PRRSV美洲型经典株、变异株和疫苗株多重RT-PCR鉴别检测方法的建立及应用

为建立猪繁殖与呼吸综合征病毒（porcine reproductive and respiratory syndrome virus,PRRSV）的快速鉴别检测方法,本研究针对PRRSV美洲型经典株、高致病性变异株以及TJM-F92疫苗株的Nsp2基因序列特点,设计2对特异性引物。经优化反应条件后,建立了能同时检测并区分PRRSV美洲型经典株、变异株及疫苗株的多重RT-PCR方法。该方法特异性强,与猪其他病毒间不存在交叉反应;敏感性高,对重组质粒标准品的检出下限为1.13×10³拷贝/μL。应用所建立的方法对349份临床疑似病料进行检测,结果检出PRRSV阳性119份,其中美洲型经典株5份、变异株107份、TJM-F92疫苗株7份,且有变异株和TJM-F92疫苗株混合阳性7份。表明本研究成功建立了PRRSV美洲型经典株、变异株及TJM-F92疫苗株的多重RT-PCR鉴别检测方法,可用于PRRSV的临床检测及流行病学调查。     

实时荧光RT-PCR鉴别检测美洲型PRRSV及其变异株

本研究建立了美洲型猪繁殖与呼吸障碍综合征病毒(Porcine reproductive and respiratory syndrome virus,PRRSV)通用实时荧光RT-PCR和PRRSV变异株特异性实时荧光RT-PCR检测方法,对方法的灵敏度和特异性进行了验证,并对24个临床可疑样品进行检测.结果显示,实时...     

猪繁殖与呼吸综合征病毒经典株与变异株RT-PCR鉴别诊断方法的建立及应用

本试验旨在建立一种快速的猪繁殖与呼吸综合征(porcine reproductive and respiratory syndrome,PRRS)经典株和变异株的鉴别诊断方法。根据GenBank中已发表的猪繁殖与呼吸综合征病毒(porcine reproductive and respiratory syndrome virus,PRRSV)经典株与变异株Nsp2基因序列,设计1对特异性引物,建立能鉴别诊断PRRSV经典株和变异株的RT-PCR检测方法;该方法能从经典株与高致病性株PRRSV基因组中分别扩增出549和459 bp的特异性片段;该方法对猪瘟病毒、猪乙型脑炎病毒、猪流行性腹泻病毒、猪传染性胃肠炎病毒、猪伪狂犬病毒、猪圆环病毒2型、猪细小病毒的扩增结果均为阴性;该方法能分别检测出1 pg经典株和0.1 pg变异株RNA含量。建立的RT-PCR鉴别检测方法具有良好的特异性、敏感性、重复性,可以准确、快速鉴别出PRRSV经典株与变异株,将为猪繁殖与呼吸综合征病毒的临床诊断、病料检测和分子流行病学调查等提供一种高效、快速、特异、灵敏的鉴别诊断方法。     

鉴别欧洲型和美洲型PRRSV荧光定量RT-PCR方法的建立

为了建立鉴别欧洲型和美洲型猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)的荧光定量RT-PCR方法,根据欧洲型和美洲型PRRSV的M基因保守序列设计特异性的引物和不同荧光标记的TaqMan荧光探针,通过优化反应体系和扩增条件,建立了能够鉴别欧洲型和美洲型PRRSV的双重双色荧光定量RT-PCR方法。该方法的重复试验表明其组内和组间的变异系数最高分别为1.30%和1.96%;灵敏性及特异性试验表明其检测下限为1×101copies/μL,而且与其他一些猪源病毒无交叉反应,具有良好的特异性。该检测方法的建立为不同型别的PRRSV快速诊断提供了有效手段,能够应用于临床样品检测。     

高致病性PRRSV变异株与经典株混合感染的研究

应用RT-PCR技术对来自广东省某猪场患有明显呼吸道临床症状和高热死亡的仔猪肺脏组织进行检测,结果初步鉴定为PRRSV高致病性变异株(YGhp株)与经典株(YGcl株)混合感染.进一步对2个毒株的NSP2基因进行序列分析,结果发现YGhp株与VR-2332、JXA1和Lelystad株的核苷酸同源性分别为75.1%、99%和35%,而YGcl株与上述毒株的同源性分别为99%、77.7%和34.5%,表明YGhp株为高致病性变异株,YGcl株为经典株,均属美洲型. 高致病性PRRSV变异株与经典株混合感染属非常罕见.     

PRRSV高致病性毒株RT-PCR鉴别诊断方法的建立

根据GenBank中已发表的PRRSV的NSP2基因序列,设计一对特异性引物。针对经典型毒株与高致病性毒株,采用RT-PCR方法扩增,可分别扩增出相应的576bp,486bp的目的片段。从而在检测PRRSV的基础上,进一步区分PRRSV的经典型和高致病性毒株。通过对扩增条件的筛选,成功地建立了猪繁殖与呼吸综合征经典型与高致病性毒株的RT-PCR鉴别诊断方法,且为PRRSV分离株的鉴定分型及NSP2功能研究奠定了基础。     

同时检测美洲型及欧洲型PRRSV的多重RT-PCR检测方法的建立及应用

为建立猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)的快速鉴别检测方法,本研究针对PRRSV基因序列设计3对特异性引物,即第1对通用引物扩增美洲型和欧洲型病毒株ORF7基因(433 bp/398 bp)、第2对引物扩增美洲型经典病毒株和高致病性变异株(HP-PRRSV)Nsp2基因(338 bp/248 bp)、第3对引物扩增欧洲型病毒株ORF5基因(614 bp)。经过反应条件的优化,建立了能够同时检测并区分美洲型经典病毒株、HP-PRRSV株以及欧洲型病毒株的多重RT-PCR检测方法。该方法可以特异扩增3种病毒的基因,其重组质粒标准品的检出下限均为1.67×103拷贝;而与猪的其它重要病原均无交叉反应。应用该方法检测176份临床疑似病料样品,结果 PRRSV阳性45份,其中美洲型变异病毒株41份、经典病毒株4份,未检测到欧洲型病毒株。表明本研究建立的多重RT-PCR检测方法可以用于PRRSV的快速鉴别诊断和流行病学调查。     

荧光定量RT-PCR法对高致病性PRRSV变异株感染猪体内分布规律的研究

根据GenBank发表的高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)变异株Nsp2基因序列设计1对特异引物,以重组质粒作为阳性标准品,采用SYBR-Green Ⅰ嵌合荧光染料建立了1种荧光定量RT-PCR方法用于检测该病毒核酸载量,在101~106拷贝/μL范围内具有良好的线性关系,相关系数为R2=0.999 8,扩增效率为E=0.950,对质粒标准品最低检测限为12.8拷贝/μL,重复性检测的变异系数低于2.0%。用高致病性PRRSV变异毒株人工感染25日龄非免疫仔猪,对不同时间采集的血清进行了病毒核酸定量检测,结果表明病毒血症于攻毒后48 h被检测出,于7~10 d达到高峰,其病毒核酸载量能达到106拷贝/μL。试验猪临床表现为体温升高至40.5℃以上,持续7~11 d;出现嗜睡、打喷嚏、眼结膜炎、偶见一过性的耳尖发绀、皮肤苍白或有小疱疹、被毛粗糙、消瘦、便秘、后躯无力等临床症状。感染猪发生高热期与毒血症消长规律有一定相关性。对人工感染猪体内病毒分布检测结果表明,以多种脏器均有病毒存在,如扁桃体、淋巴结、心脏、肾脏中含量较高,肝、脾脏和肺次之,脑组织中也检测到病毒存在。试验表明,该方法可用于PRRSV变异毒株核酸定量检测,为该病毒致病性、致病机理、疫苗免疫及诊断等方面的研究提供了技术手段。     

猪繁殖与呼吸综合征病毒传统毒株与变异毒株的鉴别诊断

从山东各地猪场采集了50份疑似猪繁殖与呼吸综合征(PRRS)感染的病料,采用RT-PCR技术扩增出PRRS病毒(PRRSV)的ORF7基因和Nsp2基因,并对Nsp2基因进行了序列同源性比较和遗传进化树分析,从RT-PCR阳性病料中进行病毒分离,然后应用Nsp2单克隆抗体对分离毒株进行鉴别诊断.结果表明,从8份病料中同时扩增出病毒的ORF7基因和Nsp2基因,序列分析显示其中6株病毒的Nsp2缺失30个氨基酸,与Nsp2单克隆抗体不发生反应,属于变异毒株;另外两株病毒的Nsp2未见氨基酸缺失,与Nsp2单克隆抗体发生特异性反应,属于传统毒株.序列同源性和系统进化分析表明,6株变异毒株与其他高致病性毒株亲缘关系很近,而与经典毒株的遗传距离较远.     

PRRSV经典株与变异株RT—PCR鉴别方法的建立及应用

根据高致病性堵繁殖与呼吸综合征病毒（PRRSV）Nsp2基因的缺失信息,设计了3条特异性引物。通过对PCR体系、温度及循环次数等条件进行优化,建立了一种能够鉴别诊断高致性PRRSV和经典PRRSV的RT—PCR方法。应用此RT—PCR方法,对来自江西周边地区的283份临床病料进行检测,204份结果为PRRSV阳性,阳性率72．08％。单纯PRRSV变异株感染163份（163／283）,占57．60％;PRRSV经典株与PRRSV变异株混合感染39份（39／283）,占13．18％;单纯PRRSV经典株感染仅为2份（2／283）,仅占0．71％。由此说明目前主要流行的还是高致病性PRRSV,PRRSV变异株阳性率很高,可能与该病毒在猪群中的持续感染特性有关。     

2007-2010年江苏地区猪繁殖与呼吸综合征病毒RT-PCR检测及部分Nsp2基因序列分析

本研究参考GenBank已发表的猪繁殖与呼吸综合征病毒（Porcine reproductive and respiratory syndrome virus,PRRSV）Nsp2基因序列,在高致病性病毒Nsp2基因缺失区的两端保守区设计并合成了一对引物,建立并优化了能够区分经典PRRSV和高致病性PRRSV的RT-PCR诊断方法,并利用该方法对2007～2010年间江苏地区的45份可疑临床病料进行了检测。结果表明临床病料阳性率为40％,所有毒株均属于高致病性毒株。对PRRSV阳性病毒的Nsp2基因序列分析表明,所有18株PRRSV均属于美洲型毒株,与中国高致病性PRRSV代表毒株JXA1、WUH1的氨基酸同源性分别在82．2％～97．6％、80．4％～95.3％。此外,18株病毒的Nsp2共同存在不连续的30个氨基酸缺失,缺失位置与同期中国高致病性PRRSV具有相同的特征。通过本研究掌握了江苏地区2007～2010年间PRRSV流行情况及Nsp2基因变异特征,为地方猪繁殖与呼吸综合征的临床诊断和防治提供参考依据。     

高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒细胞传代毒株反向遗传系统的优化

反向遗传系统已成为研究猪繁殖与呼吸综合征病毒（Porcine reproductive and respiratory syndromevirus,PRRSV）结构与功能非常重要的手段,并且在设计基因工程疫苗中发挥不可替代的作用。因而,有效提高感染性克隆拯救病毒的效率和稳定性以及降低经济成本是一个急需解决的课题。本研究在已构建完成的高致病性PRRSV细胞传代毒株反向遗传系统（pAJXM）的基础上,做了以下三方面的工作：（1）将T7启动子换成hCMV（人类巨细胞病毒,Human cytomegalovirus）启动子,从而全长cDNA克隆不需经过体外转录成mRNA的过程,直接通过DNA转染MARC-145细胞拯救病毒;（2）研究hCMV启动子的TATA框与病毒基因组5末端之间最佳的碱基数目,使体内转染获得的病毒基因组5末端序列为病毒的真实序列;（3）在病毒基因组3末端添加丁型肝炎病毒核酶（delta hepatitis virus ribozyme,HDVr）序列,体内转染获得的病毒基因组3末端的非病毒序列通过核酶自动去除。研究发现,基于DNA转染的反向操作系统是可行的,并且hCMV启动子的TATA框与病毒基因组5末端之间的碱基数目设置为25和在病毒基因组3末端添加HDVr序列后,能够有效地提高全长感染性cDNA克隆的病毒拯救效率和稳定性。     

猪繁殖与呼吸综合征疫苗佐剂研究进展

疫苗免疫是预防和控制传染病的主要措施,但对于猪繁殖与呼吸综合征,疫苗免疫存在免疫效率低与安全性差的问题,效果并不理想。因此,如何在安全剂量下提高动物机体的免疫力,成为疫苗研究的热点之一。试验证明细胞因子、化学试剂和微生物产物等几种免疫佐剂可以增强猪繁殖与呼吸综合征疫苗的免疫效果。在研究的9个疫苗佐剂中,IL-2、IL-12、IFN-α、poly IC和poly ICLC、CpG ODN等能增强猪繁殖与呼吸综合征疫苗的细胞免疫效应;CpG ODN和霍乱毒素能显著提高猪繁殖与呼吸综合征疫苗的抗体产生水平;IL-2和CpG ODN在临床实验中能增强疫苗对实验动物的保护,是最具潜力的免疫佐剂。     

2010年国内部分省份猪场常见病毒性疾病的病原学调查

随着规模化养猪业的发展,传染性疾病越来越多,混合感染或多重感染十分普遍,给疾病的诊断和预防带来很大困难。本文将我们实验室2010年分别采自福建、广西、河南、上海、内蒙、浙江、江苏和山西等地发病猪场的185份病料,通过RT-PCR和PCR方法对其进行猪繁殖与呼吸综合征病毒（Porcine reproductive and respiratory syndrome virus,PRRSV）、猪繁殖障碍的猪瘟病毒（Classical swine fever virus,CSFV）、猪圆环病毒2（Porcine circovirus type 2,PCV2）、猪细小病毒（Porcine parvovirus,PPV）、猪伪狂犬病毒（Pseudorabies virus,PRV）、细环病毒2（Torque teno virus 2,TTV2）等病毒检测。结果表明在所检的病料中PRRSV、PCV2和TTV2的阳性率比较高,分别为49.2%、62.2%和95.1%。有些地方TTV2的阳性率高达100%;同时,还存在很普遍的PRRSV与PCV2、PRRSV与TTV2、PCV2与TTV2等混合感染,混合感染率分别为27.6%、45.4%、58.4%;以及PRRSV、PCV2与TTV2的三重感染率为24.9%。同时对部分PRRSV阳性病料的PRRSV GP5和nsp2基因分别进行测序,分析测序结果表明病料中的PRRSV的GP5和nsp2序列与PRRSV HuN4株的相应序列的亲缘关系分别在98.2%和96.2%以上,且在nsp2区域都存在30个不连续氨基酸的缺失,说明现在临床中所流行的PRRSV可能仍是与高致病性PRRSV基因型相似的病毒。通过本文可以及时了解当前养猪场的病毒性疾病的流行情况,为猪场病毒性疾病的防控提供依据。     

1株NADC30-like重组猪繁殖与呼吸综合征病毒的分离鉴定及遗传变异分析

为研究山东地区猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)流行病毒株的遗传变异情况,本研究从山东省威海市某疑似猪繁殖与呼吸综合征(PRRS)发病猪场采集的猪肺脏组织中分离到1株PRRSV,命名为SDwh,并对其进行了全基因组序列测定、遗传演化分析和重组分析.结果显示:该病毒株在Marc-145细胞上生长良好,可见明显细胞病变;全基因组演化分析和同源性比对分析结果显示,SDwh株与美国病毒株NADC30和中国的NADC30-like位于同一分支;与北美病毒株NADC30的同源性最高,为93.1%;与我国分离的NADC30-like病毒株CHsx1401、JL580的同源性分别为91.1%和88.4%;与北美经典病毒株VR2332、中国HP-PRRSV JXA1和HuN4的同源性均为85.3%;与欧洲型病毒株Lelystad-virus(LV)同源性最低,为60.6%.与VR2332相比,Nsp2氨基酸序列比对结果显示,SDwh株存在NADC30-like病毒株典型的131个不连续氨基酸的缺失,同时在584~585位缺失2个氨基酸;GP5氨基酸序列比对结果显示,SDwh在GP5抗原表位上有氨基酸的突变.全基因组重组分析结果显示,SDwh株是一株重组病毒株,为NADC30与JXA1-P80的重组病毒,潜在的重组位点位于Nsp2中(2066 nt).本研究结果为PRRSV流行株的重组、演化分析和防控提供借鉴意义.     

种公猪精液中猪瘟和蓝耳病病毒混合感染的快速检测

参考GenBank公布的猪蓝耳病病毒(PRRSV)VL2332株、LV株以及猪瘟兔化弱毒(CSFV)C株的基因序列,各设计合成了一对引物,建立了在相同PCR扩增条件下能同时检测PRRSV和CSFV的RT-PCR方法。对2003~2004年期间江苏、浙江、安徽、福建、上海等省市的17个大中型猪场送检的186份种公猪精液进行了检测,结果18份呈PRRSV阳性,24份呈CSFV阳性,其中有11份为PRRSV和CSFV的混合感染,约占送检精液样品的5.91%。试验结果表明,所建立的RT-PCR方法可用于精液中这2种野毒感染的快速鉴定和分子流行病学调查。     

逆转录过程对猪繁殖与呼吸综合征病毒定量检测的影响

为探讨逆转录过程对猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)定量检测的影响,本研究针对PRRSV保守性序列设计引物,优化反应体系及反应条件,建立准确检测PRRSV的数字PCR方法,并选择5种不同逆转录试剂盒,分析逆转录过程对数字PCR检测结果的影响。结果表明,建立的数字PCR方法线性关系良好(R^2为0.9995及0.9999),重复性良好(变异系数1.01%);利用不同逆转录试剂盒得到的定量结果存在显著性差异,揭示逆转录过程是影响RNA病毒定量检测的关键因素,提示实验过程中不同逆转录试剂盒的选用需要考察与分析。     

不同免疫方式对仔猪免疫高致病性猪繁殖与呼吸综合征、猪瘟、猪口蹄疫三种疫苗抗体水平的影响

采用不同的免疫方式,对38头36~38日龄健康仔猪进行高致病性猪繁殖与呼吸综合征、猪瘟、猪口蹄疫3种疫苗进行免疫,分别于免疫前（0 d）和免疫后15、30、45、60、90 d采血进行这3种疫病抗体检测。结果发现效果最好的方法是先免疫猪瘟和口蹄疫疫苗14 d后再免疫高致病性猪繁殖与呼吸综合征疫苗;其次是猪瘟疫苗和高致病性猪繁殖与呼吸综合征疫苗分别释稀后混合为1针,口蹄疫疫苗另作1针同时分点注射;免疫效果最差的是高致病性猪繁殖与呼吸综合征、猪瘟、猪口蹄疫3种疫苗同时分3点注射。     

猪繁殖与呼吸综合征病毒ORF5a/ORF5重叠区的分离

以两个不同基因型的猪繁殖与呼吸综合征病毒(Porcine reproductive and respiratory syndrome virus,PRRSV)感染性克隆为平台进行反向遗传操作,利用SOE-PCR将I型PRRSV的ORF2～5a替换进II型PRRSV的相应区域,旨在将I型PRRSV的5a从ORF5中独立出来进而研究5a蛋白的功能,同时探讨两型PRRSV的结构蛋白结构与功能关系。研究结果表明,I型PRRSV的ORF2～5a序列能稳定存在于嵌合病毒基因组内,表达的相应蛋白能在II型PRRSV中发挥同样功能。本研究首次将PRRSV的ORF5a序列从ORF5中独立出来,为进一步研究5a蛋白的结构与功能提供了理论依据和基础材料。     

猪瘟病毒和不同型猪繁殖与呼吸综合征病毒的多重RT-PCR检测方法的建立

为建立能同时检测猪瘟病毒(CSFV)和猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)的方法,针对CSFV和PRRSV的基因序列设计3对特异性引物,第1对引物扩增CSFV毒株NS2基因508 bp片段,第2对引物扩增PRRSV美洲型经典毒株和变异毒株Nsp2基因338 bp/248 bp片段,第3对引物扩增PRRSV欧洲型毒株ORF5基因614 bp片段.经过反应条件的优化,建立了能同时检测并区分CSFV毒株和PRRSV美洲型经典毒株、变异毒株及欧洲型毒株的多重RT-PCR方法.该方法可以特异扩增CSFV和PRRSV,而与猪口蹄疫病毒(FMDV)、猪伪狂犬病病毒(PRV)、猪细小病毒(PPV)、猪圆环病毒2型(PCV-2)均无交叉反应;对CSFV和PRRSV 4种重组质粒标准品的检出下限均为1.67×103拷贝/μL.对采集的106份临床疑似病料进行检测,结果CSFV和PRRSV变异株混合阳性4份,占3.77 ％(4/106);CSFV阳性7份,占6.60％(7/106);PRRSV变异株阳性17份,占16.04 ％(17/106).结果表明,建立的多重RT-PCR检测方法可以用于CSFV和PRRSV的临床快速鉴别诊断和流行病学调查.