氯氟吡啶酯水解产物的鉴定及其检测方法的建立

本研究利用高效液相色谱-四极杆-飞行时间质谱鉴定了氯氟吡啶酯的主要水解产物氯氟吡啶酸.通过优化QuEChERS方法结合高效液相色谱串联三重四极杆质谱技术建立了同时检测稻田环境中氯氟吡啶酯及其代谢产物氯氟吡啶酸的检测方法.以0.1％甲酸水-乙腈(V/V)为流动相梯度洗脱,Poroshell 120 EC-C18色谱柱进行...     

不同土壤中苯噻草胺的微生物降解

研究了除草剂苯噻草胺在不同土壤的降解。结果表明，有机质含量低的土壤中微生物降解是其消失的主要因素，有机质含量高的黑土中吸附结合是其消失的主要因素。水田条件下苯噻草胺消失速率比旱田条件下快，但消失类型不同。被吸附的农药在解吸前不参与微生物降解，土壤有机质含量影响苯噻草胺的实际降解速率。提出反S型函数模型更好地拟合农药在土壤中的消失动态。     

苯噻草胺对水田土壤呼吸强度和酶活性的影响

研究了除草剂苯噻草胺对水稻田土壤呼吸强度和酶活性的影响。表明苯噻草胺使用后初期刺激土壤呼吸作用但随后产生轻微抑制 ,能激活脱氢酶的活性 ,但抑制过氧化氢酶活性随后产生一定的刺激作用。苯噻草胺强烈抑制脲酶活性 ,轻微抑制蛋白酶活性 ,但对磷酸酶具有刺激作用 ,而且随苯噻草胺施用浓度的增加而刺激作用增强。苯噻草胺比上一代除草剂丁草胺所造成的对水稻田土壤呼吸强度和酶活性的影响小     

苯噻草胺光催化和直接光解影响因素和降解途径研究

采用微波辅助光催化降解和直接光解实验方法,研究了苯噻草胺在光催化和直接光解两种体系下的降解情况,并考察了初始pH值、腐植酸浓度以及阿特拉津对其光催化降解和直接光解的影响。结果表明,在光照4min内,苯噻草胺直接光解效率为93．3％,较光催化降解效率高出28．9％;初始pH值从1．88增加至10．28时,苯噻草胺光催化和光解速率常数分别提高了250％和58．6％;添加腐植酸对苯噻草胺的直接光解和光催化均具有抑制效应,并且抑制效应随着腐植酸浓度的增加而增加,当腐植酸浓度增加至40mg·L^-1时,直接光解和光催化降解速率分别降低了51．8％和47．5％;10mg·L^-1的阿特拉津抑制了苯噻草胺的前期降解,整体直接光解速率降低了46．3％,但整体光催化降解速率没有减小。此外,采用GC—MS对苯噻草胺两种降解体系下的主要中间产物进行鉴定,并提出了主要的光降解途径。     

代谢指纹评估苯噻草胺对水稻土微生物群落的短期影响

本文探讨了酰胺类除草剂苯噻草胺对水稻土微生物群落功能多样性的短期影响。本研究采用微生物群落基质利用潜力测定（Biolog法）评估生物群落。结果表明，苯噻草胺污染引起了水稻田微生物群落功能多样性的下降，降低了微生物对单-碳源底物的利用能力，但这种影响是短暂的，在试验最终没有导致土壤微生物群落功能多样性下降。多食鞘氨醇杆菌Y1（Sphingobacterium multiuorum）的添加有利于提高水稻土微生物群落的功能多样性。3个处理土壤的群落代谢剖面值与培养时间之间呈非线性关系，其变化过程符合微生物种群生长动态模型（S形）。模型模拟分析表明，动力学参数a和x0能更灵敏地表征苯噻草胺和Y1菌株处理对水稻土微生物群落功能多样性的影响。在本实验研究中，多样性指标指数Shannon（H）能灵敏而有效地指示污染环境的微生物学变化，但群落丰富度指标颜色变化孔数（S）提供的信息较片面。     

高比活度碳-14标记氟噻草胺的合成与分析

为开展除草剂氟噻草胺在我国的登记代谢试验,本研究以4-氟[U-¹⁴C]苯胺为同位素原料,经还原胺化、缩合、取代、水解和醚化五步放化反应获得N-(4-氟[U-¹⁴C]苯基)-N-异丙基-2-((5-(三氟甲基)-1,3,4-噻二唑-2-基)氧基)乙酰胺(2,总活度201.65 MBq;比活度2 049.80 MBq·mmol^-1;化学纯度和放化纯度均大于98%,总放化收率39%);以[¹⁴C]硫氰酸钠为同位素原料,经加成、水解、环化、重氮化和醚化五步放化反应获得N-(4-氟苯基)-N-异丙基-2-((5-(三氟甲基)-1,3,4-[2-¹⁴C]噻二唑-2-基)氧基)乙酰胺(3,总活度287.86 MBq;比活度2 042.40 MBq·mmol^-1;化学纯度和放化纯度均大于98%,总放化收率14%)。两种标记物的结构经核磁共振氢谱(¹H NMR)和质谱(MS)分析确认,质量指标经高效液相色谱(HPLC-PDA)、放射性薄层成像分析(TLC-IIA)、在线放射性高效液相色谱(HPLC-FSA)和液体闪烁法(LSC)测定,均可作为放射性示踪剂。本研究结果为氟噻草胺的同位素示踪研究(包括该除草剂在我国的登记代谢试验)奠定了物质基础。     

烟草病毒病及其检测鉴定技术

简介了病毒及烟草病毒的分类,烟草病毒病的检测鉴定技术。重点叙述酶联免疫吸附反应（ELISA）在烟草病毒检测中的应用。     

西马特罗杂交瘤细胞株的建立及其单克隆抗体制备和鉴定

用重氮化法将牛血清白蛋白（BSA）和卵清蛋白（OVA）分别与西马特罗（CIM）偶联作为免疫原或包被原,用BSA-CIM免疫BALB/c小鼠,经过3次免疫后,OVA-CIM包被后用间接ELISA和阻断ELISA选择细胞融合备用鼠,选择高效价、高敏感性和高特异性的小鼠进行抗原超强免疫;取脾细胞应用杂交瘤技术与骨髓瘤细胞建立分泌CIM单克隆抗体（Monoclonal antibody,mAb）的杂交瘤细胞株;用体内诱生腹水法制备CIM mAb,对CIM mAb的效价、敏感性和特异性等免疫学特性进行鉴定。结果显示免疫的6只小鼠血清抗体效价均达到10-3;融合后筛选出3B11-H4、2A11-G11和4F5-F11共3株敏感特异的杂交瘤细胞,其细胞培养上清液效价分别为1∶800、1∶1600和1∶1600,腹水效价分别为1∶2.56×106、1∶1.02×107和1∶2.56×107,3B11-H4株对CIM的IC50为040ng/ml,与瘦肉精、莱克多巴胺等其他β2激动剂交叉反应性小于02%。本试验获得了高效价、敏感、特异的抗CIM mAb,为CIM残留ELISA检测试剂盒和试纸条的建立奠定了坚实的基础。     

噻苯隆对黄瓜果实生长及内源激素水平的影响

以黄瓜（Cucumis sativus L.）＂川翠1号＂为试验材料,研究苯脲型细胞分裂素类物质噻苯隆（TDZ）对黄瓜果实生长、品质及内源激素水平等的影响。结果表明,相比对照,TDZ处理的花后3～6d内黄瓜日均增长量增加35.71%;采收时单果鲜重、座瓜率分别增加27.09%和7.23%,畸形瓜率降低75.51%,且对...     

石斑鱼神经坏死病毒的RT-LAMP检测方法的建立

利用反转录环介导等温扩增技术(RT-LAMP)建立一种方便、快捷的石斑鱼神经坏死病毒(NNV)检测方法。根据石斑鱼神经坏死病毒衣壳蛋白基因序列的保守区设计5组特异引物,提取斜带石斑鱼的总RNA,利用RT-LAMP技术比较5组引物的敏感性和特异性,同时对反应温度和反应时间进行优化,并对现场20尾鱼苗进行了检测。结果表明:筛选出一组高特异性的引物,在61℃条件下恒温反应20 min可以完成检测;在反应试管中添加钙黄绿素,可利用荧光反应现象进行结果判定,且对9种常见鱼类病原微生物无交叉反应;对20尾鱼苗进行了现场检测,检测结果与RT-PCR结果一致。本研究成功建立起石斑鱼神经坏死病毒RT-LAMP检测方法,方法特异性强、反应时间短、操作简单,为进一步推广该技术在现场大规模的应用奠定了研究基础。     

4株苯磺隆降解菌的分离鉴定及其生长特性

从长期受农药苯磺隆污染的土壤中通过采用富集培养分离技术得到4株以苯磺隆为唯一碳源生长的细菌,分别将其命名为B1、B2、B3和B4。通过观察这4种菌株的形态学特征,研究其生理生化特性以及分析其16S rDNA序列,初步鉴定菌株B1为铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa),B2为戴尔福特菌(Delftia sp.),B3为微杆菌(Microbacterium sp.),B4为产碱杆菌(Alcaligenes sp.)。并通过研究温度、初始pH值、接种量、苯磺隆初始浓度、培养基体积、氮源、碳源、Mg2+浓度等因素对4种菌株生长情况的影响,确定了菌株的最佳生长条件。结果显示,B1菌株的最适温度为35℃,其他3株菌株均为30℃。菌株B3最适pH为8.0,其余3株菌株均为pH7.0。B1和B3菌株最适接种量为15%,B2和B4最适接种量为10%。菌株B3最适苯磺隆初始浓度为100mg·L-1,其余菌株最适苯磺隆初始浓度均为200mg·L-1。4株菌株最适培养基体积均为75mL,最适氮源均为硝酸铵,最适碳源均为葡萄糖。B2菌株最适Mg2+浓度为100mg·L-1,其余3株菌株均为200mg·L-1。B1和B4菌株最适NaCl浓度为20g·L-1,B2菌株NaCl浓度为5~30g·L-1,B3菌株最适NaCl浓度为50g·L-1。该结果为利用微生物对农药苯磺隆污染的土壤进行原位生物修复提供理论依据。     

AS-PCR技术检测鸡EX-FABP基因型方法的建立

摘要： 鸡(Gallus gallus )胞外脂肪酸结合蛋白(extracelluar fatty acid binding protein, EX-FABP)基因型与鸡腹脂量的积累密切相关。尝试了用等位基因特异性PCR(allele-Specific PCR, AS-PCR) 技术检测EX-FABP基因型的方法，确定了检测的参数和方案, 对AS-PCR检验单碱基突变的方法和策略进行了讨论,并在此基础上对该技术进行了改进，建立了等位基因特异性片段长度差异PCR（allele-specific and length-different PCR, ASLD PCR）技术。     

马铃薯卷叶病毒RT-LAMP检测方法的建立

为建立一种快速准确检测马铃薯卷叶病毒(potato leafroll virus,PLRV)的方法,本研究以PLRV CP(coat protein,CP)基因ORF3保守序列为靶标,建立了PLRV反转录环介导等温扩增(RT-LAMP)检测体系,并对建立的RT-LAMP检测体系的特异性、灵敏度、实际应用效果进行评估。结果表明,建立的PLRV RT-LAMP检测方法,在62℃恒温下扩增50 min,扩增产物中加入双链嵌合荧光染色(SYBR Green Ⅰ),阳性样品颜色变为绿色,阴性样品颜色仍为褐色,可直接目测判断待检测样品是否感染PLRV。该方法只特异性检测PLRV,不与马铃薯X病毒(PVX)、马铃薯Y病毒(PVY)、马铃薯S病毒(PVS)、马铃薯A病毒(PVA)和马铃薯M病毒(PVM)等其他5种马铃薯主要病毒发生交叉反应。此外,建立的PLRV RT-LAMP检测方法的灵敏度较反转录PCR(RT-PCR)方法高100倍。田间样品检测验证,该方法与标准RT-PCR方法符合率达100%。本研究建立的以SYBR Green Ι为颜色指示的PLRV可视化检测RT-LAMP方法,特异、灵敏、便捷,成本低,可满足科研、基层单位对该病毒快速诊断和检测的需要。     

抗链霉素单克隆抗体杂交瘤细胞株的建立及其免疫学特性鉴定

用EDC一步法和戊二醛法将SM偶联于载体蛋白牛血清白蛋白(BSA)和OVA,合成免疫原BSA-SM和包被原OVA-SM。用紫外线扫描、SDS-PAGE进行鉴定;用BSA-SM免疫BALB/C小鼠,用杂交瘤技术建立分泌SM mAb的细胞株3F9-C4;对SM mAb的效价、亲和性、敏感性和特异性等免疫学特性进行鉴定。结果表明,BSA-SM人工抗原分子结合比为1∶25;筛选出3F9-C4敏感特异的杂交瘤细胞1株,间接ELISA测定细胞培养上清,效价为1∶3.2×102,同种型为IgG2a/κ;腹水的亲和常数(Ka)为8.4×1011L/mol;IC50为8.99μg/L,与双氢链霉素交叉反应为109.6%,与其他SM结构相似物和功能近似物无交叉反应性。本试验获得了抗SM高价、敏感、特异的mAb,可用于SM的残留检测。     

抗苯巴比妥单克隆抗体杂交瘤细胞株的建立及其免疫学特性鉴定

苯巴比妥(PB)经化学修饰在其苯环上引入活性基团氨基,合成半抗原对氨基苯巴比妥(pAPB),用重氮化法将pAPB偶联于BSA,合成人工抗原BSA-pAPB,并用红外(IR)、紫外(UV)、SDS-PAGE鉴定;用BSA-pAPB免疫Balb/C小鼠,细胞融合技术建立抗PB的单克隆抗体mAb(PB mAb)杂交瘤细胞株,体内诱生腹水法制备PB mAb,并鉴定其免疫学特性。结果表明,BSA-pAPB偶联成功,偶联率为1∶19;筛选出1B9、3C4、3F6、4E6共4株杂交瘤细胞,其中最好的4E6株间接ELISA效价细胞培养上清为1∶8.1×102,腹水为1∶6.4×105,同种型为IgG1/κ,亲和常数(Ka)为2.08×1010L/mol,对PB的半数抑制浓度(IC50)为11.35μg/L,与巴比妥的交叉反应率(CR%)为12.4%,与其他化合物无CR。本试验研制出高效价、敏感、特异的PB mAb,可用于PB残留检测的免疫学实验。     

乳制品中金黄色葡萄球菌PCR快速检测方法的建立

为快速检测乳制品中的金黄色葡萄球菌,本研究将纳米氢氧化钛和纳米氢氧化锆固定在滤纸片上以去除PCR反应抑制因子,并以Nuc为靶基因,建立一种无需样品前增菌的PCR快速检测方法,同时确定该方法的特异性、灵敏度和实用性,并评估该方法所用试剂在冷冻保存条件下的稳定性与实用性。结果表明,该PCR快速检测方法在检测97株目标菌及83株非目标菌后未出现假阳性或假阴性结果;该方法无需增菌处理,可在4 h内完成检测,检测限为10¹ CFU·25 g^-1或10¹ CFU·25 mL^-1;该方法与传统检测方法在实际乳制品样品中金黄色葡萄球菌的检出率及活菌检测率均一致(符合率100%);此外,该检测方法所用试剂在-20℃冷冻条件下可稳定保存至少12个月。综上所述,本研究建立的PCR快速检测方法特异性强、灵敏度高,且实用性良好,能有效去除样品基质中的PCR反应抑制因子,为乳制品中金黄色葡萄球菌的快速检测提供了参考依据。     

实时荧光PCR检测Ⅱ型猪链球菌方法的建立

建立了一种检测Ⅱ型猪链球菌(Streptococcus suis serotype 2)的实时荧光PCR(real-time fluorescence polymerase chain reaction)方法。用Primer Express2.0和Oligo6.0设计针对Ⅱ型猪链球菌荚膜抗原基因簇中cps2I基因的引物和Taqman荧光探针。通过常规PCR方法扩增得到81 bp DNA片段，克隆到pMD18-T载体，测序表明得到的序列为目的基因片段。在Lightcycler荧光PCR仪上对Ⅱ型猪链球菌的扩增曲线表明，该实时荧光PCR具有良好的特异性，可成功地扩增Ⅱ型猪链球菌，而参考猪链球菌(S.suis)、大肠杆菌(Escherichia coli )、沙门氏菌(Salmonella)、金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureu)、志贺氏菌(Shigella)、单增李斯特氏菌(Listeria monocytoge)和空白对照都是阴性；该检测方法可达到检测10个细菌的灵敏度，反应过程仅需30 min完成；在两个不同时间检测同一浓度的菌液，每次做20个重复，2次检测所得的Ct (threshold，阈循环)值之间无统计学差异(P > 0.05)，方法稳定性好。该实时荧光PCR检测Ⅱ型猪链球菌的方法可用于出入境检疫和动物防疫监督部门的疫情监测。     

基于M蛋白检测犬瘟热抗体ELISA方法的建立

犬瘟热病毒(Canine disremper virus,CDV)是导致犬科等多种属动物发热、腹泻、幼仔死亡等症状的传染病病原体,建立针对CDV的快速灵敏的诊断方法对于该病的防治具有重要意义。本研究利用RT-PCR方法扩增得到CDV-M基因,构建原核重组表达载体p ET-28(a)-CDV-M,并在大肠杆菌(Escherichia coli)中实现了该蛋白的表达和纯化,Western blot验证重组蛋白的抗原性,用纯化的重组蛋白his-CDV-M作为抗原包被酶标板,ELISA方阵实验确定该重组蛋白的包被浓度,建立了检测临床犬血清样品的CDV-M蛋白抗体的间接ELISA方法,比较本实验方法与其他试剂盒之间的特异性和灵敏性。结果表明重组蛋白his-CDVM得到较好表达,纯化后蛋白浓度为2.840 mg/m L。Western blot结果表明重组抗原能与犬瘟热阳性血清进行反应。方阵实验确定抗原最佳工作浓度为8.88μg/m L,抗体最佳稀释度为1∶160,应用本方法检测223份犬血清样品,与进口CDV诊断试剂盒检测结果符合率为96%。本研究建立的基于M蛋白的犬瘟热病毒抗体检测方法具有较高的特异性和灵敏性,为犬瘟热病毒的诊断及M蛋白的功能研究提供了工具。     

狐狸肉源性成分快速检测方法的建立

为了规范食品安全标识,防止非食用性的狐狸肉添加到肉品中导致伦理、宗教等敏感问题,迫切需要建立狐狸肉源性成分鉴定方法。本研究以狐狸、牛、羊、猪、鸭、驴和鼠肉以及模拟掺假样本为研究对象,根据狐狸线粒体基因序列设计特异性交叉引物组合,Bst DNA聚合酶反应体系经63℃恒温扩增60 min,扩增产物经电泳检测和一次性核酸试纸条检测,显示结果一致,建立了交叉引物等温扩增技术与核酸试纸条检测结合的快速检测狐狸源性成分的方法。本研究建立的狐狸肉源性成分特异性的等温扩增体系,对单一狐狸源性DNA成分的灵敏度为10 ng·μL^-1,对狐狸肉与羊肉混合物中狐狸肉成分的检出比例为1%,可为肉制品市场现场检测提供简便、经济、快速有效的技术支持。