陕西省部分地区PRRSV流行毒株ORF3和ORF5基因的遗传变异分析

为了解陕西省猪繁殖与呼吸综合征病毒(Porcine reproductive and respiratory syndrome virus,PRRSV)流行毒株的遗传和变异情况,对9份疑似感染PRRSV的病料用RT-PCR方法分别扩增ORF3和ORF5基因,并进行测序和序列分析。测序结果表明,ORF3基因在254-490和646-737位置之间发生不连续碱基突变;与GenBank已发表的国外毒株ORF3基因组比较,同源性为89.2%~94.8%,与国内发表的ORF3基因比较,同源性为88.8%~99.0%,其中与2009年陕西分离株(HQ843181.1)同源性为94.9%~98.7%,与2010年陕西株(KJ855518.1)同源性为94.9%~98.6%。ORF5基因突变主要在508-600碱基位置之间,与GenBank上已发表的国外毒株ORF5基因组比较,同源性为90.1%~92.1%,与国内发表的ORF5基因比较,同源性为89.6%~99.2%,其中与2009年陕西分离株(HQ843181.1)同源性为95.2%~98.4%,与2010年陕西株(KJ855518.1)同源性为95.2%~98.7%。ORF3和ORF5基因进化树中Wn-2、Ak-3和Tc-4毒株在同一个进化支上,之间亲缘关系近,Xy-1和Hz-5毒株分别在不同的进化分支上,与其他毒株遗传距离较远。陕西省PRRSV流行毒株的ORF5和ORF3基因组与国内PRRSV分离株相比较均有一定变异,且亲缘进化不完全相同。     

我国苏皖地区PRRSV Nsp2和ORF5基因的遗传变异分析

为了分析2009年安徽省和江苏省周边地区流行的猪繁殖与呼吸综合征病毒（PRRSV）的遗传变异特征,采用RT—PCR方法对该地区分离的22株PRRSV的Nsp2和ORF5基因进行了扩增、克隆和测序,并进行序列分析。结果表明：22株PRRSV均属于美洲型毒株,其中21个毒株的Nsp2存在30个氨基酸的不连续缺失,与高致病性PRRSV有相同的缺失特征;而且此21个毒株的ORF5基因推导的氨基酸序列也发生多处突变,集中出现在毒力相关位点、抗原表位和糖基化位点序列中。只有HZNJ株与疫苗株的同源性较高。进化树分析显示,21个分离株与高致病性PRRSV处在同一进化分支,而HZNJ株与疫苗毒株有较近的亲缘关系,进一步说明高致病性PRRSV已成为该地区的优势流行毒株。     

PRRSV分离株Nsp2基因和ORF5基因的遗传变异分析

为了解山东省PRRSV流行毒株的遗传变异情况和分子流行病学背景,对2007～2009年分离到的14株山东省内的PRRSV流行毒株进行了Nsp2和ORF5基因序列的测定和分析.结果显示,与参考毒株JXA1相比,14株PRRSV Nsp2与ORF5基因的核苷酸同源性分别达到96.1%～99.8%和98.0%～99.8%,氨...     

PRRSV分离株Nsp2基因和ORF5基因的遗传变异分析

为了解山东省PRRSV流行毒株的遗传变异情况和分子流行病学背景,对2007~2009年分离到的14株山东省内的PRRSV流行毒株进行了Nsp2和ORF5基因序列的测定和分析。结果显示,与参考毒株JXA1相比,14株PRRSV Nsp2与ORF5基因的核苷酸同源性分别达到96.1%~99.8%和98.0%~99.8%,氨基酸序列同源性分别达到92.9%~100%和97.5%~99.5%。序列分析结果表明,14株毒株在Nsp2蛋白内部均存在编码30个氨基酸的碱基对的不连续缺失;ORF5基因编码的GP5蛋白不存在缺失,但存在点突变。遗传进化分析表明,07年分离毒株JQ与参考毒株JXA1亲缘关系很近;09年分离的12株PRRSV,2株仍与国内2006~2007年间的分离株在同一分支,9株已经处在不同分支,1株单独处在一个分支。2007~2009年山东地区流行的PRRSV分离株具有年度特征,无明显的地域特征。     

2019—2021年我国部分地区PRRSV ORF5基因遗传变异分析

为了解2019—2022年我国南方地区猪繁殖与呼吸障碍综合征病毒（PRRSV）ORF5基因遗传变异情况,自广东、广西、湖南、江西4个省份的种猪场和育肥场,采集疑似PRRSV感染样品进行RT-PCR检测,并对部分阳性样品进行病毒分离培养和ORF5基因测序。结果显示：PRRSV总检出率为26.12%,其中育肥场场检出率（86.36%）高于种猪场（52.00%）;共成功分离到97株病毒并对其进行了ORF5测序分析,发现Sublineage 1.8占比最高（51.55%）,其次为Lineage 5(15.46%),Sublineage 1.5、Lineage 8、Lineage 3占比依次为13.40%、10.31%和9.28%;类NADC34毒株在2021年有3个省份（广东、广西和湖南）被首次检出,且当年检出率达13.40%。GP5蛋白分析结果显示,分离株中第13和151位氨基酸以及中和表位变异较多。对其中1株毒株进行重组分析发现,该毒株以类NADC30毒株为主要亲本,其多处基因组与JXA1和IA2014毒株发生了重组。结果表明：我国南方地区PRRSV流行较为普遍,尤其是在育肥猪群中;流行毒...     

2010年-2011年我国五省PRRSV分离株ORF5基因遗传变异分析

为了解2010年-2011年间我国5省猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)流行毒株的分子生物学特性及变异规律,应用Mcar-145细胞分离得到15株PRRSV,通过RT-PCR方法对15株PRRSV的ORF5基因进行扩增和序列分析.依据NCBI所下载的标准序列设计一对引物,对ORF5全长进行扩增(603 bp),分离株之间的核苷酸同源性为98.8％～99.9％,核苷酸推导的氨基酸同源性为95.5％～99.5％.15株PRRSV分离株与美洲型的PRRSV同源性较高,可推断均属美洲型.其中9株ORF5(151)氨基酸位点发生与HB-1相同的变异,即R151-K151,其余6株ORF5 (151)氨基酸位点与JAX1相同,即ORF5(151)为R.系统进化树表明,BFLN3-2010、BFSD1-2011和BFAH2-2011 3株与CH-1a在同一分支,属于第2亚群,BFLN2-2010等12株与JAX1在同一分支,属于第4亚群.     

2010年-2011年广东地区PRRSV Nsp2和ORF5基因的遗传变异分析

为了解2010年-2011年广东地区猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)流行毒株的遗传变异情况,采用RT-PCR方法扩增所分离的16株PRRSV的Nsp2和ORF5的基因,应用DNA Star、ClustalX2和MEGA5等对所得序列进行比对及遗传变异分析。16株PRRSV的Nsp2和ORF5基因的推导氨基酸序列同源性分别为75.3%～100%和87.5%～100%,与国内高致病性PRRSV代表毒株JXA1的氨基酸同源性分别为74.2%～98.2%和87.5%～99%。Nsp2遗传进化分析显示,这16株PRRSV均属于美洲型毒株,其中15株病毒与以JXA1为代表的国内流行毒株处于同一分支,属美洲亚群Ⅰ;另外1株病毒与VR-2332和疫苗株MLV处在同一分支,属美洲亚群Ⅱ。2010年-2011年广东地区流行毒株仍为高致病性PRRSV,且存在经典疫苗毒株MLV。     

2014年华南地区PRRSV ORF5基因的遗传变异分析

为了研究华南地区PRRSV的遗传变异情况,本研究对2014年华南地区16份PRRSV阳性样品的ORF5基因进行了RT-PCR扩增、克隆和测序,并将其进行序列比对和遗传进化分析。结果表明:本研究检测的16株PRRSV ORF5基因的核苷酸同源性为82.8%~100%,与JXA1,CH-1a以及VR2332核苷酸同源性分别为84.4%~99.3%,85.9%~95.0%和83.6%~89.2%。遗传进化树分析显示,所获得16株毒株序列中有13株属于以JXA1为代表的变异株亚群,另外3株属于以GM2,QYYZ为代表的新分支亚群。GP5氨基酸位点分析发现新分支亚群存在较为广泛的变异,尤其在信号肽区,诱导表位,中和表位及高变区。     

PRRSV ORF5基因和CSFV E2基因重组真核表达质粒的构建及小鼠免疫试验

根据猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)、猪瘟病毒(CSFV)已知序列设计3对引物,采用RTPCR方法扩增PRRSV ORF5基因和CSFV E2基因,目的基因依次插入真核表达载体pcDNA4.0,经PCR、酶切及测序分析,重组质粒构建成功,并命名为pcDNA4.0-ORF5-E2.重组质粒回收提纯后,以100 μg/只剂量免疫小鼠,免疫3次.三免后10 d采血并制备血清,用间接ELISA检测小鼠血清中PRRSV及CSFV抗体效价.结果显示,所构建的重组质粒能够诱导小鼠产生PRRSV及CSFV抗体.     

PRRSV ZQ-GD-2010株的分离及ORF5和ORF7基因的序列分析

为了给研制基因工程疫苗选取毒株奠定基础,研究采集广东肇庆某猪场疑似患高热症猪的病料,通过RT-PCR检测、病毒分离传代,证实分离到1株猪繁殖与呼吸综合征病毒,命名为ZQ-GD-2010株,并对其ORF5和ORF7基因进行序列测定,绘制遗传进化树。结果表明:该毒株为美洲型,其ORF5和ORF7基因核苷酸与近年来我国分离到的美洲型毒株的相似性为96%～100%,而与欧洲型毒株LV株的相似性仅为58.9%～62.8%;其与2007—2009年国内分离株的遗传演化关系较近。     

猪繁殖与呼吸综合征病毒ORF5基因的变异及其基因工程疫苗研究进展

ORF5基因编码的E蛋白是猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)的主要结构蛋白,糖基化的囊膜蛋白E蛋白具有良好的免疫原性,能够代替PRRSV诱导机体产生免疫应答,产生保护性中和抗体,是研发基因工程疫苗的优良候选基因之一,在防控PRRS方面有着重要的意义。目前PRRS的流行毒株存在着广泛的变异,尤其是稳定性较差的ORF5基因的变异给PRRSV的检测和防控带来很大的困难。本文就国内外学者对ORF5基因的变异情况以及基于PRRSV ORF5基因在基因工程疫苗方面的研究进展作了综述。     

实时荧光定量PCR检测猪病料中的PRRSV与CSFV

根据GenBank发表的PRRSV、CSFV基因核苷酸序列,应用Primer 5.0软件分别设计了2对特异性引物.以重组质粒作为阳性标准品,应用SYBR Green I real-time PCR检测两种病毒的核酸含量.在样品稀释到10.1～10<'-11>拷贝时,能得出良好的线性关系,相关系数为R<'2>=0.999...     

云南香猪PRRSV分离株ORF7基因遗传变异分析

为了解2014年云南省香猪群体中猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)的流行特征,将疑似猪繁殖与呼吸综合征(PRRS)病例肺脏和淋巴结研磨处理后接种Marc-145细胞进行盲传,传至第2代48 h时出现2株病毒致Marc-145 细胞聚集融合、巨细胞等病毒致细胞病变(CPE)效应现象,将其命名为YN-2XZ1和YN-3X...     

重庆地区流行的PRRSV的ORF5基因变异分析

为了分析重庆地区流行的猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)的ORF5基因变异情况,我们通过RT-PCR扩增采自重庆地区不同猪场高热病病猪肺组织样本中PRRSV的ORF5全序列,并对其进行生物信息学分析.结果8个病例样本中有5个成功扩增出ORF5全序列.系统进化分析表明它们与国内2006年～2007年间的分离株亲缘关系较近,而与更早的分离株和疫苗MLV株亲缘关系较远.此外,推导氨基酸序列分析表明重庆地区流行的PRRSV与以JXA1株等为代表的同期其它地区分离株比较在ORF5的2个线性抗原表位中均存在独特的变异.本研究结果不仅揭示了重庆地区流行的PRRSV ORF5基因的变异特征,而且提示在PRRSV的防控措施中ORF5基因的变异应受到高度的重视.     

PRRSV SC-GY变异株Nsp2、ORF5、ORF3基因遗传变异分析

为了监测PRRSV流行毒株的基因变异情况,采用RT-PCR方法对四川省广元市某疑似猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)发病猪场病料进行分子鉴定,获得1株PRRSV命名为SC-GY株,并对SC-GY株的Nsp2、ORF5及ORF3基因进行测序比对和系统进化树构建。结果表明,SC-GY株为Nsp2基因发生30个氨基酸不连续缺失、ORF3基因第17位插入1个丝氨酸(S)的美洲型高致病性PRRSV变异毒株,其Nsp2、ORF5、ORF3基因与VR2332、SC2012、CH-1a、JXA1、HUN4、NADC30、HENAN-XINX等国内外代表毒株的核苷酸同源性分别为70.3%~97.9%,82.4%~97.6%,83.1%~98.2%,编码氨基酸同源性分别为62.3%~96.3%,78.0%~95.7%,81.6%~96.5%;而与LV等欧洲型毒株的核苷酸同源性分别为18.9%,60.8%,63.7%,编码氨基酸同源性分别为14.0%,54.9%,57.2%。基因遗传进化树分析表明,SC-GY株与JXA1、TJ、HUN4等前期分离的毒株以及近期在四川周边分离的SC2012、SCwhn09CD、SCwhn14DY等毒株都相距较远。由此表明,该地区PRRSV在当前高频度活疫苗免疫下,流行毒株基因仍在不断变异,猪场应减少PRRSV活疫苗的免疫并加强对临床PRRSV流行毒株的监测。     

PRRSV GP5和PCV2 ORF2双基因共表达重组腺病毒的构建及鉴定

为构建猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)GP5基因和猪圆环病毒2(PCV2)ORF2双基因共表达重组腺病毒.将扩增的PRRSV GP5基因和PCV2 ORF2基因通过IRES元件串联,构建重组腺病毒穿梭质粒.Pme Ⅰ酶切线性化后,转化含有腺病毒骨架载体pAdeasy-1的大肠杆菌BJ5183感受态细胞,同源重组后筛选重组腺病毒质粒,经Pac Ⅰ酶切后转染293 A细胞进行包装,获得重组腺病毒.PCR鉴定表明重组腺病毒含有GP5和ORF2基因,western blot检测结果表明GP5基因和ORF2基因在293 A细胞内获得表达.     

Significance of genetic variation of PRRSV ORF5 in virus neutralization and molecular determinants corresponding to cross neutralization among PRRS viruses

A high rate of genetic and antigenic variability among porcine reproductive and respiratory syndrome viruses (PRRSVs) hampers effective prevention and control of the disease caused by PRRSV. The major envelope protein (GP5) encoded by the ORF5 of PRRSV has a critical role in inducing virus neutralizing (VN) antibody and cross protection among different strains of PRRSV. This study was conducted to identify sequence elements related to cross neutralization by comparing the ORF5 sequences of 69 field isolates in conjunction with their susceptibility to VN antibody raised against the VR2332 strain in vitro and in vivo. Five common variable sites (amino acid position 32–34, 38–39, 57–59, 137 and 151) were identified between susceptible and resistant viral isolates. Mutants whose ORF5 amino acid sequences were substituted with the sequences corresponding to the 5 identified common variable sites individually or concurrently were generated from a VR2332-backboned infectious clone by site mutagenesis. The change in the susceptibility of the mutants to VN antibodies specific for VR2332 or a heterologous PRRSV was assessed to determine the association of those 5 identified sites with cross neutralization. Among the five sites, the changes of amino acid sequences at three sites (32–34, 38–39, and 57–59) located in the N-terminal ectodomain of ORF5 significantly influenced the susceptibility of the mutant viruses to VN antibody, suggesting that sequence homology at these sites can be utilized as genetic markers to predict the degree of cross neutralization among different PRRSVs.     

辽宁省PRRSVLN／0901株ORF5基因遗传变异分析及其抗原位点预测

根据已发表的PRRSVORF5基因序列设计引物,经RT-PCR对辽宁省PRRSVLN／0901株0RF5基因片段进行扩增、克隆及测序,结果得到长度为739bp的0RF5基因完整序列,与已知代表毒株进行核苷酸及其编码氨基酸同源性比对和系统进化树分析,LN／09010RF5基因序列与VR-2332株同源性达到88．6％,而与LV株,则相差甚远,仅为61．7％,表明PRRSVLN／0901病毒株为美洲型,与CBB-1-F3T、GD2007、JXA1、BJ0708等毒株同源性高达98．7％～99．5％,表明该病毒与2006年以来国内的多数流行变异株遗传关系相近。通过对PRRSVI,N／0901ORF5进行氨基酸疏水性及其编码蛋白跨膜区预测分析,表明该毒株ORF5具有多个抗原优势位点,与国内其他毒株既有共同位点又有区别位点,可以做为辽宁地区开发研制PRRS基因工程疫苗的重要蛋白基因。