猪圆环病毒2型、猪繁殖与呼吸综合征病毒和猪瘟病毒混合感染的多重PCR诊断

试验采用猪繁殖障碍性病毒性疫病六重PCR检测方法对贵州省安顺某猪场送检的病死仔猪进行了猪伪狂犬病毒(PRV)、猪细小病毒(PPV)、猪圆环病毒2型(PCV2)、猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)、猪瘟病毒(CSFV)和日本脑炎病毒(JEV)的快速检测,结果表明该猪场送检的仔猪同时感染PCV2、PRRSV和CSFV。     

北疆规模化猪场CSFV、PRRSV、PRV血清抗体水平监测及分析

为了解北疆地区规模化猪场猪瘟,蓝耳,伪狂犬gE抗体水平,本研究选取3个规模化种猪场,共采集296份血清,采用ELISA抗体检测方法,对其进行猪瘟,蓝耳,伪狂犬gE血清抗体检测工作.结果显示,育肥猪猪瘟抗体阳性率为64.40％ ～100.00％,蓝耳病抗体阳性率为72.00％ ～98.33％,伪狂犬gE抗体阳性率为23....     

某猪场CSFV、PRRSV、PCV2和PRV多重感染病例的报道

贵州省某种猪场一周内连续发生30余头母猪早产和(或)产死胎症状,猪场工作人员向笔者实验室送检同窝流产死胎4只。根据流行情况和临床特征,初步判断与病毒感染有关。为筛查具体病原,本实验室将送检死胎组织混合样品分别对CSFV、PRRSV、PCV2、PRV、PPV和JEV六种常见病毒进行病原核酸检测,结果显示该猪场发病猪存在CSFV、PRRSV、PCV2和PRV的多重感染。     

猪瘟病毒持续性感染的分子机制

猪瘟病毒的持续性感染是典型急性猪瘟感染以外的一种感染形式,在这类感染中,感染猪并不表现明显的临床症状,但是却长期携带病毒成为重要的传染源。研究表明,猪瘟病毒是通过对细胞溶解性感染的调节,引起树突状细胞无应答,诱导淋巴细胞凋亡,抑制I型干扰素产生和囊膜糖蛋白E2变异等多个方面来逃脱机体的免疫应答,从而建立持续性感染。     

检测CSFV、PRRSV和JEV感染的多重RT-PCR方法的建立及初步应用

为了建立1种能够应用于临床样本可以同时检测CSFV、PRRSV、JEV 3种RNA病毒感染的多重RT-PCR方法。根据GenBank收录的CSFV、PRRSV、JEV的基因组全序列,选择3种病毒的特异性保守区序列设计了3对特异性引物,优化多重RT-PCR反应条件,建立了能够同时检测3种病毒混合感染的多重RT-PCR诊断方法。特异性分析表明,应用该方法分别从CSFV、PRRSV、JEV毒株以及3种病毒的混合物中扩增出大小分别为777、451、605bp的3条特异性条带,其他对照组检测均为阴性;敏感性分析表明,该方法最低检测量分别为14.2、10.0、8.0pg的CSFV、PRRSV、JEV的RNA;初步应用性试验表明,52份疑似病料中PRRSV、CSFV和JEV的阳性率分别为46.1%、21.1%和1.92%;CSFV和PRRSV混合感染阳性率为21.1%。CSFV、PRRSV和JEV混合感染阳性率为3.84%。本试验建立的多重RT-PCR检测方法具有敏感性高、特异性强、重复性好的特点,可以有效检测CSFV、PRRSV和JEV的混合感染。     

PRRSV感染会影响PAM对副猪嗜血杆菌的杀灭作用

为了发现PRRSV感染如何改变PAMs对副猪嗜血杆菌的吞噬和破坏功能,测定吞噬比率时,分别通过体外和体内两种感染途径对其变化进行测定,其中体外试验主要是将细胞与病毒直接接触后收集测定,体内试验是将感染PRRSV猪的PAMs收集测定。体外试验结果显示,PAMs中的副猪嗜血杆菌仅在PRRSV感染的早期阶段(感染后2小时)增多;而体内试验结果显示,PRRSV感染猪的PAMs,并使其对细菌的吞噬率在感染的后期发生明显变化;综合吞噬率的下降结果,我们发现在感染后第7天PAMs的杀菌功能出现显著下降。据此,我们假设当猪感染PRRSV后,随着超氧化物阴离子的减少,PAMs的杀菌功能将明显下降。     

百色市猪瘟免疫效果分析及CSFV感染状况调查

在2006年~2009年期间利用正向间接血凝试验对百色市2 036份猪血清中猪瘟免疫抗体进行监测,并对2009年使用猪瘟细胞苗和猪瘟兔源脾淋苗的免疫效果进行分析。结果发现2006年~2009年百色市规模猪场的猪瘟免疫抗体水平高于散养户,散养户的猪瘟免疫抗体水平呈逐年上升趋势,规模猪场的抗体水平除2008年略有下降外,也呈逐年上升趋势。总体上说猪瘟细胞苗的免疫效果优于猪瘟兔源脾淋疫苗,规模猪场的免疫效果优于散养户。此外,用RT-PCR方法对2006年~2009年间百色市发病猪的病料进行CSFV检测,结果发现百色市猪的CSFV感染率呈逐年下降趋势。     

猪瘟疫苗免疫猪群中抗体水平的检测

应用ＰＰＡ－ＥＬＩＳＡ技术对猪瘟疫苗免疫猪群中的血清抗体水平进行了检测。共检测４个县的猪血样４８６份,检出血清抗体阳性４４９份,阳性率为９２．３９％,群体免疫保护率在８４．２４％～９４．２５％之间,群体均分值在８９．５～９８之间。     

猪瘟病毒和猪繁殖与呼吸综合征病毒混合感染的诊断

2007年,山东4个养猪场暴发了多起母猪妊娠后流产,1月龄仔猪大量死亡为主要特征的传染病。对送检的病猪进行了病原分离、病理组织切片观察、免疫荧光检测及动物试验,结合流行病学、临床症状,确诊该养猪场混和感染了猪瘟病毒和猪繁殖与呼吸综合征病毒,为控制猪病提供了重要的依据。     

PCR检测临床病例中PCV-2、PRRSV和CSFV的混合感染

参照GenBank中已发表的有关基因序列,分别设计合成针对PCV-2、PRRSV和CSFV的3对引物,分别建立检测临床病例中PCV-2、PRRSV和CSFV感染的PCR或RT-PCR方法。结果显示,扩增产物经琼脂糖凝胶电泳,分别各呈现1条大小约1154,372,375bp的特异条带。采用建立的PCR方法对江西各地发病猪和死亡猪的133份临床病料进行PCV-2检测,结果总检出率53.38%(71/133)。在71份PCV-2阳性的病料中检测出PRRSV20份,阳性率28.17%(20/71);CSFV9份,阳性率12.68%(9/71);PRRSV和CSFV共同感染9份,阳性率12.68%(9/71)。     

PMWS患病猪群中PCV2与CSFV、PPV、PRRSV混合感染的调查

应用套式PCR方法对采自辽宁、河北、河南、湖北、湖南、山东、浙江、福建和广西9个省份的733份临床发病猪肺脏和淋巴结样品进行了PCV2的检测,然后对鉴定为PCV2阳性的283份病料再分别进行PRRSV、PPV和CSFV的检测,以确定猪群中PCV2与CSFV、PRRSV和PPV双重感染情况,结果表明:CSFV、PRRSV和PPV阳性样品分别为74份、94份和46份,阳性率分别为26.1%、33.2%和16.3%。表明这些地区发病猪群中PCV2与这三种病毒的双重感染普遍存在,其中以PCV2和PRRSV的双重感染较为突出;但在河北和湖北两省,则以PCV2与CSFV的双重感染为主。     

PRRSV、CSFV混合感染病例的实验室诊断

为确诊贵阳市某猪场疑似猪繁殖与呼吸障碍综合征(PRRS)死亡病例,对死亡猪进行剖检及实验室诊断。病理剖检可见,病死猪出现淋巴结肿大充血、肺部有坏死灶、胸腔有大量积液等病理变化;同时采集病理组织应用分子生物学和细菌学方法进行PRRSV(普通毒株和Nsp2变异毒株)、猪瘟病毒核酸检测和细菌分离鉴定。结果显示:该病例为PRRSV(普通毒株)、CSFV混合感染所致。     

多重RT-PCR检测PRRSV和CSFV及PRRSV ORF5基因遗传变异分析

根据猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)和猪瘟病毒(CSFV)的基因组序列设计了2对特异性引物,建立了同时检测PRRSV和CSFV的多重RT-PCR方法.2008年1月至2009年12月期间,采集山东各地71个不同规模猪场及农村散养户212份病料,采用建立的多重RT-PCR技术同时检测PRRSV和CSFV的感染状况.检测结果显示,病料中高致病性PRRSV占57.1%(121/212),CSFV占29.2%(62/212).应用RT-PCR方法扩增山东不同地区16株PRRSV的ORF5基因,并进行了序列分析.结果表明,16株PRRSV的ORF5基因核苷酸同源性为97.0%～100.0%;与参考变异毒株JXA1、传统毒株VR2332核苷酸同源性分别为98.0%～99.5%和86.4%～87.7%.推导的氨基酸序列分析表明,16株毒株GP5蛋白氨基酸不存在缺失,但存在位点突变.12株在非中和表位29位点与准种进化34位点发生了突变,分别由V→A和N→S;1株在非中和表位185位点发生突变,由A→V;这与2007年流行的PRRSV毒株JXA1、HUN等不同.     

实时荧光定量PCR检测猪病料中的PRRSV与CSFV

根据GenBank发表的PRRSV、CSFV基因核苷酸序列,应用Primer 5.0软件分别设计了2对特异性引物.以重组质粒作为阳性标准品,应用SYBR Green I real-time PCR检测两种病毒的核酸含量.在样品稀释到10.1～10<'-11>拷贝时,能得出良好的线性关系,相关系数为R<'2>=0.999...     

CSFV与PRRSV双重RT-PCR检测方法的建立及应用

为建立能同时检测猪瘟病毒(CSFV)和猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)的RT-PCR方法,根据CSFV和PRRSV的保守区域各设计1对特异性引物,预期扩增片段大小分别为356和546 bp,通过对反应条件的优化及特异性、灵敏性和重复性试验,建立了CSFV和PRRSV的双重RT-PCR方法。结果显示:该方法能特异检测CSFV和PRRSV的cDNA最低量分别为0.96、1.48 ng,而对猪伪狂犬病毒(PRV)和猪圆环病毒(PCV)检测结果均为阴性;利用建立的双重RT-PCR对云南省部分地区送检的174份疑似CSFV及PRRSV感染的病料进行检测显示,CSFV感染率为24.14%,PRRSV感染率为47.70%,CSFV与PRRSV的混合感染率为16.67%,检测结果与单一RT-PCR结果相一致,且具有良好的可重复性;利用免疫组织化学方法对部分检测结果加以验证,验证结果与检测结果均一致。本研究成功建立了CSFV和PRRSV双重RT-PCR检测方法,为二者的快速检测和分子流行病学调查提供了一种有效手段。     

SIV与PRRSV、CSFV、PCV-2和PRV交叉感染的检测

采用RT-PCR方法对37份疑似猪流感病毒(SIV)感染病料进行了病原学检测。同时,还运用PCR和RT-PCR方法对SIV阳性病料进行了猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)、猪瘟病毒(CSFV)、猪圆环病毒2型(PCV-2)和猪伪狂犬病毒(PRV)目的基因片段的扩增。结果,扩增出了SIV特异目的基因片段,且4份病料都为混合感染,感染状况分别为SIV/PRRSV/PRV,SIV/CSFV/PRRSV三重感染,SIV/PCV-2和SIV/PRRSV二重感染。     

多重PCR检测CSFV和PRRSV与PCV2

根据GenBank上猪瘟病毒(CSFV)、猪繁殖与呼吸综合征(PRRSV)和猪圆环病毒2型(PCV2)的已发表序列,分别设计并合成了3对特异性扩增引物,建立CSFV、PRRSV和PCV2单项PCR检测方法,分别扩增出预期的466 bp、202 bp和706 bp片段。在优化单项PCR反应条件基础上,建立了CSFV-PRRSV-PCV2多重PCR检测方法,为预防和控制上述三种病毒性传染病提供了一种快速、敏感、特异的检测方法。