月季‘月月粉’RcDREB2A的克隆与表达分析

以月季‘月月粉’（Rosachinensis‘OldBlush’）扦插苗为试验材料,基于干旱胁迫的转录组克隆得到响应干旱胁迫的AP2/ERF类转录因子基因RcDREB2A,对其进行生物信息分析、表达分析以及转录因子特性分析。结果表明,RcDREB2A包含1 155 bp的开放阅读框,编码384个氨基酸,在75～142位氨基酸区域含有1个保守的AP2结构域;系统进化树分析表明RcDREB2A与野草莓（Fragaria vesca）FvDREB2A(XP＿004307690.1)亲缘性最高;RcDREB2A蛋白预测分子量为5 737,理论等电点为4.75,无跨膜结构域,不含信号肽;定位于细胞核,没有转录激活活性;RcDREB2A在月季‘月月粉’叶片中表达量较高,且能被ABA、干旱、低温、盐胁迫处理诱导表达上调。以上结果表明,RcDREB2A可能参与月季多种非生物胁迫的响应。     

黄瓜促分裂原活化蛋白激酶基因的生物信息学分析及原核表达

利用RT-PCR技术结合RACE技术,从NO₃^-胁迫下的黄瓜根中克隆出促分裂原活化蛋白激酶（mitogen-activated protein kinase, MAPK）基因的同源序列,命名为CsNMAPK,GenBank注册号为DQ812086。生物信息学分析表明,该基因全长1 636 bp,开放阅读框（ORF）1 113 bp,编码370个氨基酸。亚细胞定位预测其编码蛋白可能定位于细胞质;跨膜结构分析表明该基因有一个强的跨膜螺旋结构;PlantCare分析结果显示该基因序列具有脱落酸诱导、茉莉酸诱导、赤霉素诱导、水杨酸诱导、伤害诱导等顺式作用元件。成功构建原核表达载体,并转化E.coli BL21（DE3）,SDS-PAGE检测结果显示表达了一个约46 kD的蛋白。为进一步揭示黄瓜MAPK基因在NO3-胁迫中的作用奠定基础。     

茶树硫酸盐转运蛋白基因CsSULTR3.1的克隆及其对硫和硒的响应分析

从茶树(Camellia sinensis)根系中克隆获得1条长度为1 999 bp的核酸序列,该序列包含1 980 bp的开放阅读框(ORF),编码659个氨基酸。BlastX同源性比对显示,该基因编码的氨基酸序列与葡萄VvSULTR3.1相似度最高(86%),将其命名为CsSULTR3.1(GenBank登录号:KY963793)。进一步分析显示,该基因编码的蛋白分子量为72.39 kD,理论等电点为7.61,属于非分泌性蛋白,包含10个跨膜结构域。以GFP作为标记进行亚细胞定位发现,该蛋白定位于细胞质中。qRT-PCR分析显示,CsSULTR3.1具有组织表达特异性,在茶树茎中表达量最高。CsSULTR3.1在茶树根系中的表达受Na_2SO_4和Na_2SeO_4诱导:60 mg·L~(-1) Na_2SO_4处理12 h后逐渐上调表达,在48 h时达到最大值,而240 mg·L-1Na_2SO_4处理12 h内显著下调表达,随后显著上调并维持相对稳定状态;在不同浓度Na_2SeO_4处理条件下表达量均呈现先降低后升高再降低的趋势,且均在48 h时达到最高。     

山葡萄VaCBL6参与非生物胁迫和ABA途径的响应

对山葡萄(Vitisamurensis)‘左山–1’中的1个类钙调素磷酸酶B亚基蛋白基因VaCBL6进行克隆及功能分析。VaCBL6位于第4条染色体,开放阅读框为777 bp,编码258个氨基酸;结构域分析表明,该蛋白包含4个EF-hand与1个跨膜结构域;蛋白进化树分析表明,VaCBL6与欧洲葡萄VvCBL9和VvCBL6相似性较高,分别为98.84%、94.96%。VaCBL6编码蛋白定位于细胞核与细胞膜。VaCBL6在根与卷须中有较高的表达,且其表达受低温、干旱、NaCl和ABA的诱导。基于酵母体系的转录激活分析表明,VaCBL6无转录激活活性。100～125μmol·L~(-1) NaCl和0.25～1.25μmol·L~(-1) ABA处理均抑制了VaCBL6转基因拟南芥种子的萌发,且转化拟南芥幼苗对NaCl与ABA的敏感性提高。以上结果说明VaCBL6在植物的逆境胁迫应答中具有重要作用。     

丹参DHAR家族基因的鉴定及表达模式分析

运用生物信息学方法,从丹参（Salvia miltiorrhiza）基因组数据库中鉴定得到5个脱氢抗坏血酸还原酶（Dehydroascorbate reductase,DHAR）家族成员SmDHAR1 ~ SmDHAR5,分析了基因结构特征、编码蛋白的理化性质、亚细胞定位、高级结构、系统进化关系以及启动子顺式作用元件,并考察了其在不同组织及胁迫下的表达模式。结果表明,SmDHAR基因家族成员长度在724 ~ 3 296 bp之间,含有1 ~ 5个外显子不等,编码218 ~ 470个氨基酸;其编码蛋白多为亲水性蛋白,且多不含跨膜结构域。SmDHAR家族成员分布在叶绿体和胞质外。系统进化分析结果显示丹参SmDHAR基因分为2个亚类。上游启动子区域分析发现SmDHAR基因家族成员均含有与植物发育、激素及胁迫响应相关的顺式作用元件。表达模式分析结果显示,SmDHAR5在丹参根中显著高表达,而在其余组织中表达量较低;SmDHAR1、SmDHAR3与SmDHAR4在根、茎、叶中表达量较高,在花组织中表达最低;SmDHAR2表现为组成型高表达。SmDHAR在茉莉酸甲酯、酵母提取物、脱落酸、赤霉素、水杨酸等处理时也表现出不同的响应模式。本研究的结果为深入探索丹参DHAR基因家族在抵抗逆境过程中的功能提供了参考。     

Cre/loxp系统的构建及无选择标记转基因苹果植株的获得

从‘霞晖8号’桃中克隆了一个定位于第4条染色体上的钾转运体基因PpeKUP5,该基因编码625个氨基酸,具有10个跨膜结构域;PpeKUP5主要在根部表达,其次是叶和茎中,花和果实中的表达量极低;ABA、重金属Cr和Zn处理均显著诱导其在桃幼苗各组织中的表达,其中Cr处理最为显著,高钾胁迫及重金属Cu处理显著降低了其在根部的表达水平;细菌互补试验表明PpeKUP5具有吸收外界K+（KCl或K2SO4）的功能,且在偏中性pH值条件下最为显著。本研究表明PpeKUP5是一个主导桃树根部K+吸收的钾转运体,并可能在桃树适应高钾及重金属Cr、Zn和Cu等胁迫处理和ABA 响应中起着重要作用。     

桃钾转运体基因PpeKUP5的表达及功能分析

从‘霞晖8号’桃中克隆了一个定位于第4条染色体上的钾转运体基因PpeKUP5,该基因编码625个氨基酸,具有10个跨膜结构域;PpeKUP5主要在根部表达,其次是叶和茎中,花和果实中的表达量极低;ABA、重金属Cr和Zn处理均显著诱导其在桃幼苗各组织中的表达,其中Cr处理最为显著,高钾胁迫及重金属Cu处理显著降低了其在根部的表达水平;细菌互补试验表明PpeKUP5具有吸收外界K+（KCl或K2SO4）的功能,且在偏中性pH值条件下最为显著。本研究表明PpeKUP5是一个主导桃树根部K+吸收的钾转运体,并可能在桃树适应高钾及重金属Cr、Zn和Cu等胁迫处理和ABA 响应中起着重要作用。     

苹果黄酮醇合成酶基因MdFLS1的克隆、生物信息学分析及催化活性鉴定

【目的】在‘嘎拉’苹果中克隆黄酮醇合成酶基因Md FLS1全长,对其进行生物信息学分析,研究其表达特点和催化活性。【方法】利用RT-PCR和PCR克隆Md FLS1的全长,测序后运用多种生物信息学手段对其序列进行分析,运用q RT-PCR的方法研究其表达模式,原核诱导获得Md FLS1蛋白,并利用高效液相色谱鉴定其催化活性。【结果】苹果Md FLS1基因包含1 014 bp完整的开放阅读框,编码337个氨基酸,理论等电点为5.48,预测分子质量为38.12 ku。苹果Md FLS1基因定位于基因组8号染色体上,属于α-酮戊二酸依赖性双加酶家族。系统进化树分析表明,FLS在不同物种间具有高度的氨基酸序列保守性;其中,苹果Md FLS1与甜樱桃Pa FLS亲缘关系最近。苹果Md FLS1蛋白整体表现为亲水性,α-螺旋和不规则卷曲是其最大的结构元件。分析苹果Md FLS1氨基酸序列发现其不含信号肽和转运肽,没有跨膜结构域,预测其定位于细胞质中。分析Md FLS1的启动子区域发现含有激素信号、生物和非生物胁迫响应顺式作用元件。Md FLS1在苹果不同组织中都有表达,在叶中表达量最高,在茎中表达量较低。原核诱导并纯化了MdFLS1蛋白,鉴定了Md FLS1的催化活性。【结论】Md FLS1的表达明显受高盐胁迫、低温、干旱和ABA的诱导,并且具有催化活性。     

辣椒TPS家族成员的鉴定与CaTPS1的表达分析

利用生物信息学方法,从辣椒全基因组数据库中共鉴定出11个辣椒TPS基因,除Ca TPS3含有1个TPS和2个TPP结构域外,其余分别含有1个TPS和1个TPP结构域。11个Ca TPS分为2类,ClassⅠ包含3个基因(Ca TPS1~Ca TPS3),分别含有16、16和13个内含子,Ca TPS1和Ca TPS2含Motif 1~Motif 5各1个,而Ca TPS3含有2个Motif 4和1个Motif 3。ClassⅡ包含8个基因(Ca TPS4~Ca TPS11),均含有2个内含子,且分别含Motif 1~Motif 6各1个。利用荧光定量PCR对Ca TPS1在辣椒组织表达的特异性和低温应答模式进行分析,结果表明:Ca TPS1在叶片中的表达量大约是根和茎中的5~6倍,说明Ca TPS1的表达具有明显的组织特异性;低温处理后Ca TPS1在根和茎中的表达高峰出现时间明显早于叶片,说明不同组织中Ca TPS1对低温胁迫的应答时间存在一定差异。     

广叶绣球菌谷胱甘肽S-转移酶多样性及光照下URE2P gst的表达分析

利用生物信息学方法分析广叶绣球菌(Sparassis latifolia)基因组谷胱甘肽S-转移酶(glutathione Stransferases,GST)编码基因。结果表明:广叶绣球菌基因组可编码27个gst,均含有GST保守的N端或C端结构。27个GST分属于8个不同的家族,其中URE2P家族GST数量最多(8个),OMEGA家族含6个,GTE家族含4个,C1、GHR、SIGMA和GTT家族各含2个,EF1Bγ家族含1个。各家族间的GST具有相似的保守基序。利用实时荧光定量PCR技术分析了不同光照时长胁迫下6个URE2P家族GST基因的表达动态。结果表明有4个GST基因(MF327518,MF327511,MF327527,MF327514)在诱导48h后表达量最高,2个GST基因(MF327506,MF327510)在诱导96h后表达量最高。     

葡萄LIM家族基因特征及表达模式分析

为了明确LIM家族基因在葡萄非生物胁迫下的表达特性,在生物信息分析的基础上,以‘黑比诺’葡萄（Vitis vinifera‘Pinot Noir’）试管苗为试验材料,利用qRT-PCR技术检测了不同逆境处理对葡萄LIM家族基因成员表达的影响。结果显示,葡萄LIM基因家族有14个成员,可分为4个亚族,各亚族编码蛋白氨基酸数量差异较大,但亚族内差异较小;分析葡萄基因和拟南芥基因间的选择压发现,二者存在钝化选择关系;多序列比对发现,该家族基因成员含有1或2个锌指结构的保守结构域;保守基序分析结果表明,所有基因均包含motif2;基因结构显示VvLIM含有4 ~ 15个外显子;14个基因中有11个编码蛋白存在互作关系。该家族基因存在大量的光诱导元件和水杨酸等逆境胁迫相关元件。基因芯片表达数据表明,高表达的基因主要存在生长旺盛的组织中。qRT-PCR分析发现,VvLIM1在100 mmol ? L-1 NaCl、10% PEG和50 mg ? L-1 SA胁迫下表达量与对照相比显著上调,且随处理时间的延长表达量显著增加。     

柑橘全爪螨代谢抗性相关基因表达差异分析

【目的】为了明确谷胱甘肽S-转移酶(GST)基因、羧酸酯酶(CarE)基因,过氧化氢酶(CAT)基因在柑橘全爪螨Panonychus citri抗性中的作用,【方法】在室内用噻螨酮对柑橘全爪螨进行抗性选育,进一步构建抗/敏品系数字基因表达谱,采用RPKM法对柑橘全爪螨敏感品系和噻螨酮抗性品系3种代谢抗性相关基因进行表达差异分析。【结果】经过20代抗性选育,获得了柑橘全爪螨噻螨酮抗性品系,与敏感品系比较,柑橘全爪螨对噻螨酮的抗性倍数达到3 532.12倍。基因差异性分析发现,抗性品系中有11条GST基因、17条CarE基因和6条CAT基因表达上调;14条GST基因、24条CarE基因和3条CAT基因表达下调。上调倍数最高的GST基因、CarE基因和CAT基因分别为Unigene31530[log2 ratio(RS/SS)=1.05]、Unigene23121[log2 ratio(RS/SS)=2.05]和Unigene31477[log2 ratio(RS/SS)=10.04]。进一步对Unigene31477进行荧光定量PCR分析发现,抗性和敏感品系基因表达水平没有显著差异。【结论】根据柑橘全爪螨抗/敏性品系基因表达差异推断,GST、CarE和CAT基因可能与柑橘全爪螨对噻螨酮产生的抗性没有密切关系。     

辣椒GRAS家族全基因组鉴定与表达分析

基于辣椒全基因组数据信息,利用生物信息学方法对CaGRAS基因家族进行了系统鉴定和进化分析,并通过Real-time PCR方法检测了CaGRAS家族组织表达模式和对PEG6000、盐胁迫的应答。结果表明:在辣椒中存在54个CaGRAS基因,除11号染色体外其余染色体均有分布,外显子数1~3,等电点4.97~9.13;系统进化分析显示CaGRAS基因可分为8个进化群;CaGRAS基因具有不同的表达模式,在根、茎、叶片和茎尖中优势表达的基因分别有34、8、3和8个;多数CaGRAS基因能响应PEG6000和盐胁迫,其中CaGRAS11、CaGRAS30、CaGRAS40、CaGRAS44和CaGRAS50受到PEG6000和盐胁迫的强烈诱导。本研究为深入解析CaGRAS家族基因的功能奠定了一定基础。     

药用蒲公英低温和高温胁迫下内参基因筛选与相关基因表达分析

为研究不同温度胁迫下药用蒲公英最适内参基因与温度响应相关基因的表达,分别以低温（4 ℃）和高温（38 ℃）胁迫0、3、6、12、24和48 h共12个处理的叶片为材料,选取10个候选内参基因18S、EF1α、TUB、40S、GAPDH、β-actin、ACT11、TUA、60S和SKIP,利用RT-qPCR技术以及geNorm、NormFinder和BestKeeper软件评价其稳定性。利用筛选出的最适内参基因对药用蒲公英12个温度响应基因（AP2/ERF、Dof、ICE1、MYB、bZIP、NTL6、HSF、Gols、HSP、NAC、XCT和WRKY）的表达水平进行定量分析。结果显示：温度胁迫下药用蒲公英最适内参基因为18S和GAPDH;药用蒲公英AP2/ERF、HSF、Glos、HSP、NAC、XCT基因在低温和高温胁迫下均为先上调后下调表达,bZIP、NTL6在温度胁迫下波动变化,Dof、ICE1、MYB在低温胁迫下先上调后下调表达,高温胁迫下持续下调表达,WRKY在高温胁迫下表达量远远高于低温胁迫。依据基因表达量推测,药用蒲公英低温和高温胁迫的响应机制存在差异,AP2/ERF、Dof主要响应低温胁迫,HSF、XCT、WRKY主要响应高温胁迫。     

桃生长素酰胺水解酶基因家族序列特征及其表达分析

生长素酰胺水解酶（IAA-Leucine Resistant1-like Hydrolase,ILL）可催化生长素结合态释放游离态生长素（IAA）。为了深入研究桃ILL基因家族的功能,对桃基因组中ILL基因家族成员的数量、在染色体骨架的分布、编码蛋白质的结构、基因表达模式和编码氨基酸的进化树分类等方面进行了研究。桃基因组中共鉴定出了9个ILL基因,它们分布在4个染色体骨架上（scaffold 1、2、3和7）。在桃中编码ILL蛋白家族的基因成员分别为：PpILR1、PpILR2、PpILR3、PpILR4、PpILL1、PpILL2、PpILL3、PpILL4和PpILL5,所有这些预测的蛋白都含有M20结构域和M20二聚化结构域。运用荧光定量实时PCR技术对该基因家族在桃果实生长发育各阶段的表达水平进行了分析,结果显示：ILL 基因家族中的数个成员在果实不同发育阶段表达水平有变化,其中PpILR1的表达量在果实生理成熟期明显上调。     

苹果液泡铁离子转运蛋白基因家族的鉴定与表达分析

液泡铁离子转运蛋白(vacuolar iron transporter,VIT)参与铁的储存和运输,对植物光合作用、固氮、呼吸、DNA和激素合成有重要作用.本研究中鉴定了苹果全基因组的9个VIT基因,通过系统发育分析其进化关系,表明苹果VIT蛋白与拟南芥进化关系较近.染色体定位显示9个VIT基因分布在7条染色体上,VI...     

桃GH3基因家族的生物信息学分析及其在果实发育中的表达

为了探索生长素酰胺合成酶（GH3）基因家族在桃（Prunus persica L. Batsch）果实生长发育过程中的作用,对桃基因组中的GH3基因家族进行生物信息学分析,对它们在溶质型和硬质型油桃果实发育成熟阶段的表达水平进行qRT-PCR检测。检测结果表明：桃GH3基因家族有8个成员,分别为PpGH3-1 ~ PpGH3-8,聚类分析表明其分为GroupⅠ和GroupⅡ两类。实时荧光定量PCR分析表明GroupⅡ型基因（PpGH3-1、PpGH3-2、PpGH3-3、PpGH3-4和PpGH3-5）在溶质型油桃中的表达水平高于硬质型油桃,其中PpGH3-3和PpGH3-4最为明显。经NAA处理后的硬质型油桃果实PpGH3-1、PpGH3-3、PpGH3-4和PpGH3-7相比对照上调表达,其中PpGH3-3上调表达最为明显。试验结果表明生长素在桃果实成熟软化过程扮演着重要的角色。     

草菇漆酶基因在子实体形成过程中的表达分析

为了探明草菇(Volvariella volvacea)漆酶基因的功能，采用实时荧光定量PCR方法对11个漆酶编码基因(lac1-11)在子实体不同发育阶段的表达水平进行研究，结果表明：草菇漆酶在针头期、纽扣期、蛋形期、伸长期和成熟期均发生转录；表达趋势分为三类：lac1、lac5、lac7和lac8表达量针头期最高；lac3、lac6和 lac11从针头期至蛋形期逐渐升高，自伸长期表达量有明显下降；lac2、lac4、lac9和 lac10在纽扣期最高，随后表达量逐渐降低，其中lac9与lac10在成熟期又有了小幅度的提高。这些结果说明草菇不同的漆酶在子实体发育中可能起到不同的作用。