猪胎儿神经干细胞的分离培养和分化

本研究旨在从猪胎儿脑组织中分离培养神经干细胞,观察神经干细胞生长特性和体外增殖、分化特点.利用神经干细胞培养体系,从胎龄30 d的猪胎儿脑组织中分离培养神经干细胞并诱导神经干细胞贴壁分化,采用RT-PCR技术检测干细胞和分化细胞表面标志或相关基因.结果成功分离培养出神经干细胞,神经干细胞具有分化潜能.神经干细胞中Nestin表达强阳性,β-actin、DCX、Hesl、Oct4、Desmin、CD-90、Nanog和Sox2表达阳性;体外诱导的神经干细胞可以分化为星形胶质细胞(表达GFAP)、少突胶质细胞(表达GalC)和神经元细胞(表达NF、NSE和MAP2).结果提示,从猪胎儿脑组织分离神经干细胞具有可行性和有效性,神经干细胞具有自我更新、增殖和分化潜能.     

妊娠中期猪羊水来源干细胞EGFP基因转化及体外分化

本研究旨在获得妊娠中期猪羊水来源千细胞,并通过用EGFP对干细胞进行标记,为以EGFP作为示踪标记对干细胞进行体内移植研究奠定基础.利用羊水来源干细胞培养技术体系,从胎龄60 d猪胎儿羊水中分离获得干细胞,通过脂质体介导转染将EGFP基因导入干细胞,诱导转基因干细胞向肌细胞和神经细胞分化,观察其分化特点.采用RT-PCR技术检测干细胞和分化细胞表面标志或相关基因.结果成功分离培养出妊娠中期猪羊水来源干细胞,并获得转EGFP基因干细胞.干细胞在表达EGFP的同时仍具有分化潜能.干细胞中Oct4、CD-90和Sox2表达阳性;体外诱导的干细胞能分化为肌细胞(表达myf-6和myoD)、星形胶质细胞(表达GFAP)、少突胶质细胞(表达GalC)和神经元细胞(表达NF、NSE和MAP2).研究表明,从妊娠中期猪胎儿羊水中分离干细胞具有可行性和有效性,转EGFP基因干细胞具有自我更新、增殖和分化潜能,可以用EGFP对羊水来源干细胞进行标记、追踪,为EGFP作为示踪标记对干细胞用于体内移植研究奠定了基础.     

牛胎儿神经干细胞的分离培养与鉴定

分别采用机械分离法和酶消化分离法从胎龄为3个月的牛胎儿脑组织中分离培养牛神经干细胞(Neural stem cells,NSCs),比较这2种方法对NSCs培养的影响。根据培养液中是否添加bFGF、EGF和FBS,选择不同的培养液培养NSCs,观察不同培养液对NSCs培养的影响,进而筛选出最适培养液。对NSCs及经诱导分化成的神经细胞进行生物学特性分析,包括细胞形态学观察和细胞免疫荧光检测。结果显示:组成成分为Neurobasal Medium+20μg/L bFGF+20μg/L EGF+20mL/L B27+100IU/mL青霉素+100IU/mL链霉素的神经干细胞培养液能够很好地支持牛胎儿NSCs的存活和增殖;机械分离法获得的牛胎儿NSCs的神经球数量和细胞活性要比酶消化分离法效果好;NSCs特异性标志物Nestin表达呈强阳性,Sox2、Nanog、Oct4和SSEA4等干细胞表面标志表达均呈阳性;经体外诱导的NSCs可分化为星形胶质细胞(表达GFAP)和神经元(表达βⅢ-tubulin)。结果表明,可从牛胎儿脑组织中分离培养出NSCs,NSCs可长期传代培养,具有分化功能。牛NSCs为克隆牛的供体细胞和转基因牛的受体细胞提供了细胞新来源。     

过表达Gata6诱导分离猪胚外内胚层干细胞样细胞

本研究对Gata6(G6)在猪诱导多能性干细胞(iPS细胞)以及胚外内胚层干细胞(XEN细胞)样细胞分离中的作用进行深入解析。从农大香猪的胎儿组织提取mRNAs,反转录为cDNAs,以此为模板克隆所需基因,构建逆转录病毒质粒pMXs-pOct4、pMXs-pSox2、pMXs-pKlf4、pMXs-pMyc、pMXs-pGata6、pMXs-pLin28、pMXs-pTbx3以及pMXs-pNanog,运用不同的基因组合感染猪胎儿成纤维细胞(PEF)。结果表明,Gata6与Oct4、Sox2、Klf4和mMyc(简称G6OSKM)共转染可以提高早期重编程效率,Gata6代替Oct4,与Sox2、Klf4和mMyc(简称G6SKM)可以诱导猪胎儿成纤维细胞为iPS(Induced pluripotent stem)细胞,但与OSKM(Oct4、Sox2、Klf4和mMyc)组相比,重编程效率下降。Gata6的过表达使获得的猪iPS细胞在重编程后期发生了分化,形态类似XEN细胞,这些细胞在小鼠胚外内胚层干细胞培养液培养可以维持XEN细胞的形态,表达胚外内胚层干细胞的标记基因,如Gata4、Gata6和Sox17。OSKM 4因子获得的猪iPS细胞过表达Gata6后,也可以产生胚外内胚层干细胞样细胞。综上表明,过表达Gata6可以进行猪胚外内胚层干细胞样细胞的分离,为从正常胚胎对猪XEN细胞的分离与建系,以及猪早期胚胎调控机制的解析提供理论依据。     

胎牛视网膜干细胞向神经细胞诱导研究

旨在研究胎牛视网膜干细胞(Retinal stem cells,RSCs)的分离、培养、鉴定及向不同类型细胞诱导分化等的生物学特性。采用机械吹打法从胎牛眼睫状体部细胞中分离RSCs,通过免疫荧光方法鉴定RSCs标志物Nestin、Pax-6和Chx-10,并诱导其向星形胶质细胞、神经元及少突胶质细胞诱导分化,检测其多向分化潜能。结果表明,机械吹打法获得的胎牛RSCs不仅表达干细胞特有的标志,而且成功诱导分化为星形胶质细胞、神经元及少突胶质细胞。综上表明,胎牛RSCs具有良好的体外增殖能力和多向分化潜能。为今后视网膜干细胞的研究提供相应的理论依据。     

鸡脑神经干细胞体外诱导分化研究

为了研究鸡脑神经干细胞(neural stem cells,NSCs)体外的分离、培养及诱导分化等生物学特性,试验采用机械吹打法分离鸡脑神经干细胞,通过免疫荧光对体外培养鸡脑神经干细胞进行表面标记检测,并在适宜的诱导条件下向神经元细胞、星形胶质细胞和少突胶质细胞三个方向进行诱导,检测其多向分化潜能。结果表明:体外分离培养的鸡NSCs为目的细胞,并可向神经元细胞、星形胶质细胞和少突胶质细胞诱导分化。说明鸡脑NSCs具有良好的体外增殖能力和多向分化潜能。     

崂山奶山羊胎儿骨髓间充质干细胞（BMSCs）的分离培养及成神经诱导分化

旨在建立崂山奶山羊胎儿骨髓间充质干细胞（BMSCs）体外分离培养方法,并研究其生物学特性和成神经分化的能力。取怀孕3个月的崂山奶山羊胎儿股骨,分离培养骨髓间充质干细胞,并进行传代培养,测定其细胞倍增时间,利用RT-PCR技术检测Oct4、Nanog、Sox2基因的表达;取P3 BMSCs分别向成神经细胞进行诱导分化,并从组织学水平和基因水平进行鉴定。结果表明,分离得到的胎儿骨髓间充质干细胞大小较为均匀,呈梭形的成纤维细胞样,可表达Oct4、Nanog、Sox2基因;传代接种后第4天进入指数生长期,第8天进入平台期,前10代BMSCs的平均倍增时间为29.7 h;P3 BMSCs成神经诱导后,尼氏体经甲苯胺蓝染色后可见紫蓝色,其特异性表达基因ENO2和GFAP表达呈阳性。获得的崂山奶山羊BMSCs具有成神经分化潜能。     

猪乳腺干细胞的分离培养及EGFP基因转化

利用乳腺干细胞培养技术体系,从成年猪乳腺组织中分离培养乳腺干细胞,通过脂质体介导转染技术,将EGFP基因导入乳腺干细胞,诱导转基因乳腺干细胞向乳腺上皮细胞分化,观察其分化特点。结果成功分离培养出乳腺干细胞,获得转EGFP基因乳腺干细胞,它们在表达EGFP的同时仍具有分化潜能,能分化成梭形和扁平状细胞。结果表明,从成年猪乳腺组织中分离乳腺干细胞具有可行性和有效性,转EGFP基因乳腺干细胞具有自我更新、增殖和分化潜能,可以用EGFP基因对乳腺干细胞进行标记、追踪,为EGFP基因作为示踪标记对乳腺干细胞用于体内移植研究奠定了基础。     

猪骨髓间充质干细胞分离培养和诱导分化脂肪细胞

采用全骨髓培养法分离猪骨髓间充质干细胞(Mesenchymal stem cells,MSCs)并传代培养;取第4代纯化的MSCs在成脂诱导培养基中诱导分化;分化的成脂细胞用形态学和油红O染色法进行鉴定;用实时荧光定量PCR(Real-time PCR)检测成脂分化标志基因PPARγ2和LPL mRNA的表达情况。结果显示,分离培养的猪MSCs细胞经连续传代形态上无明显改变;MSCs在成脂分化培养液中诱导分化2d开始有少量脂滴出现,油红O染色成阳性,诱导18d成脂转化率可达59.8%;在诱导分化第5、10、15天时,PPARγ2mRNA相对表达量分别是(5.065±0.159)、(6.268±0.340)、(9.277±0.261),LPL mRNA的相对表达量分别是(10.995±1.473)、(13.130±0.712)、(15.762±0.934)。结果表明,用本诱导条件诱导猪MSCs向脂肪细胞分化,经形态学和油红O染色鉴定,成脂细胞分化率可达60%,且随分化时间的延长,脂肪细胞标志基因表达增加。     

浅谈猪诱导性多潜能干细胞的应用前景

诱导多潜能干细胞(induced pluripotent stem cells,i PS)是指通过在分化的体细胞中表达特定的转录因子来诱导其发生重编程而获得的可不断自我更新和具有多向分化潜能的细胞。诱导多潜能干细胞在生物医学领域具有重要的应用前景。而物种的大小以及解剖学和生理学特性决定了其是否适合用作临床模型。2009年,3个不同的研究小组几乎同时发表了获得猪诱导多潜能干细胞的文章。研究人员通过逆转录病毒载体将4个重编程因子(POU5F1,SOX2,c MYC和KLF4)导入体细胞,诱导产生具有胚胎干细胞(embryonic stem cells,ES)特性的诱导多潜能干细胞。研究发现,猪诱导多潜能干细胞比鼠诱导多潜能干细胞更接近人胚胎干细胞和人诱导多潜能干细胞。假如可以建立特定的猪诱导多潜能干细胞诱导分化为特定的细胞系,那么就有可能通过这些动物去检测诱导多潜能干细胞在基因治疗中的安全性和有效性。