无抗性表达致PWD和ED大肠杆菌保护性抗原基因的重组菌构建

利用平衡致死系统成功地将构建表达致PWD和ED大肠杆菌保护性抗原基因的重组菌BL21(pFSFaeG)中所含氨苄抗性基因敲除,并转化沙门氏菌宿主菌X4550。经过质粒酶切分析和表达产物的SDSPAGE证实,氨苄抗性基因已经成功敲除,并且目的蛋白仍与谷胱甘肽转移酶相融合,得到有效表达,重组融合蛋白的分子质量约为80ku。经体外连续传代试验,重组菌X4550(pFSFaeG)均能在无抗生素压力下大量扩增并稳定传代,质粒稳定性和蛋白表达稳定性良好。无抗性重组菌的成功构建解决了基因工程疫苗抗性基因潜在危险问题,并有望通过沙门氏菌载体的递送作用,为研制口服疫苗奠定了基础。     

双表达去势DNA疫苗的构建及其稳定性研究

试验旨在构建一种更安全有效的新型免疫去势DNA疫苗,通过选取下丘脑-垂体-性腺轴（hypot halamic-pituitary-gonadal axis,HPG）的上游调控基因吻素1（KISS1）和促性腺激素释放激素（GnRH）作为靶标,借助2A肽的自剪切功能,引入平衡致死系统代替抗性基因筛选流程,成功将GnRH和KISS1转入非抗性筛选质粒pVAX-asd中,酶切验证和测序对比验证目的基因的插入方向和序列完全正确。重组质粒转染HeLa细胞,反转录后扩增目的基因结果显示,重组质粒在真核细胞内能够正常转录,保证重组质粒在导入机体后能够正常表达,从而引起特异性免疫反应。将构建成功的质粒转入减毒的猪霍乱沙门氏菌C500中,获得可直接口服免疫的活载体疫苗,酶切和测序结果表明,双表达重组质粒成功导入工程菌中。将活菌疫苗在体外连续传代50次,选取0、2、5、10、20、30、40、50代的菌株进行稳定性研究,生长曲线检测结果表明,工程菌在体外连续传代50次的过程中,其生长特性无明显变化,且与减毒猪霍乱沙门氏菌C500的生长特性一致,未因携带质粒发生明显变化;同时将各代菌液扩增沙门氏菌标志基因（invA）和毒力基因（crp）,结果表明多次传代后工程菌仍然具有沙门氏菌的特性,其减毒特性也无变化。各代菌液质粒酶切验证显示,多次传代并不影响质粒的稳定性,重组双表达质粒能够在沙门氏菌C500中维持正常拷贝功能。综上所述,该重组质粒和工程菌疫苗均具有良好的稳定性,可直接应用于动物免疫去势的研究。     

伪狂犬病病毒TK-/gI-株PK基因转移载体的构建及LacZ基因表达

伪狂犬病病毒TK-/gI-株基因组经AscⅠ酶切获得含PK基因的8.7 kb片段,将此片段克隆入pPolyⅡ载体的AscⅠ位点,获得中间载体P8-AA,将LacZ表达盒插入其SphⅠ/NdeⅠ位点,构建重组转移载体P8AA-lacZ,将其与伪狂犬病病毒TK-/gI-株基因组共转染PK-15细胞,细胞出现病变后通过覆盖含有X-gal的营养琼脂进行蓝白斑筛选,通过蚀斑克隆方法分离到重组体PRV(rPRV),且经过连续传代的rPRV仍能稳定的表达β-半乳糖苷酶活性.通过对重组病毒PRV-LacZ和亲本株TK-/gI-株TCID50的试验表明,PK基因的缺失对病毒增殖无影响.     

表达IBDV VP2蛋白重组减毒沙门菌活载体疫苗株的构建及免疫原性分析

通过PCR克隆出IBDV VP2基因,将其插入到表达载体pYA3341中,构建重组质粒pYA3341-VP2。将重组质粒电转入鼠伤寒沙门菌疫苗株X4550（缺失Asd、Cya、Crp基因）,获得重组疫苗菌株X4550（pYA3341-VP2）。进行重组菌VP2蛋白表达的鉴定;测定重组菌的稳定性、生长曲线、安全性以及小鼠免疫试验。结果表明,酶切鉴定证实重组质粒构建成功;SDS-PAGE和Western blot证实重组菌表达的VP2蛋白能与鸡抗IBDV阳性血清特异性结合;重组菌株在体外营养选择压力下,可稳定地携带重组质粒传代繁殖,在体内可稳定地定居于肠系膜淋巴结和脾脏;小鼠口服试验证实重组菌无毒性作用;口服重组菌免疫小鼠,ELISA检测产生了抗IBDV抗体;中和试验表明产生的抗体具有中和活性。本试验成功构建了能稳定表达IBDV VP2蛋白的口服减毒鼠伤寒沙门菌疫苗株X4550（pYA3341-VP2）,为研究IBD口服基因工程疫苗奠定了基础。     

伪狂犬病病毒TKˉ/gIˉ株PK基因转移载体的构建及LacZ基因表达

伪狂犬病病毒TKˉ/gIˉ株基因组经AscⅠ酶切获得含PK基因的8.7kb片段,将此片段克隆入pPolyⅡ载体的AscⅠ位点,获得中间载体P8-AA,将LacZ表达盒插入其SphⅠ/NdeⅠ位点,构建重组转移载体P8AA-lacZ,将其与伪狂犬病病毒TKˉ/gIˉ株基因组共转染PK-15细胞,细胞出现病变后通过覆盖含有X-gal的营养琼脂进行蓝白斑筛选,通过蚀斑克隆方法分离到重组体PRV（rPRV）,且经过连续传代的rPRV仍能稳定的表达β-半乳糖苷酶活性。通过对重组病毒PRV-LacZ和亲本株TKˉ/gIˉ株TCID50的试验表明,PK基因的缺失对病毒增殖无影响。     

线粒体DNA缺失质粒pMDD-Z的构建及鉴定

分别以pEGFP-Mito和pAN4质粒为模板,扩增出MTS-EGFP和EcoRⅠ基因片段,利用快速体外基因重组技术-重组PCR,将两者连接得到MTS-EGFP-EcoRⅠ片段,构建克隆载体pTRE2hyg-EE,经AgeⅠ和NotⅠ双酶切得到MTS-EGFP-EcoRⅠ融合基因产物,连接克隆于真核表达质粒pEGFP-Mito后获得pMDD-Z质粒。琼脂糖凝胶电泳结果显示,MTSEGFP和EcoRⅠ基因片段大小分别是831 bp和860 bp。测序结果显示,插入pTRE2hyg--EE克隆载体中的MTS-EGFPEcoRⅠ片段大小1 672 bp,且基因序列正确,没发生点突变。琼脂糖凝胶电泳结果显示,pMDD-Z质粒的双酶切产物分别为1 587 bp的插入片段和4 024 bp的载体片段。测序结果显示,pMDD-Z质粒中含1 659 bp的开放阅读框,编码553个氨基酸,从N端至C端,分别为线粒体信号导肽、绿色荧光蛋白和限制性内切酶EcoRⅠ,且未发生移码突变。     

大肠杆菌融合基因K88ac-STⅡ的减毒鼠伤寒沙门疫苗菌的构建与表达

本研究为构建表达产肠毒素性大肠杆菌融合基因K88ac-STⅡ的无抗性减毒鼠伤寒沙门氏菌疫苗株,从质粒pET-K88ac-STⅡ中扩增编码融合蛋白K88ac-STⅡ的基因并插入线性T载体pBS-T中,经酶切、PCR、测序鉴定正确后,再用限制性内切酶切下,插入含有asd基因的表达载体pYA3334,构建pYA-K88ac-STⅡ重组质粒。重组质粒鉴定正确后电穿孔转入缺失腺苷酸环化酶基因（Δcya）、环腺苷酸受体蛋白基因（Δcrp）以及天冬氨酸p-半醛脱氢酶基因（Aasd）的鼠伤寒沙门菌（X4550）中,以获得重组菌株X4550（含pYA-K88ac-STⅡ）。结果显示该无抗药性的重组菌株在体外营养选择压力下,可较稳定地携带重组质粒传代繁殖,口服该疫苗菌株无明显的毒性作用。通过本试验成功构建了表达K88ac-STⅡ融合基因平衡致死的减毒鼠伤寒沙门重组菌X4550（含pYA-K88ac-STⅡ）。为防治仔猪腹泻提供了口服活菌疫苗候选株。     

猪日本乙型脑炎病毒NS1基因重组腺病毒的构建及表达

应用RT-PCR方法扩增出猪日本乙型脑炎病毒（JEV）的NS1基因,通过Sal Ⅰ＋EcoR Ⅰ双酶切后把该基因插入到经过同样双酶切的穿梭质粒pDC315中.重组穿梭载体经过双酶切和PCR鉴定后进行测序,序列测定正确.将获得的重组穿梭质粒与腺病毒骨架质粒共转染293细胞后获得重组腺病毒.PCR鉴定及间接ELISA检测的结果证明所构建的重组腺病毒成功地表达了JEV的NS1.     

猪繁殖与呼吸综合征病毒ORF7基因的克隆及其在毕赤酵母中表达

用RT-PCR扩增猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)重庆分离株C14-2的ORF7基因(384 bp),构建克隆质粒pMD19-T-ORF7,经EcoR Ⅰ /Not Ⅰ双酶切回收ORF7基因插入酵母表达载体pPIC9K,构建了重组表达质粒pPIC9K-ORF7,进行PCR鉴定和双酶切鉴定.鉴定的pPIC9K-ORF7经Sac Ⅰ线性化后电转化毕赤酵母宿主菌GS115,筛选获得阳性重组菌GS115(pPIC9K-ORF7),再经G-418/YPD筛选获得高拷贝重组菌,重组子经表型鉴定为Mut.重组菌GS115(pPIC9K-ORF7)经甲醇诱导表达,在96 h表达的N蛋白量最大,N蛋白经SDS-PAGE鉴定大小约为15 000;Western blot表明N蛋白能与美洲型PRRSV阳性血清发生特异性反应,具有良好的反应活性.本研究为开展PRRSV ORF7基因在毕赤酵母中表达及应用奠定基础.     

鸡致病性大肠杆菌O1、O2和O78的Ⅰ型菌毛结构基因的克隆、序列测定及同源性分析

提取鸡致病性大肠杆菌分离株O1、O2和O78的基因组DNA作为模板,用TD-PCR技术从其中分别扩增出了0.55kb的Ⅰ型菌毛结构基因(piliA).将扩增得到的piliA基因片段,用TA克隆的方法分别克隆进pGEM-T载体中,转化至受体菌JM109中,用Amp/IPTG/X-gal琼脂平板蓝白菌落筛选法,得到含阳性重组子的菌株,提取质粒用PstI单酶切及NcoI和PstI双酶切鉴定,结果证实,所构建的克隆质粒中均含有相应piliA基因.经DNA序列分析,其结构基因阅读框架大小为549 bp,但其中O1菌株Ⅰ型菌毛基因在第72位发生突变,有6个碱基插入.经DNA Star核酸分析软件分析,此3菌株的Ⅰ型菌毛基因的同源性为89.9%～92%.