南瓜属作物遗传转化研究进展

南瓜属(Cucurbita)作物包括中国南瓜(C.moschata D.)、印度南瓜(C.maxima D.)和美洲南瓜(C.pepo L.)等许多重要蔬菜,在世界范围内广泛栽培,具有重要的经济价值。目前,南瓜属作物遗传转化技术普遍存在转化效率低、重复性差、假阳性和嵌合体干扰等诸多问题。随着分子生物学的迅猛发展,南瓜属作物遗传改良和基因功能验证亟需建立高效稳定的遗传转化体系。前人在南瓜离体再生、花粉管通道和农杆菌介导等转化方法上做过不少探索,普遍认为以农杆菌介导的子叶节离体再生是最具潜力的转化体系。笔者对现有的研究基础进行综述,为促进其在南瓜属作物遗传改良上的应用提供参考。     

农杆菌介导的黄瓜未受精子房培养遗传转化体系的建立

为了建立一种直接获得转基因纯系的转化方法,首次开展了农杆菌介导的黄瓜未受精子房培养遗传转化体系研究。试验以除草剂草胺膦为选择标记,胚胎发生阶段,最适除草剂质量浓度为0.5~1.0 mg·L-1,幼苗生根阶段除草剂质量浓度为2.0 mg·L-1;以羧苄青霉素为抑菌剂,最适抑菌质量为450 mg·L-1;最佳浸染方法为OD600=0.3农杆菌工程菌,浸染10 min;共培养时间为3 d;在浸染菌液和共培养基中加入0.01%的silwet-77,有利于获得较多抗性胚胎及抗性植株。该遗传转化体系的建立,为黄瓜转基因方法研究开辟了新途径。     

西瓜未受精子房离体培养技术

西瓜未受精子房离体培养作为单倍体育种的有效方法,可极大提高育种效率。以西瓜‘早佳’未受精子房为试材,对西瓜未受精子房出胚率的影响因素进行了研究,并鉴定了再生植株倍性。试验结果表明,栽培季节对西瓜未受精子房离体培养有很重要的影响,在相同的培养条件下,秋季栽培出胚率可达21.33%,高出春季栽培约6%;取材当天的日最低、最高气温对西瓜未受精子房离体培养出胚率也有一定的影响,在21～35℃范围内日平均出胚率均可达10%,显著高于过低或过高气温下统计的出胚率;4℃低温预处理并不能提高西瓜胚状体诱导效率。利用染色体计数法与流式细胞仪鉴定36棵再生植株倍性,单倍体率为97%、二倍体率为3%。     

农杆菌介导南瓜遗传转化体系的建立

以南瓜金辉一号（Cucurbita moschata‘Jinhui1’）为实验材料,利用根癌农杆菌（Agrobacterium tumefaciens）介导转化南瓜子叶节,研究了预培养时间、侵染时间、乙酰丁香酮（AS）浓度和共培养时间,     

南瓜白粉病病原菌鉴定及抗性鉴定方法研究

白粉病是黑龙江省南瓜3大病害之一,发病率高,发病面积大,严重影响了南瓜的品质和籽粒饱满,降低了南瓜的商品性,给种植户造成了较大的损失。明确引起黑龙江省南瓜白粉病的病原菌种类,并筛选出一套南瓜苗期白粉病抗病接种鉴定技术,对于病害的防治和抗源筛选具有重要的理论和现实意义。试验结果表明:引起黑龙江省南瓜白粉病的主要病原菌是子囊菌亚门的单囊壳菌[Sphacelotheca fuliginea(Schlecht．ex Fr．)Poll]。抗性鉴定孢子悬浮液接种浓度应为2．5×105-5．0×105个／mL。对苗龄、遮阴、保湿时间经L9(34)正交试验设计研究表明,苗龄为2 片真叶、遮一层遮阳网、保湿48 h的处理组合是极显著优于其他组合的最优处理组合。     

北京地区南瓜病毒病病原种类鉴定

为明确北京地区南瓜病毒病种类及其主要侵染病原,2016~2017年在北京周边采集疑似感染病毒的南瓜病样84份,并根据南瓜上的6种病毒特异性引物对其进行反转录PCR(RT-PCR)检测。结果表明:共有79份南瓜病样检测显示阳性,其中黄瓜花叶病毒(Cucumber mosaic virus,CMV)的检出率最高,为52.38%;其次是小西葫芦黄花叶病毒(Zucchini yellow mosaic virus,ZYMV)和西瓜花叶病毒(Watermelon mosaic virus,WMV),检出率分别为44.01%、14.29%,其他病毒暂未检出。此外,16.67%的样品受2种病毒复合侵染,CMV和ZYMV复合侵染占7.14%,ZYMV和WMV复合侵染占9.52%。北京地区南瓜上优势病毒种类为CMV,且存在病毒复合侵染现象。     

适于南瓜遗传多样性分析的RAPD引物筛选

采用CTAB法提取南瓜DNA基因组,优化的RAPD反应体系,对RAPD随机引物进行了筛选,从260条引物中筛选出多态性好、稳定性高的引物26条作为南瓜RAPD分析引物,为进一步进行南瓜遗传多样性分析提供依据.     

西伯利亚百合子房的组织培养及离体快繁研究

以子房为外植体,对西伯利亚百合离体快繁进行研究.结果表明:试验浓度范围内适合不定芽诱导的培养基以MS+6-BA 1.0 mg/L+NAA 1.5 mg/L为佳,芽增殖最佳培养基为MS+6-BA 1.0 mg/L+NAA 0.2 mg/L,适合生根的培养基为MS0,生根率达100%,且根系发达,长势粗壮,练苗3～5 d后移栽,长势良好,移栽成活率达90%以上.     

南瓜种质资源遗传多样性的RAPD分析

 应用RAPD技术对70份南瓜种质进行遗传多样性分析, 从100条随机引物中筛选出21条引物, 共扩增出168条带, 其中157条为多态带, 比率为93.5%。系统聚类分析将70份南瓜种质分为3大类: 中国南瓜、美洲南瓜、印度南瓜, 与传统分类学的结果相符。同时在3大类群内又将种质进行细分,第1类分为3组, 第2类分为6组, 第3类分为5组, 其结果与地域来源和形态特征有一定的相关性。主成分分析与系统聚类分析结果基本一致, 但系统聚类分析在揭示密切相关的个体间的关系上能提供更丰富的信息。     

辣椒遗传转化研究

综述了辣椒转基因的一般方法和辣椒转基因研究在抗病、抗虫、抗逆等方面的进展和现状，并讨论了转基因存在的主要问题。     

花生幼苗不同切断及其愈伤组织的农杆菌介导转化

试验进行了不同花生外植体（成熟胚的幼叶、胚轴、子叶等）的直接农杆菌转化与花生愈伤组织的农杆菌转化,比较其感染后的诱芽与上分化生长情况,并对影响农杆菌介导转化花生的因素进行了探讨.结果表明农杆菌的生长状况、浓度及侵染时间和筛选剂的浓度是影响农杆菌介导花生转化的主要因素;褐化是影响其转化的关键问题.     

根癌农杆菌介导BDN1 基因转化马铃薯的研究

以马铃薯品种东农303 微型薯为试验材料,通过根癌农杆菌介导法,将来自耐旱植物厚 叶旋
蒴苣苔的脱水蛋白基因BDN1 导入马铃 薯,并对其遗传转化的影响因素进行了研究。获得了抗性再生植株
35 株 ;PCR 检测27 株呈阳性;Southern-blot 检测4 株呈阳性,表明BDN1 基因已整合到马铃薯基因组中;
半定量RT-PCR 检测结果表明BDN1 基因在马铃薯抗性植株中表 达。通过对相对含水量、脯氨酸、丙二醛
含量和SOD 活性测定,证明4 个转基因株系对干旱胁迫的抗性显著高于对照植株。     

根癌农杆菌介导的西瓜遗传转化研究进展

介绍了根癌农杆菌介导的西瓜遗传转化的研究现状,综述了西瓜高效再生体系的建立和遗传转化过程中的主要影响因素,包括最佳外植体的选择、最适培养基的制备,以及抗生素、农杆菌菌株类型、菌液浓度、侵染时间、预培养时间、共培养时间和添加乙酰丁香酮等内容,讨论了西瓜遗传转化存在的问题,并对这一体系的发展进行了展望。     

Optimization of Wheat Immature Embroys Genetic Transformation System Mediated by Agrobacterium tumefaciens

为了优化农杆菌介导的小麦幼胚转化体系,通过对4个小麦品种河农827、石新828、河农825、良星99的幼胚组织培养及再生系统的研究表明,在改良培养基MSW1和MSW2中,小麦幼胚胚性愈伤组织诱导率与MSW0培养基相比分别提高了6.0%和5.4%,并且显著提高了植株再生能力。采用混合正交试验设计,对农杆菌遗传转化过程中小麦幼胚的诱导培养基、诱导时间、农杆菌侵染浓度、侵染时间进行了优化。结果表明,在诱导培养基MSW2,诱导培养6d,OD660=1,侵染时间3h时,愈伤GUS瞬时表达率及抗性愈伤成活率最高,对河农827成活的抗性再生植株进行PCR检测,获得了候选转基因植株。     

根癌农杆菌介导荔枝遗传转化研究

利用带有内含子的GUS基因(uidA)的瞬时表达,研究影响根癌农杆菌介导荔枝胚性愈伤组织遗传转化的若干因素。结果表明:在AGL-1、LBA4404和EHA105三种菌株中,EHA105对荔枝胚性愈伤组织的侵染力最强;采用2d的共培养时间既有较高的瞬时表达率,又避免了农杆菌的过度生长;0.5×10~8个细胞/mL的菌液密度为最佳侵染浓度;继代培养15d的胚性愈伤组织处于最旺盛分裂的时期,是转化的合适受体;愈伤组织转化前干燥处理对uidA瞬时表达率的提高有一定的促进作用。使用优化的农杆菌侵染条件获得了稳定表达uidA基因的荔枝抗性愈伤组织。     

花椰菜和小白菜种间杂种子房培养研究

以小白菜雄性不育系h08015为母本,以花椰菜自交系082005、082009、082010、082063为父本进行种间杂种离体子房培养。结果表明：离体培养时杂种子房发育天数、接种方式、激素水平及父本基因型对杂交种子发芽率均有明显影响。授粉后6 d的子房培养能获得较好的效果;4 d后剥取种子继续培养,获得的种子发芽率高于其他接种方式;不加激素的MS培养基好于添加6-BA及NAA的MS培养基;不同父本基因型最适取材时间不同,多数基因型最佳培养时间为授粉后6 d的子房,个别基因型则是授粉后10 d的子房。     

根癌农杆菌介导马齿苋愈伤组织遗传转化研究

利用马齿苋的叶片诱导出愈伤组织,再以愈伤组织为受体建立了根癌农杆菌介导的遗传转化体系。结果表明:利用该转化体系得到抗性愈伤组织后,对其进行GUS组织化学染色和PCR扩增鉴定,证实为转化子,表明根癌农杆菌介导外源基因转化马齿苋的愈伤组织是完全可行的,为今后通过基因工程手段进行马齿苋的改良奠定了基础。     

根癌农杆菌介导北海道黄杨遗传转化体系的建立

 在建立北海道黄杨(Euonymus japonicus 'Cu zhi')再生体系的基础上,建立其遗传转化体系,以获得转雪花莲外源凝集素(Galanthus nivalis agglutinin,GNA)基因植株。采用根癌农杆菌(Agrrobacterium tumefaciens)　( LBA4404菌株)介导法,研究影响北海道黄杨遗传转化的若干因素。结果表明,预培养与否、菌液浓度、侵染时间、共培养时间等对转化频率都有一定的影响。在遗传转化过程中,不经预培养,根癌农杆菌浓度OD₆₀₀ = 0.6,侵染下胚轴40 min,再共培养3 d,有利于获得最高遗传转化效率。抗性植株经PCR和DNA-Southern blot检测表明,目的基因已整合到北海道黄杨基因组中。     

芸薹属种间F1与羽衣甘蓝回交亲和性及子房培养研究

以大白菜与羽衣甘蓝CMS种间杂种F1为母本,以羽衣甘蓝自交系为父本进行回交,并对杂交子房进行了离体培养.结果表明:上述亲本间存在较强的生殖隔离,花期杂交不结实,蕾期重复授粉提高了亲和力.授粉后9d的杂交子房进行挽救培养效果最佳,离体条件下结籽率10%.其次为授粉后12d及6d的子房,结籽率分别为5%和4.4%.外源激素及其配比对子房离体结实具有极显著影响,以BA2 NAA0.1最佳,结籽率为9%;其次为BA2 NAA0.2,结籽率为3%;BA2 NAA0.3及无激素MS培养基上均未获得饱满种子.     

木本果树遗传转化研究进展

从遗传转化方法和影响遗传转化的因素两方面综述了木本果树遗传转化技术近年来的进展。木本果树遗传转化方法主要有农杆菌介导法和基因枪法;影响转化的因素主要从受体与再生系统、选择标记基因与转化细胞的筛选、培养方法与培养条件等方面进行论述。文章还归纳了导入目的基因并获得再生植株的木本果树种类,并对木本果树基因工程进展及展望进行了讨论。