4种葫芦科植物病毒复合胶体金免疫层析试纸条的研制

使用柠檬酸三钠还原法制备胶体金颗粒,在pH值7.6,蛋白用量10～15μg/mL条件下,制备形成4种葫芦科植物病毒多克隆抗体的稳定胶体金蛋白复合物;设计了双向复合试纸条,使用微定量喷头在试纸条两侧的硝酸纤维素膜上分别喷2条病毒检测线和1条质控线,组装制成免疫层析检测试纸条。结果表明经过条件优化后制备的双向复合试纸条特异性好,可在10min内同时检测4种葫芦科植物病毒,且对不同病毒阳性材料的检测灵敏度可达到稀释103倍以上。     

南瓜花叶病毒胶体金免疫层析试纸条的研制

使用柠檬酸三钠还原法制备25nm粒径的胶体金颗粒,在pH7.6,蛋白用量13μg/mL条件下,制备形成稳定胶体金蛋白复合物;使用微定量喷头在硝酸纤维素膜上喷好病毒检测线和质控线,组装制成免疫层析检测试纸条。结果表明经过条件优化后制备的南瓜花叶病毒试纸条特异性好,可在10min内检测出结果,且对南瓜花叶病毒阳性材料的检测灵敏度可达到稀释104倍。     

警惕新发病毒番茄褐色皱果病毒Tomato brown rugose fruit virus对我国番茄产业的危害

番茄褐色皱果病毒Tomato brown rugose fruit virus (ToBRFV)于2014年首次在以色列发现, 随后传播到欧洲、美洲以及亚洲等地。ToBRFV在番茄叶片上引起花叶, 更重要的是在番茄果实上引起褐色皱缩斑, 导致番茄完全失去商品价值, 是番茄安全生产的重大威胁。为遏制ToBRFV的传播, 多个国家已经将该病毒列入检疫对象。2019年, 我们在山东番茄上检测到该病毒。本文综述了ToBRFV发生与危害、寄主范围和症状、传播方式、基因组结构、检测方法, 并提出了防治建议, 希望有助于防范该病毒在我国的扩散。     

马铃薯X病毒和马铃薯Y病毒胶体金免疫层析试纸条的研制

采用柠檬酸三钠还原法制备胶体金颗粒,标记马铃薯X病毒和马铃薯Y病毒的兔多克隆抗体。用微定量喷头在硝酸纤维素膜上喷好病毒检测线和羊抗兔抗体质控线,制成免疫层析检测试纸条。马铃薯X病毒试纸条检测烟草病汁液可稀释10000倍(重量/体积)马铃薯Y病毒试纸条检测烟草病汁液可稀释1000倍。10min内即可出检测结果。两种试纸条相互测试,未出现交叉反应。用健康和缓冲液对照测试,两种试纸条结果都为阴性。田间采集的马铃薯叶片用试纸条检测的结果和酶联结果相吻合。在密封、干燥、低温的条件下保存,有利于维持试纸条的稳定性。     

瓜类果斑病菌胶体金试纸条的检测应用

瓜类果斑病是一种严重为害西甜瓜作物的细菌病害,胶体金试纸条是对其进行现场检测的主要手段.将中国检验检疫科学研究院研制的瓜类果斑病菌胶体金检测试纸条与市场上商品化的美国Agdia公司同类试纸条进行比较,发现两种试纸条的灵敏度和特异性相当,适用于检测出现疑似果斑病症状的叶片和果实;也可用于种子带菌检测,但易出现假阳性结果....     

番茄褐色皱果病毒SYBR GreenⅠ实时荧光RT-PCR检测方法的建立和应用

根据番茄褐色皱果病毒（tomato brown rugose fruit virus,ToBRFV）外壳蛋白（coat protein,CP）的保守基因序列设计1对特异性引物,建立了基于SYBR Green I的ToBRFV实时荧光RT-PCR检测方法,并对其进行了特异性、灵敏度检测,对自然感染ToBRFV的番茄、辣椒种子进行了检测验证。结果表明,构建的实时荧光RT-PCR检测ToBRFV阳性的番茄种子总RNA和重组质粒标准品的检测低限分别为0.2 ng/μL和50.0拷贝/μL,均为普通RT-PCR检测灵敏度的100倍;对番茄花叶病毒（tomato mosaic virus,ToMV）、番茄环斑病毒（tomato ringspot virus,ToRSV）、番茄黑环病毒（tomato black ring virus,TBRV）、番茄斑萎病毒（tomato spotted wilt virus,TSWV）、辣椒轻斑驳病毒（pepper mild mottle virus,PMMoV）、烟草花叶病毒（tobacco mosaic virus,TMV）和烟草环斑病毒（tobacco ri...     

检测南方水稻黑条矮缩病毒胶体金免疫试纸条的建立

由白背飞虱Sogatella furcifera(Horváth)传播的南方水稻黑条矮缩病毒(Southern rice blackstreaked dwarf virus,SRBSDV)是目前我国南方水稻上危害最严重的病毒,为开发简便、快速、准确的SRBSDV病毒检测技术和检测试剂,以感染SRBSDV的植物粗提液为免疫原,利用杂交瘤技术制备了2株抗SRBSDV的单抗(14A8和15G6),并利用制备的单抗建立了可快速、特异、灵敏地检测SRBSDV的胶体金免疫试纸条。结果表明,2株制备单抗的抗体类型及亚类均为Ig G1、kappa链,单抗腹水的间接ELISA效价均达到10~(-7);Western blot分析表明,2株单抗均与SRBSDV的外壳蛋白亚基有特异反应,而不与水稻黑条矮缩病毒(Rice black-streaked dwarf virus,RBSDV)反应。以制备14A8和15G6单抗分别为捕获抗体和胶体金标记抗体,开发成能在5 min内准确、特异地检测水稻植物和白背飞虱传毒介体体内SRBSDV的胶体金免疫试纸条;灵敏度分析表明,该检测试纸条的检测水稻病叶的灵敏度达到1∶6 400倍(g/m L),检测单头携毒白背飞虱的灵敏度达到1∶51 200倍(单头/μL)。田间样品检测结果表明,该试纸条的检测结果与RT-PCR的符合率达到100%。建立的SRBSDV胶体金免疫试纸条可对南方水稻黑条矮缩病毒进行快速、特异、灵敏的诊断和检测。     

番茄褐色皱果病毒TaqMan 荧光定量RT-PCR检测方法的建立及应用

为建立番茄褐色皱果病毒(tomato brown rugose fruit virus, ToBRFV)TaqMan荧光定量RT-PCR方法,本研究针对ToBRFV RNA依赖的RNA聚合酶(RNA-dependent RNA polymerase, RdRP)基因序列设计了4组特异性引物和TaqMan探针,构建了标准曲线,并对该方法的特异性、灵敏度和实际样品的检测效率进行评估。结果显示,该方法特异性强,与番茄花叶病毒、番茄斑驳花叶病毒、烟草花叶病毒、黄瓜绿斑驳花叶病毒、番茄环斑病毒、番茄黑环病毒、辣椒轻斑驳病毒、烟草环斑病毒和凤果花叶病毒等9种病毒均无交叉反应。建立的标准曲线的R²为0.999,扩增效率为102.096%,检测灵敏度为10 fg/μL,与EPPO PM 7/146(1)推荐的CaTa28、CSP1325方法相当,是常规RT-PCR的100倍;采用该方法成功从60份番茄和辣椒叶片、种子样品中检出10份阳性样品。建立的TaqMan荧光定量RT-PCR方法特异性强、灵敏度高,适用于实际样品中ToBRFV的快速精准检测。     

黄瓜细菌性角斑病免疫胶体金检测试纸条的研制

 应用免疫胶体金技术进行黄瓜细菌性角斑病(Pseudomonas syringae pv.lachrymans)的快速检测研究。为了研制黄瓜细菌性角斑病的免疫胶体金检测试纸条,通过柠檬酸三钠还原法制备胶体金,选择25 nm胶体金标记黄瓜细菌性角斑病菌多克隆抗体(CMb)。采用双抗夹心法,将CMb-胶体金复合物包被在胶体金结合垫上,将羊抗兔二抗和CMb包被在硝酸纤维素膜上,分别作为质控线(C)和检测线(T),组装成试纸条。该试纸条检测灵敏度为106 cfu/mL,与唐菖蒲疮痂病菌(Pseudomonas fluorescens biovarⅡ)等26个菌株无交叉反应,特异性强,检测时间为15 min。稳定性试验表明试纸条在37℃条件下放置15 d可保持检测结果的可靠性。用试纸条对田间采集的病叶进行检测,C线和T线清晰可见,缓冲液对照呈阴性反应。本试纸条可应用于生产上黄瓜细菌性角斑病早期快速检测,进而指导病害防治。     

进境番茄种子中番茄褐色皱纹果病毒的检测鉴定

番茄褐色皱纹果病毒(tomato brown rugose fruit virus,ToBRFV)是烟草花叶病毒属新成员,番茄和辣椒是其主要寄主,被中国、欧盟、美国、澳大利亚、土耳其、新西兰、智利、阿根廷、俄罗斯、哈萨克斯坦、泰国等国家或地区纳入需检疫的有害生物.我们利用电镜观察、RT-PCR和SYBR Green实时...     

樱桃小果病毒1号胶体金免疫层析试纸的研发与应用

近年来,病毒病在甜樱桃主产区的发生呈上升趋势,制约了甜樱桃产业升级和发展。能够侵染甜樱桃的病毒种类中,樱桃小果病毒1号(little cherry virus 1,LChV-1)导致樱桃果实缩小,彻底丧失经济价值,对甜樱桃产量影响较大。LChV-1通常具有潜伏侵染的特性,在樱桃苗期难以通过症状进行判断。同时,多数品种对LChV-1敏感,因此该病毒的早期检测对甜樱桃的生产尤为重要。传统的病毒检测手段需要专业仪器,不能满足田间快速检测的需求。本研究获取了LChV-1外壳蛋白的多克隆抗体,并研发了一种能够准确检测LChV-1病毒的胶体金免疫层析试纸,确定了胶体金的最佳抗体标记浓度为0.24 mg/mL,检测线最佳重组蛋白浓度为0.25 mg/mL,质检线最佳羊抗兔IgG抗体浓度为0.04 mg/mL。运用该试纸检测只需10～15 min,检测时间短、成本低、结果容易判断,可用于田间快速检测。本研究为樱桃小果病的综合防控提供了有效的监测和检测手段。     

柑橘溃疡病菌快速诊断胶体金速测卡的研制

将制备并提纯的抗Xcc单克隆抗体、多克隆抗体及重组抗体,采用间接ELISA方法对比其效价和特异性,筛选用于胶体金速测卡的最优抗体;采用柠檬酸三钠还原法制备胶体金颗粒,标记抗Xcc单抗Xcc-2D8,固定于金标垫上;利用双抗夹心原理,将单抗Xcc-2D6和羊抗鼠抗体分别固定于硝酸纤维素膜上,作为检测线(T线)和质控线 (C线),经试验条件优化,组装胶体金速测卡密封干燥保存.对Xcc菌悬液及柑橘样本浸泡液进行检查.结果表明ELISA方法筛选出2株特异性强、稳定性好的抗体(Xcc-2D8效价为1∶128 000倍、Xcc-2D6效价为1∶256 000倍),应用于胶体金速测卡的研发;所研制速测卡对Xcc菌悬液的最低检测下限为1×103～1×104 cfu/mL,对多个地区的206份柑橘样本进行实际检测所得结果与qPCR方法所得结果具有较高一致性(kappa值=95.15％),混杂的柑橘组织液对检测结果无影响,检测时间控制在10 min以内,检测常见细菌及植物病菌显示特异性良好,各批次速测卡无批间差异,速测卡保存方便稳定性良好.     

黄瓜细菌性白枯病病菌检测试纸条的研制

应用胶体金免疫层析技术研制了黄瓜细菌性白枯病病菌[Pseudomonas viridiflava (Burkholder 1930) Dowson1939]检测试纸条.采用柠檬酸三钠法还原氯金酸制备胶体金,标记黄瓜细菌性白枯病病菌多克隆抗体,将金标抗体喷涂在结合垫上,将黄瓜细菌性白枯病病菌抗体和羊抗兔二抗包被在硝酸纤维素膜上作检测线和质控线,组装制成黄瓜细菌性白枯病病菌检测试纸条.用试纸条检测黄瓜细菌性白枯病病菌的结果表明,制备的试纸条特异性好,与其他常见植物病原细菌等无交叉反应,对黄瓜叶片中黄瓜细菌性白枯病病菌的最低检测限为106 cfu/mL,能在5～15 min内快速检测出黄瓜细菌性白枯病病菌,适合田间现场快速检测黄瓜细菌性白枯病病菌.     

应用IC-RT-PCR方法检测番茄环斑病毒

以番茄环斑病毒阳性样品为研究材料,根据GeneBank(核酸序列数据库)中的序列设计特异性引物进行IC-RTP-CR(免疫反转录聚合酶链式反应,下同)扩增,获得产物克隆到pMD18-T载体中,经测序后与目标序列(ToRSVL19655)比较,核苷酸同源性为87.3%。通过实验建立了检测该病毒的IC-RT-PCR方法。该方法对其他样品核酸提取困难而抗体较容易制备的病毒检测同样具有借鉴意义。