世界动物卫生组织(OIE)列为须向其申报的甲壳类重要疫病病原。IHHNV在我国已形成了一定的流行趋势,目前仍是严重危害我国养殖虾类的重要病毒。本文从IHHNV的流行地区及危害、宿主、致病类型、对宿主不同年龄阶段的致病性差异、与白斑综合征病毒(WSSV)的干扰作用、感染机制和致病机理方面,综述了与IHHNV致病性相关的研究进展,以期为进一步深入研究IHHNV防控提供参考资料。     

2022年宁波市南美白对虾主要病原流行病学调查

为了解虾肝肠胞虫(EHP)、十足目虹彩病毒1(DIV1)、白斑综合征病毒(WSSV)和致急性肝胰腺坏死病副溶血弧菌(Vp_AHPND)在宁波地区养殖南美白对虾中的致病途径和流行规律,采用PCR方法检测了该地区不同养殖模式下南美白对虾及其周边环境和生物中这4种病原的感染情况。结果显示：南美白对虾样本中,WSSV在整个养殖过程中未检出,Vp_AHPND阳性率最高,为14.6%,其次是EHP和DIV1,阳性率分别为10.2%和2.9%;土塘养殖模式下对虾病原检出率最高,为61.3%,其次为小棚模式和帆布池模式,病原检出率分别为26.3%和22.2%,大棚养殖的南美白对虾中未检出病原;水样中检出WSSV、EHP、Vp_AHPND、DIV1阳性批次数分别为1、14、8、6;底泥样品中未检出病原;周边环境生物中,仅1个批次的脊尾白虾检出EHP阳性。结果表明：4种病原在夏季有较强的流行趋势,需要针对性地加强防控;大棚养殖模式的抗风险能力要高于其他养殖模式,在该模式下水质相对稳定,受外界因素影响较小;病原在底泥和周边环境生物中检出率较低,而在...     

对虾传染性皮下及造血组织坏死病毒(IHHNV) PCR检测方法的建立

对虾传染性皮下及造血组织坏死病毒(IHHNV)病是国际兽疫局(OIE)划定的甲壳类其他重要疾病之一,它分布较广,危害严重,对世界对虾养殖业发展影响重大.本文根据Genbank登录的IHHNV基因序列(AF218266),设计了1对特异性引物,从纯化的IHHNV DNA和感染IHHNV凡纳滨对虾(Litopenaeus vannamei)组织DNA中成功地扩增出产物大小为703bp的DNA片段,该对引物对IHHNV DNA的检测灵敏度为19.85fg(8.83×103病毒拷贝),与健康对虾组织DNA、对虾白斑综合征病毒(WSSV) DNA及对虾肝胰腺细小病毒(HPV) DNA无交叉反应.本方法可快速、灵敏、特异地检测出对虾感染和携带IHHNV状况,为对虾健康养殖、无特定病原(SPF)种群选育及流行病调查提供了有效的检测手段.     

不同品种南美白对虾生长对比试验研究(下)

<正>(3)多样性指数。浮游植物Shannon-Wiener多样性指数变化范围1.85～2.15(见图8)。6-8月呈现上升趋势,7月达到峰值,Shannon-Wiener多样性指数6月、7月、8月间均差异显著(P0.05)。图8围隔试验池浮游植物Shannon-Wiener多样性指数3.围隔试验池病害发生情况放苗后每半月监测对虾白斑综合征病毒、虾肝肠胞虫、偷死野田村病毒、传染性皮下及造血     

鱼虾混合生态养殖技术

正近年来由于养殖环境恶化、良种不良及养殖操作不规范等因素,导致对虾病害严重,生长速度慢,养殖成功率下降,尤其是对虾肝胰腺坏死症、对虾白斑综合症病、传染性皮下及造血组织坏死病和对虾细菌病(副溶血性弧菌)的控制力不足,对虾病害已严重困扰了对虾养殖业的可持续发展,大家都在寻找对虾养殖的出路。本项目通过优质虾苗筛选技术、鱼虾混合生态养殖调控水环境及病害防治技术、水产品质量安全监控技术及规范养殖管理,形成鱼虾混合生态养殖技术规范,该技术易理解、     

南美白对虾亲虾良种选育技术

我国南美白对虾养殖业发展迅猛,其亲虾选育和种苗繁育发挥了关键作用。但是由于缺乏无特定病原（SPF）和抗特定病原（SPR）的南美白对虾健康亲本选育,以及病害检测手段落后,遗传育种工作滞后,导致亲本选择不严,近亲变配现象严重,造成对虾的白斑综合症病毒（WSSV）、桃拉病毒（TSV）和传染性皮下及造血组织坏死病毒（IHHNV）在南美白对虾养殖过程中普遍流行;