中国苹果树腐烂病发生和防治情况调查

2008年4～5月,通过国家苹果产业技术体系网络系统,对我国10个苹果主产省市的147个果园进行了苹果树腐烂病发生和防治情况调查。结果显示,在所调查苹果树中,总体发病率达52.7%。随着树龄的增大,腐烂病发病株率提高,4～10年生果树株发病率为26.8%,11～17年树龄的果树株发病率为54.0%,18～24年树龄的树株发病率为59.3%。不同省份之间以及不同品种之间,腐烂病在发生程度上存在一些差异,但不很明显。在腐烂病的化学防治中,石硫合剂是使用最多的药剂。在刮治病斑中,使用最多的是福美胂,其他还包括松焦油、腐殖酸、腐殖酸铜、过氧乙酸等。调查中发现防治腐烂病的用药比较混乱,由于福美胂毒性高,在无公害果园生产中已被禁用,因此研究替代福美胂的药剂成为当务之急。     

2011年烟台苹果产区腐烂病发病情况调查与原因分析

为了解2011年烟台苹果产区腐烂病的发生情况,2011年5月,在腐烂病发病较重的栖霞、海阳等地选择21个农户的果园,对腐烂病的发生情况进行了调查.结果表明,21个果园中具有新病疤的病株率为68.20％,死株率为2.76％,平均受害枝量为23.98％,死枝量10.74％,病株率超过50％的果园占25％～30％,总体发病情况比一般年份严重.调查共发现967块新病疤,平均每株2.32块,其中源自剪锯口的病疤占80.04％,从旧病疤复发的病疤占60.29％.2010年秋季的连续阴雨、冬季低温和2011年春季干旱可能是导致烟台苹果产区2011年春季腐烂病大发生的主要原因.剪锯口是腐烂病菌侵染的主要途径,旧病疤复发是春季腐烂病发病的主体.     

S-921菌株发酵液对泡桐腐烂病菌作用的研究

室内实验结果表明,金色链霉菌S-921菌株对泡桐腐烂病菌具有很强的抗生作用,将两者于PDA平板培养基上共同培养8天,出现直径3cm的抑菌圈。经S-921菌株发酵液浸泡处理的泡桐腐烂病病原菌菌丝体,会出现大量液泡,原生质凝集,菌丝尖膨大等异常形态,并失去致病力。S-921菌株发酵液(原液)对泡桐腐烂病的治疗效果,以刮除病班后涂抹发酵液的效果最佳,治愈率达100％。     

苹果树腐烂病菌对苯醚甲环唑的敏感性

为了明确苹果树腐烂病菌对苯醚甲环唑的敏感性现状,本研究采用菌丝生长速率法测定了来自7个省份7个不同年份的106株苹果树腐烂病菌对苯醚甲环唑的敏感性,并建立了敏感基线。结果表明:供试苹果树腐烂病菌菌株的EC₅₀区间在0.003～0.123μg/mL,敏感性频率分布呈连续性单峰曲线。经K-S法检验符合正态分布,未出现敏感性明显下降的抗性群体,平均EC₅₀(0.044±0.029)μg/mL可作为苹果树腐烂病菌对苯醚甲环唑的敏感基线。不同地理来源的菌株对苯醚甲环唑的敏感性有显著性差异,来自辽宁省的菌株敏感性最高,河南省的敏感性最低;不同年份的菌株敏感性也有显著性差异,2009年采集的菌株对苯醚甲环唑的敏感性最高,2016年采集的菌株敏感性最低,菌株对药剂的敏感性随年份的推移逐渐降低,说明病菌的抗药性不断增强。     

苹果树腐烂病菌Vm-milRNA9通过调控VmPEAMT的表达促进病菌侵染

植物病原真菌microRNA-like RNA(milRNA)通过调控靶标基因的表达广泛参与生长发育、逆境胁迫响应以及侵染致病等生命活动。前期在系统鉴定苹果树腐烂病菌(Valsa mali)milRNA的过程中,发现Vm-milR9在菌丝营养生长阶段高度表达,但在侵染过程中显著下调表达,降解组分析发现磷酸乙醇胺甲基转移酶基因VmPEAMT可能是其一个重要靶标基因。然而,Vm-milR9能否通过调控VmPEAMT的表达参与病菌致病仍不明确。为此,本研究首先创制了Vm-milR9的过表达菌株,发现其菌落生长速率和致病力均显著降低。进而分析了过表达菌株中候选靶标基因VmPEAMT的表达水平,发现Vm-milR9的过表达显著抑制了VmPEAMT的表达水平。同时利用烟草共转化技术证实了Vm-milR9在烟草细胞中能够特异性地抑制VmPEAMT的表达。在此基础上,创制了VmPEAMT的敲除突变体,发现突变体的菌落生长速率有一定程度降低,但致病力下降比例更为明显。上述结果表明Vm-milR9可以通过特异靶向抑制VmPEAMT的表达调控V.mali的营养生长和致病力。     

苹果树腐烂病菌含cupin结构域蛋白Vmcupin1的鉴定及功能分析

由苹果黑腐皮壳(Valsa mali)侵染引起的苹果树腐烂病是严重威胁我国苹果产业健康发展的重大枝干病害。揭示病菌致病机理有助于制定病害防控新策略。含cupin结构域蛋白是一个大的蛋白家族,广泛参与植物发育和逆境胁迫响应等多种生命活动。有关植物病原真菌中该类蛋白的研究报道很少,其参与菌丝生长和侵染致病的生物学功能尚不明确。基于V.mali与苹果树皮互作的转录组分析,发现一个在病菌侵染过程中显著上调表达的基因。蛋白序列特征分析发现,该蛋白含有1个典型的cupin结构域,且与其他物种含cupin结构域蛋白高度同源,将之命名为Vmcupin1。实时荧光定量分析发现Vmcupin1在病菌侵染过程中显著上调表达。创制了Vmcupin1缺失突变体和回补菌株,发现该基因缺失后,病菌生长速率在一定程度上降低,其致病力和适应H₂O₂和NaCl胁迫的能力显著降低,表明Vmcupin1在病菌营养生长、侵染致病,以及逆境胁迫中发挥重要功能。研究结果丰富了真菌含cupin结构域蛋白功能的认知,有助于全面解析腐烂病菌致病机理。     

陕西省苹果树腐烂病菌基因多态性的ISSR分析

为了从分子水平上揭示苹果树腐烂病菌的群体遗传多样性,采用正交设计对ISSR-PCR体系进行了4因素3水平的筛选,并从47条ISSR引物中筛选出11条多态性较好的引物。对供试的87个分离株进行扩增的结果显示,11条引物在129个位点扩增出稳定的条带,其中多态性位点119个,多态性位点率为92.25%。POPGENE分析显示,病菌种群的遗传多样性和基因多态性丰富,群体间的遗传分化系数(Gst)为0.109,群体内为0.891,群体内多样性大于群体间多样性。两个地理种群间的居群每代迁移数(Nm)为2.046,两者之间存在广泛的基因交流。在遗传相似系数为0.88时,可将21个自然种群划分为9个不同的类群,表明陕西省苹果树腐烂病菌的各个自然种群之间的遗传亲缘关系与其地理来源之间无明显的相关性。     

农抗120对苹果树腐烂病菌的作用研究

试验表明:农抗120单用,和农抗120加助剂B,对苹果树腐烂病菌菌丝的生长,均有明显的抑制作用。最小抑菌浓度为250μg/ml和125μg/ml;最小杀菌浓度为2000μg/ml和1000μg/ml。其杀菌作用机理是使病菌体的原生质凝集,小分子物质外流,形成大量空泡,菌体重量剧减。病菌在该浓度中浸泡12小时后便失去致病力。涂药试验:先刮除病斑,再用农抗120 1000μg/ml或农抗120加助剂B500μg/ml涂抹处理,16天后复发率仍为零,不刮除病斑,只用刀划刻病枝再涂药液,4天后病斑又继续扩展。     

苹果树腐烂病菌拮抗放线菌JPD-1的筛选及鉴定

为筛选对苹果树腐烂病菌Valsa mali具有拮抗作用的放线菌,从苹果树根际土壤中分离获得放线菌,利用平板对峙法和生长速率法筛选拮抗活性较高的菌株,通过菌株培养特征、形态特征、生理生化特性及16S rDNA序列分析确定其分类地位,并采用离体枝条烫伤接种法测定所筛选获得的拮抗菌株对苹果树腐烂病的防效。结果表明,从苹果树根际土壤中共分离获得28株放线菌,其中菌株JPD-1对苹果树腐烂病菌的拮抗作用最强,抑制率为72.50%,该菌在高氏合成1号培养基上生长最好,培养7 d时菌落生长旺盛,气生菌丝白色,基生菌丝深粉红色,无可溶性色素产生;经形态特征观察、生理生化试验及16S rDNA序列分析,将菌株JPD-1鉴定为公牛链霉菌Streptomyces tau‐ricus。菌株JPD-1发酵滤液对苹果树腐烂病菌的抑制率及对离体枝条上苹果树腐烂病的防效均随稀释倍数的增大而减弱,发酵滤液原液使苹果树腐烂病菌菌丝膨大、末端畸形,抑制率为78.14%,对离体枝条上苹果树腐烂病的防效为76.37%。表明分离到的放线菌菌株JPD-1可以用作苹果树腐烂病的生防材料,具有很好的开发及应用前景。     

苹果树腐烂病菌染色质重塑因子Vmles4的功能研究

染色质重塑因子INO80是一类由多亚基构成的遗传学调控因子,调控多种DNA代谢,在基因的表达中发挥着重要的调控功能。但其在苹果树腐烂病菌（Valsa mali）中是否存在及其生物学功能并不清楚,为此,本研究从病菌基因组中分析鉴定到INO80的一个亚基基因Vmles4,利用qRT-PCR技术分析了Vmles4在病菌侵染过程中的表达模式,利用Double-joint PCR技术和PEG介导的原生质体转化方法进行了基因敲除,然后对3个突变体的营养生长及致病力进行测定和分析,并对病菌的非核糖体肽合成酶基因VmNRPS12及VmNRPS14在突变体中的表达进行定量分析。结果表明：Vmles4在侵染初期的表达显著上调,接种后6 h上调表达6.2倍。敲除突变体的生长速率平均降低28%且菌丝生长稀疏,在富士苹果品种（Malus domestic cv. Fuji）叶片和枝条上的致病力分别降低到22.5%和27.5%,VmNRPS12及VmNRPS14基因在Vmles4突变体侵染苹果枝条24 h后的表达量分别下调86.5%和50%;综上所述,Vmles4正调控腐烂病菌的营养生长、致病力以及次级代谢合成酶基因VmNRPS12和VmNRPS14的表达。     

苹果树腐烂病菌转录因子VmSte12的鉴定及功能分析

 Ste12是最早在酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)中发现的一类转录因子。之后在部分丝状真菌中也发现了该类转录因子的存在,并证明其能够参与调控生殖生长以及病原真菌的致病力。然而,苹果树腐烂病菌(Valsa mali)中是否存在该类转录因子以及其功能尚不明确。本研究基于生物信息学鉴定苹果树腐烂病菌中Ste12的同源基因,采用烟草瞬时表达系统进行蛋白亚细胞定位分析,利用酵母单杂技术进行转录激活功能分析,进而利用PEG介导的原生质体转化技术构建基因缺失突变体,并对其进行表型观察与分析。结果表明,苹果树腐烂病菌存在Ste12的同源基因,我们将其命名为VmSte12。该基因编码701个氨基酸,包含Ste同源结构域和C₂H₂锌指结构域。VmSte12定位于细胞核,并具有体外转录激活功能。与野生型相比,VmSte12敲除突变体生长速率平均下降10.1%,分生孢子器数量平均下降94.6%,致病力平均下降27.4%。可见,VmSte12具有Ste12类转录因子特征,并且极有可能在腐烂病菌的生长、繁殖、致病等方面发挥重要作用。     

梨和苹果腐烂病菌不同培养表型菌株的致病性分析

The pathogenicity of three strains (F-SD-8, F-BJ-2c-2 and F-HN-2a-1) of Valsa mali var. pyri causing pear canker and one strain (F-SX-A6) of V. mali var. mali causing apple canker in China were comparatively tested by wound inoculation on in vitro twigs of pear, apple and some other woody plants, and in vivo twigs of pear. Significant pathogenicity differentiation was detected in V. mali var. pyri. Generally strains F-SD-8 and F-BJ-2c-2 were highly pathogenic on pear although their culturing characteristics differed greatly. The strain F-SX-A6 was more aggressive on apple than on pear, and the strain F-HN-2a-1 showed significant lower pathogenicity on ten pear cultivars and other seven species of woody plants. Our results confirmed that two variants of V. mali had host preference and were also aggressive to crabapple, apricot, and peach besides apple and pear. Meanwhile, strains F-SD-8 and F-BJ-2c-2 could induce the formation of pycnidia on in vivo twigs of pear, which was not observed on in vivo twigs inoculated with F-HN-2a-1 and F-SX-A6.     

温度对梨树腐烂病菌生长、病斑扩展及产毒素水平的影响

为探明温度对梨树腐烂病菌生长、病斑扩展及产毒素水平的影响,采用常规生物学方法和高效液相色谱法,测定了该病菌强致病力菌株LXS240101在不同温度下的菌丝生长、病斑扩展及产毒素水平。结果表明:菌株LXS240101最适宜的生长温度为25~30℃;在5~35℃范围内,梨树离体枝条接种梨树腐烂病菌后均能发病并导致病斑扩展,25℃时病斑扩展速度最快,面积达4.45cm2,5℃和35℃时病斑扩展速度缓慢,面积不足0.3 cm2。该菌株在梨树树皮培养基中最适宜的产毒素温度为20℃,10~25℃条件下可产生5种毒素,而在其它温度下仅产生3~4种;接种该菌株的梨树离体枝条5℃条件下未检测到间苯三酚和对羟基苯甲酸,且毒素总量最低,其余温度下均可检测到5种毒素,最适宜的产毒素温度为10℃,毒素总量可达224.14μg/g干组织。     

苹果树腐烂病菌VmMFS1~VmMFS3基因的功能分析

为绿色持久防控苹果树腐烂病,该研究分析苹果树腐烂病菌Valsa mali的3个主要协同转运蛋白超家族（major facilitator superfamily,MFS）编码基因的氨基酸序列特征,利用实时荧光定量PCR （quantitative real-time PCR,RT-qPCR）技术分析这3个基因在苹果树腐烂病菌侵染阶段的表达水平,通过构建这3个基因的缺失突变体和回补菌株分析其在病原菌营养生长、致病力和非生物胁迫应答等方面的功能。结果表明,这3个基因的氨基酸序列均具有MFS保守结构域,将其命名为VmMFS1~VmMFS3; VmMFS1和VmMFS2的进化距离较近,均与VmMFS3的进化距离较远;在苹果树腐烂病菌侵染过程中VmMFS1~VmMFS3基因表达均显著上调;与野生型03-8菌株相比,VmMFS1~VmMFS3基因缺失突变体的菌落形态无明显差异,但生长速度下降; VmMFS1~VmMFS3基因缺失突变体的致病力均显著降低; VmMFS1~VmMFS3基因缺失突变体对H₂O₂胁迫的敏感性无明显变化,但对NaCl胁迫更敏感;基因回补后基因缺失突变体的表型缺陷能恢复到野生型菌株的水平。     

地肤子提取物对苹果树腐烂病菌的抑制作用及对其菌体结构和功能的影响

为开发新型安全高效的植物源苹果树腐烂病防治剂,采用菌丝生长速率法测定中草药地肤子乙醇提取物及各层析流分L1～L9对苹果树腐烂病菌Valsa mali的抑制作用,同时通过室内常规分析方法观测流分L7对该菌菌丝形态结构、细胞膜通透性及物质吸收和代谢的影响。结果表明,地肤子乙醇粗提物浓度为2 mg/mL时对苹果树腐烂病菌具有较强的离体抑制活性,处理后96 h的抑菌率达到92.16%。分别用石油醚、氯仿、正丁醇萃取醇提物,石油醚萃取物对苹果树腐烂病菌的抑制效果最为明显,其EC_(50)为0.07 mg/mL;在石油醚萃取物通过硅胶柱层析分离得到的9种流分中,流分L7对苹果树腐烂病菌的抑制作用显著,离体抑菌率高达96.73%;且在流分L7处理下,病菌菌丝体出现肿胀、膨大或畸形等现象,细胞膜通透性增大,可溶性蛋白、还原糖以及丙酮酸的含量随流分L7浓度的升高而持续降低,当浓度为100μg/mL时,菌丝体可溶性蛋白、还原糖及丙酮酸的含量分别降低70.78%、71.74%和78.68%。表明在离体培养条件下地肤子乙醇提取物能明显抑制苹果树腐烂病菌的生长,并对菌丝体细胞膜结构和功能稳定性产生显著影响,具有进一步开发为新型植物源苹果树腐烂病防治剂的潜力。     

嘧菌酯与不同杀菌剂混配对苹果斑点落叶病菌的增效作用

嘧菌酯（azoxystrobin）是一种以保护作用为主，兼具内吸治疗作用的新型杀菌剂，能有效地控制对苯并咪唑类杀菌剂已产生抗性的病原菌，而且对非靶标生物和环境安全，已被广泛应用于粮食、果树、蔬菜等作物上多种病害的防治，但成本高。为了提高嘧菌酯防病效果，降低使用成本，延缓病原菌抗药性的产生，延长多菌灵等内吸性杀菌剂品种的使用寿命，作者进行了不同混配比例的嘧菌酯与多菌灵及嘧菌酯与戊唑醇混配的增效性研究，以明确其合理的混配比例及增效作用，为该类型的混剂加工以及在果树病害防治上的应用提供科学依据。     

采用环介导等温扩增法(LAMP)快速检测苹果根结线虫

为高效、简便、快速地对我国进境植物检疫性有害生物名录中的非中国种—苹果根结线虫Meloidogyne mali进行检疫,通过比较Gen Bank中根结线虫相关序列,以苹果根结线虫28S r DNA非保守区域序列设计环介导等温扩增(loop-mediated isothermal amplification,LAMP)的特异性引物,并优化反应条件,建立一种可快速检测苹果根结线虫的LAMP检测体系。结果显示:d NTPs浓度为0.4 mmol/L、Mg~(2+)浓度为5.0 mmol/L、不添加甜菜碱、反应时间为60 min时,LAMP检测体系扩增效率最高;用琼脂糖凝胶电泳、SYBR Green I染色和LFD试纸均能检测到苹果根结线虫的扩增产物。所建立的LAMP检测体系能够从10种供试植物线虫种群中特异性地检测出苹果根结线虫,灵敏度为1/20 000条线虫DNA,比常规PCR灵敏度高10倍。表明所建立的苹果根结线虫LAMP快速检测体系可用于我国口岸进境植物中苹果根结线虫检疫。     

山定子抗苹果褐斑病菌侵染过程中DNA ladder与类caspases活性的检测

接种褐斑病菌分生孢子悬浮液于山定子与富士苹果叶片,接种后1、3 d和5 d取样,提取DNA,检测DNA ladder;提取样品粗蛋白,用特异性荧光底物检测粗蛋白中类caspase活性,探索山定子受褐斑病菌侵染过程中引起的细胞程序性死亡(PCD)与抗性的关系,检测DNA ladder和类caspases活性变化的规律。研究发现:在接种后1、3 d和5 d,山定子和富士苹果叶片中没有明显DNA ladder的产生;受检测的YVADase、DEVDase、IETDase和VEIDase活性在接种后1 d和3 d没有显著变化,但在接种后5 d,活性均降低30%左右,显著低于对照。研究表明,山定子在褐斑病菌侵染过程中并没有DNA ladder产生,但却伴随着类caspase活性的下降。