表达犬瘟热病毒融合蛋白基因重组腺病毒的构建与鉴定

利用pVAX1载体的表达元件CMV启动子和poly(A)多聚腺苷酸信号构建了含犬瘟热病毒融合蛋白基因(F)的重组犬腺病毒。首先,利用酶切、连接等实验方法构建了含CDV启动子F蛋白基因表达盒的转移质粒pVAXΔE3LPF。再以含CAV-2SY株全基因组的pPoly2-CAV-2为载体,构建重组质粒pCAV-2-pVAXLPF,利用脂质体介导方法转染MDCK细胞,转染3次后,细胞出现了典型的犬腺病毒感染样病变。电镜负染和切片观察、酶切、PCR扩增及测序鉴定的结果表明,成功构建了含犬瘟热病毒融合蛋白基因的重组犬腺病毒,表达的融合蛋白分子质量为72ku。在MDCK细胞上连续传30代试验表明重组病毒CAV-2-pVAXLPF具有良好的遗传稳定性。     

piggyBac转座子在绒山羊基因组中的整合位点及其特征分析

【目的】构建piggyBac（PB）转座子表达载体系统,研究PB转座子在绒山羊基因组中的整合位点。【方法】构建pB-CMV-EGFP-Neo转座载体和pcDNA-Trans辅助载体,利用lipofectamine 2000介导共转染绒山羊胎儿成纤维细胞,经G418筛选获得稳定转染的转基因细胞系。提取转基因细胞基因组DNA,利用反向PCR检测piggyBac转座子整合位点。【结果】构建了转座系统并成功介导外源基因在绒山羊成纤维细胞染色体中整合,获得了转基因细胞系;反向PCR检测显示在绒山羊基因组中有21个PB转座子整合位点;整合位点TTAA毗邻一侧的5个碱基组成中,PB转座子3′倾向于插入到富含AT（58.35%）碱基的区域,PB转座子5′倾向于插入到富含GC（57.8%）。【结论】PB转座子可在绒山羊基因组中发生高效转座,获得的整合位点信息可为利用PB转座子开展绒山羊研究提供理论参考。     

多位点基因打靶的定点整合效率研究

利用PCR方法从pEGFP-N1中扩增pCMV-EGFP,从人基因组rDNA基因家族靶基因插入位点两侧分别扩增两条基因打靶同源重组引导序列DS1和DS2,将DS1、DS2片段插入pMD19-pCMV-EGFP中,构建成多位点基因打靶载体pMD19-DS2-pCMV-EGFP-DS1.通过脂质体将其转染至HEK293细胞内.通过荧光检测和PCR、测序等方法,检测和评价定点整合效率.试验结果表明,外源基因EGFP在转染细胞中持续稳定表达,EGFP定点整合率约为4%,不经药物筛选大大提高了整合效率,比传统的基因打靶技术提高了4000多倍,为转基因动物研究建立了高效的定点转基因技术.     

Translation in mammalian cells of a gene linked to the poliovirus 5' noncoding region

The central portion (region P) of the 742-nucleotide noncoding 5' end of poliovirus allows the RNA to initiate protein synthesis in the absence of the usual 5' 7-methylguanosine capping group. Poliovirus 5' noncoding region was fused to a reporter gene and transfected into cells. There was extensive augmentation of the expression of this gene by poliovirus-mediated inhibition of cap-dependent protein synthesis. That the construct initiated in a cap-independent manner was verified through in vitro experiments. Small lesions throughout region P blocked its initiation function, implying that a coherent functional unit, hundreds of nucleotides long, is responsible for cap-independent initiation by poliovirus RNA.     

人pot1基因cDNA的克隆及其在HeLa细胞中的表达

目的：克隆人端粒保护蛋白（human proteetlon of telomeres 1.pot1）基因cDNA全编码区,构建成真核表达质粒并实现在HeLa细胞中的表达。方法：RT-PCR法扩增出HeLa细胞hpot1基因cDNA编码区全序列,定向克隆至真核表达载体pcDNA3,阳性重组质粒经插入片段测序验证;重组的pcDNA3-hpot1质粒瞬时转染HeLa细胞,RT-PCR和EMSA法（电泳迁移率改变分析）检测hpot1基因的表达水平。结果：来自Hela细胞的hpot1基因cDNA编码区全序列构建成的真核表达质粒pcDNA3-hpot1,经测序分析序列和ORF正确;该重组质粒转染在HeLa细胞48h后,hpot1基因表达水平增高。结论：真核表达载体pcDNA3-hpot1构建成功,并实现了hpot1在Hela细胞中的表达。     

GPC3-siRNA真核质粒载体的构建及Huh-7细胞转染

目的探讨GPC3-siRNA真核质粒载体构建并转染Huh-7细胞的可行性。方法构建真核质粒载体pcDNA3.1＋GPC3和GPC3-siRNA-1633,采用脂质体法瞬时转染至Huh-7细胞中。MTT法检测转染后Huh-7细胞的细胞活性,荧光定量PCR、Western blot分别检测GPC3 mRNA和蛋白表达。结果 GPC3-siRNA-1633基因和GPC3真核质粒载体转染Huh-7细胞后细胞存活率高,转染GPC3-siRNA-1633的Huh-7细胞出现GPC3 mRNA和蛋白表达下调。结论 GPC3-siRNA-1633可成功转染至Huh-7细胞,并抑制GPC3表达。     

大载体转染猪胎儿成纤维细胞的电转条件优化

背景 随着生物技术发展,研究的生理机制和生物功能日益复杂,提高大载体的转染效率对多基因共表达系统、基因编辑技术、转基因育种等具有重要的意义。在转基因育种中,使用的转基因载体相对较大,而且转基因动物的制备效率也与供体细胞猪胎儿成纤维（porcine Fetal Fibroblasts,PFFs）细胞的转染效率有关。目的 研究主要从转染参数、质粒用量和拓扑结构三方面,比较3种电转仪ECM ^?830/NEPA 21/Nucleofector ^TM2b的大载体转染效率,以探索大载体转染PFFs的最佳条件。方法 使用3种不同电转仪将长达26 kb的携带增强型绿荧光蛋白基因的pPXAT-EGFP质粒转染1×10 ⁶个PFFs,48 h后使用流式细胞仪测定荧光细胞比例,从电转参数、质粒用量和拓扑结构三方面分别比较瞬时转染效率。结果 首先比较电转仪不同参数的转染效率,结果显示当电转参数为脉冲电压300 V,脉冲长度1 ms,脉冲间隔50 ms,脉冲次数3次,NEPA 21转染PFFs的效率最高,为13.24%±1.63%,而Nucleofector ^TM 2b的最佳电转参数为U-023,其转染效率高达46.36%±3.95%。然后在最佳电转参数下分别比较6、8、10和12 μg的26 kb超螺旋质粒的转染效率,ECM ^?830和Nucleofector ^TM 2b转染PFFs的最佳质粒用量为12 μg,其转染效率分别为8.44%±0.90%（电转参数：脉冲电压300 V,脉冲长度1 ms,脉冲次数3 次）和14.63%±3.21%(电转参数：U-023),而NEPA 21使用10 μg质粒转染PFFs时效率达到最高（6.09%±0.72%）。最后比较不同质粒拓扑结构的转染效率,结果显示线性化质粒的转染效率较低,仅为超螺旋质粒转染效率的34.96%—48.39%。结论 因此Nucleofector ^TM 2b转染PFFs的最佳条件为：U-023程序、12 μg超螺旋质粒;NEPA 21为：脉冲电压200 V,脉冲长度3 ms,脉冲间隔50 ms,脉冲次数3次、10 μg超螺旋质粒;ECM ^?830则在脉冲电压300 V,脉冲长度1 ms,脉冲次数3 次条件下转染12 μg超螺旋质粒可获得最佳转染效率。综合比较上述3种电转仪,26 kb大载体转染PFFs的最佳电转仪是Nucleofector ^TM 2b。     

PTEN磷酸酶活性对人乳腺癌ZR-75-1细胞的迁移及粘着斑激酶磷酸化水平的影响

目的:探讨PTEN磷酸酶活性对ZR-75-1人乳腺癌细胞迁移及粘着斑激酶磷酸化水平的影响。方法:用有和无磷酸酶活性的两种PTEN表达质粒(W t和G 129)转染人乳腺癌细胞株ZR-75-1,用人工基底膜侵袭试验检测其转染前后的迁移能力,以W estern-b lot检测未转染的ZR-75-1和两种表达质粒的ZR-75-1磷酸化粘着斑激酶水平。结果:转染后有磷酸酶活性、无磷酸酶活细胞与未转染ZR-75-1细胞间侵袭抑制率、运动抑制率差异有显著性(P<0.01)。各组细胞间总FAK(粘着斑激酶)水平无明显差异,而W T-PTEN与G 129和ZR-75-1组FAK 397位酪氨酸磷化水平有明显差异。结论:PTEN具有抑制乳腺癌细胞ZR-75-1转移的作用,其机制可能与PTEN使FAK去磷酸化有关。     

绵羊血管内皮生长因子基因siRNA载体在卵巢颗粒细胞中的表达

为构建绵羊血管内皮生长因子(VEGF)基因siRNA载体并对其在绵羊颗粒细胞中的表达,采用DMEM/F12培养液对绵羊卵巢颗粒细胞进行体外培养,采用脂质体转染法将干扰载体转染到颗粒细胞中,用ELISA试剂盒测定转染后各组颗粒细胞中VEGF的表达量。转染阳性对照载体PGC的颗粒细胞组为对照组,转染PGC-1、PGC-2和PGC-3的颗粒细胞组分别为试验组Ⅰ、试验组Ⅱ和试验组Ⅲ。与对照组相比,各试验组中VEGF的表达量分别降低了55.37%、81.45%和73.29%,其中载体PGC-2所转染的细胞中VEGF的表达量最少,说明在3个载体中,PGC-2对VEGF的基因沉默效果最好。     

鸡传染性喉气管炎病毒河南株gB基因真核表达载体的构建及表达

根据已发表的传染性喉气管炎病毒(ILTV)gB基因序列,设计并合成1对引物,以河南分离株(ILTV-HN)接种10日龄鸡胚,从含痘斑的绒毛尿囊膜中提取基因组DNA扩增gB基因,将扩增片段克隆入pGEM-T Easy载体后,经蓝白斑筛选,菌液PCR和酶切鉴定为阳性的重组菌进行测序,结果表明克隆到ILTV-HN株gB基因,全长为2 629 bp,包含一个完整的开放阅读框.然后将其克隆至真核表达载体pcDNA3.1(+)中,构建真核表达载体pcDNA3.1-gB,转染鸡胚成纤维细胞(CEF),通过RT-PCR检测,转染细胞中含gB基因的mRNA,间接免疫荧光检测,结果表明gB基因在CEF细胞中进行了瞬时表达.     

萧山鸡IL-2基因真核表达载体构建及其在Vero细胞中的表达

扩增萧山鸡白细胞介素2(IL-2)基因,将其插入真核表达载体pCI构建重组质粒pCI-IL-2,高压电击法将重组质粒转化入减毒沙门氏菌,并直接转染Vero细胞,提取细胞总DNA,DIG标记探针可检测到阳性杂交信号.用FITC标记的羊抗兔IgG进行间接免疫荧光试验,可检测到特异性黄绿色荧光.SDS-PAGE和Western blotting可检测到18.5 kD和14.5 kD的蛋白条带.表明减毒沙门氏菌能将重组质粒pCI-IL-2携带进入Vero细胞内表达IL-2,且表达产物具有免疫反应性,为今后研制鸡IL-2基因作为口服免疫增强剂提供了依据.     

人Ⅰ型胶原基因脂质体转染牛耳细胞克隆筛选方法

构建连接有人Ⅰ型胶原基因的质粒(PGCl-collagen).利用脂质体介导的方法转染荷斯坦奶牛耳成纤维细胞,优化一系列转染条件以提高转染效率,再利用G418和GFP荧光的表达来筛选稳定转染的细胞,最后以末转染的成纤维细胞作为阴性对照组,PGCl-collagen作为阳性对照组对转染的细胞进行PCR验证.结果显示:在6孔培养板中细胞融合度达到50%～60%左右介导1～3μg重组质粒转染24 h,转染效率可达25%～30%,筛选单克隆细胞在荧光显微镜观察检测到绿色荧光蛋白的表达.在使用800U的G418筛选效果最好,维持浓度300～600U,获得25个稳定表达的阳性细胞系.从中选取6个克隆进行PCR验证.成功利用脂质体转染方法将人I型胶原基因成功转染到荷斯坦奶牛耳成纤维细胞,PCR验证结果正确.     

表达猪Viperin蛋白重组腺病毒的构建及其对PRRSV复制的抑制作用

为研究猪Viperin蛋白对猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)复制的抑制作用,通过RTPCR方法扩增猪Viperin基因,并克隆入腺病毒穿梭载体p Ad Track-CMV,经菌液PCR、酶切鉴定后进行测序。将PmeⅠ内切酶线性化的重组穿梭载体质粒(p Ad Track-s VIP)电转化大肠杆菌BJ5183,与腺病毒骨架载体p Ad Easy-1进行同源重组,提取重组后的腺病毒质粒,经内切酶PacⅠ线性化后转染HEK-293A细胞,装配成完整的病毒粒子r Ad-s VIP。重组腺病毒r Ad-s VIP感染细胞后,可见绿色荧光蛋白的表达。RT-PCR、Western blot检测结果表明,重组腺病毒r Ad-s VIP可正确表达猪Viperin蛋白,且表达的猪Viperin蛋白具有良好的反应原性,对PRRSV的复制具有明显的抑制作用。     

ChREBP基因siRNA表达质粒构建及对原代 培养猪脂肪细胞生脂的影响

【目的】构建ChREBP基因siRNA表达质粒,干扰ChREBP在原代培养猪脂肪细胞的表达,研究其在葡萄糖诱导脂肪细胞生脂中的作用。【方法】合成4对靶向ChREBP基因的siRNA寡核苷酸,分别连接于pcDNA™6.2-GW/EmGFP载体构建siRNA表达质粒,测序验证后,采用脂质体介导法转染从3日龄仔猪皮下脂肪组织分离培养的脂肪细胞,荧光定量RT-PCR检测ChREBP基因沉默效率;以葡萄糖浓度为0—20 mmol·L-1的培养液培养转染细胞48 h,测定生脂及生脂基因表达变化。【结果】筛选出了1个转染效果好、ChREBP基因沉默效率达85%的siRNA表达质粒,转染原代培养猪脂肪细胞后,细胞生脂水平及生脂基因ACC1和FAS mRNA表达比阴性对照表达质粒转染细胞和未转染细胞显著降低（P＜0.05）,且生脂水平不受葡萄糖水平的影响（P＞0.05）。【结论】构建的siRNA表达质粒能有效干扰猪脂肪细胞ChREBP表达,葡萄糖通过转录因子ChREBP调控猪脂肪细胞生脂及生脂基因表达。     

安氏隐孢子虫ABC2基因的克隆表达与营养物质转运

为探究安氏隐孢子虫(Cryptosporidium andersoni)ATP结合盒转运蛋白基因(CaABC2)对营养物质的转运功能,以安氏隐孢子虫基因组作为模板,设计合成CaABC2基因特异性引物,进行PCR扩增,获得CaABC2基因。将克隆的重组质粒CaABC2基因与真核表达质粒pEGFP-C1双酶切后再连接,构建重组真核质粒载体pEGFP-C1-CaABC2;再采用脂质体转染法将重组质粒pEGFP-C1-CaABC2转入小鼠肠上皮细胞(Intestinal epithelial cells,IEC),检测不同组IEC细胞对总胆固醇、还原型谷胱甘肽、葡萄糖和碱性磷酸酶的转运效果。结果表明:扩增出778bp的CaABC2基因,测序分析与预期片段大小一致;重组真核质粒载体pEGFP-C1-CaABC2转染小鼠IEC细胞后,观察到转染后的对照组和转染组IEC有绿色荧光;检测到在细胞内液中,转染组、对照组和空白组的总胆固醇浓度分别为15.99±0.12、11.80±0.35和12.43±0.16 mmol/L;还原型谷胱甘肽浓度分别为15.24±0.44、10.48±0.35和11.04±0.75mmol/L;在细胞外液中,转染组、对照组和空白组的总胆固醇浓度分别10.67±0.17、14.82±0.06和15.84±0.17 mmol/L;还原型谷胱甘肽浓度分别为10.20±0.79、14.60±0.45和15.60±2.50mmol/L。转染组总胆固醇、还原型谷胱甘肽浓度均显著大于空白组和对照组(P0.05),而在细胞外液中,转染组总胆固醇、还原型谷胱甘肽的浓度均显著小于空白组和对照组(P0.05)。在细胞内液和外液中,空白组与对照组总胆固醇、还原型谷胱甘肽的浓度之间均未见显著性差异(P0.05);转染组、对照组和空白组之间的葡萄糖和碱性磷酸酶浓度均没有统计学差异(P0.05)。CaABC2基因具有协助转运总胆固醇、还原型谷胱甘肽、葡萄糖和碱性磷酸酶的作用,其中转运总胆固醇效果最为明显。     

鸡TIGAR基因真核表达质粒的构建及其抗凋亡功能评价

【背景】 TP53诱导的糖酵解和凋亡调节因子（TP53-induced glycolysis and apoptosis regulator,TIGAR）是p53下游的靶基因,具有调节糖酵解水平和去除活性氧（Reactive oxygen species,ROS）并降低由活性氧诱发的细胞凋亡水平。【目的】 构建鸡源TIGAR基因的真核表达质粒,并检测TIGAR基因在DF1细胞中的抗凋亡作用,为建立稳定表达鸡TIGAR基因的细胞系做准备。【方法】根据GenBank（登录号：XM_417232.6）中预测基因设计引物,利用RT-PCR的方法从SPF鸡脾脏中扩增鸡TIGAR基因,将扩增产物克隆至载体（Flag-CMV14）后送公司测序验证;随后构建进化树对鸡TIGAR基因与其他哺乳动物及水生动物的TIGAR基因进行同源性分析。将重组质粒（Flag-TIGAR）转染入DF1细胞24 h后,使用新城疫病毒诱导细胞凋亡,利用Western Blot检测重组质粒表达情况以及Poly ADP-Ribose Polymerase（PARP）裂解情况。此外还将重组质粒（Flag-TIGAR）转染入DF1细胞,并于收样前2 h使用Staurosporine刺激细胞发生凋亡,分别在转染后24、48 h收集样品,并用流式细胞仪检测细胞凋亡情况。【结果】 RT-PCR扩增TIGAR基因,在843 bp处出现目的条带与预测相符,构建的TIGAR真核表达质粒（Flag-TIGAR）经测序,结果显示其序列与GenBank上预测的基本一致。Western Blot结果显示在30 h、36 h收集的样品中PARP均被裂解且转染重组质粒（Flag-TIGAR）的实验组与未转染质粒（MOCK）组或转染空载体（Flag-CMV14）组的样品相比,裂解的PARP表达量明显降低,且差异极显著（P<0.01）。流式结果显示：24 h 检测转染Flag-CMV14后细胞总凋亡率为11%（早期凋亡7.8%,晚期凋亡3.2%）,而转染Flag-TIGAR后细胞总凋亡率仅为4%（早期凋亡3.7%,晚期凋亡0.3%）,转染Flag-CMV14的早期凋亡率和晚期凋亡率均高于转染Flag-TIGAR组,且差异显著（P<0.05）。48 h转染Flag-CMV14后细胞总凋亡率为20.3%（早期凋亡14.3%,晚期凋亡6.0%）,而转染Flag-TIGAR后细胞总凋亡率为6.4%（早期凋亡4.8%,晚期凋亡1.6%）,转染Flag-CMV14组的细胞早期凋亡和晚期凋亡率均高于转染Flag-TIGAR的组,且差异极显著（P<0.01）。【结论】成功扩增出鸡TIGAR基因,并构建了其真核表达质粒,通过Western Blot和流式实验均证实过表达TIGAR后可降低细胞的凋亡程度并有利于细胞存活。     

含CpG序列PRRSV ORF5基因真核质粒构建及其免疫原性的研究

 【目的】提高猪繁殖与呼吸综合征病毒（PRRSV）基因免疫的效果,构建含CpG基序和PRRSV ORF5的真核重组表达质粒CpG-pVAX1-ORF5。【方法】经酶切鉴定和序列测定,将重组质粒转染COS-7细胞,经间接免疫荧光试验证实CpG-pVAX1-ORF5可表达PRRSV GP5蛋白。免疫SPF小鼠,检测鼠的特异性抗体滴度、脾T淋巴细胞亚群数量（CD4+和CD8+）以及淋巴细胞增殖反应（MTT法）水平。【结果】本试验构建的含CpG基序真核重组表达质粒CpG-pVAX1-ORF5能诱导小鼠产生针对PRRSV的体液免疫与细胞免疫。【结论】CpG-ODN可提高PRRSV基因疫苗的免疫效果。     

HBx小鼠肿瘤细胞株的建立及初步鉴定

目的建立稳定、高效的HBxAg体外表达细胞株,以便进一步研究HBX基因和HBxAg的致癌作用及机理。方法用RT-PCR技术扩增出了HBX的cDNA,并克隆到真核表达载体pcDNA3.1中,通过脂质体介导将pcD-NA3.1-HBX转染到小鼠肿瘤细胞株(EL4)中。结果RT-PCR及蛋白质印迹的实验结果表明,HBX基因在小鼠肿瘤细胞EL4细胞中得到了表达。结论本研究成功构建了表达HBx的小鼠肿瘤细胞株,为进一步研究HBX基因和HBx的致癌作用及机制奠定了实验基础。     

马立克氏病病毒VP22基因siRNA筛选体系的构建

将马立克氏病病毒（MDV）超强毒株VP22基因插入真核表达载体pEGFP-C1中EGFP基因的下游，构建EGFP-VP22融合基因真核表达载体pEGFP-VP22。将其转染至中国仓鼠卵巢细胞（CHO-k1）中，通过荧光显微镜观察EGFP的表达情况，并用RT-PCR检测VP22基因的表达。检测证实EGFP和VP22在CHO细胞中均得到了有效表达。     

牛分枝杆菌ag85b基因的瞬时表达

[目的]为牛结核病DNA疫苗的研制提供参考。[方法]利用PCR技术扩增出牛分枝杆菌ag85b基因片段,克隆到真核载体pcD-NA3.1(+)上,构建重组质粒pcAg85B,将重组质粒转染SP2/0细胞,间接免疫荧光试验检测该基因的表达情况。[结果]结果表明:在转染了重组质粒pcAg85B的SP2/0细胞中出现绿色荧光,说明ag85b基因在SP2/0细胞中成功进行了瞬时表达。[结论]为研究牛分枝杆菌ag85b DNA疫苗奠定了基础。