实时荧光定量PCR技术在湖南油菜根肿病菌检测中的应用

为完善湖南油菜根肿病的监测预警体系, 分析油菜根肿病的发生与芸薹根肿菌休眠孢子量的关系, 防止湖南油菜根肿病进一步蔓延?本研究依据芸薹根肿菌ITS序列设计了一对特异性引物, 通过制备标准质粒构建了快速?精准的实时荧光定量PCR检测方法?其检测灵敏度为3×10-10 μg/μL, 比常规PCR 高100 倍; 利用建立的方法检测了来自湖南各地土壤样品中芸薹根肿菌的休眠孢子数量, 64份土样中的休眠孢子含量基本大于104个/g, 所检测的土样中孢子含量最高为2.22×107个/g?据实地调查, 当土壤中休眠孢子数量大于 104个/g 时, 油菜发生根肿病的风险较大, 休眠孢子含量较高的田块其发病程度也较为严重?结果表明, 建立的实时荧光定量PCR检测方法能对油菜根肿病进行早期诊断, 为湖南油菜根肿病发生的监测预警提供有效技术参考?     

土壤大丽轮枝菌微菌核的快速定量检测

 微菌核是大丽轮枝菌在土壤中的主要存活结构和黄萎病的初侵染来源。对土壤中大丽轮枝菌微菌核进行定量是黄萎病监测和预警的基础。本研究以大丽轮枝菌Internal Transcribed Spacer (ITS)区特异性引物对P1/P2扩增产物的重组质粒为标准品,构建SYBR Green I实时荧光定量PCR反应的标准曲线,结合土样水筛法建立了土壤大丽轮枝菌微菌核定量检测体系。同时,建立了土壤中微菌核数量与棉花黄萎病发病率的关系模型。结果表明,实时定量PCR检测灵敏度比常规PCR高10倍,检测下限为1个微菌核/克土,在5.54×10²～5.54×10⁷copies范围内,DNA拷贝数的对数值与Ct值具有良好的线性关系。建立的土壤中微菌核个数n与Ct值之间的关系为n=e^7.3-Ct/3.905。温室人工接种微菌核数量与棉花黄萎病发病率间的线性关系为y=2.710n+0.251。     

基于根肿菌早期侵染量的白菜抗性分析

为探究不同抗性白菜品种对根肿菌侵染量的影响,通过水培法观测4个白菜品种接种根肿菌后其在寄主根内的发展动态,实时荧光定量PCR检测技术对同期根内含菌量进行分析,并结合温室盆栽试验获得的各品种发病数据进行相关性分析。结果表明,早熟长江5号根肿病的发病率和病情指数分别为82.5%和36.2,华良早五号为66.7%和37.5,CR-春美为68.9%和36.0,可归为感病品种,而CR-英雄为52.5%和16.5,可归为抗病品种;水培法接种观测和PCR定量结果显示,根毛侵染率、皮层侵染数以及根内含菌量均表现为CR-英雄最低,显著低于其它3个品种。根毛侵染率、皮层侵染数、根内含菌量、发病率四者间呈显著相关,其R2最大值变幅为0.84~0.98,且根毛侵染率与根内含菌量、发病率与根内含菌量的最大相关系数均出现在第6天,说明根肿菌早期侵染量直接影响白菜根肿病的发生程度。表明根内早期侵染是根肿菌致病的关键环节,通过水培法观测并结合实时荧光定量PCR检测可以评价品种的抗性,可作为根肿病抗性评价的一种方法。     

柴达木盆地盐渍化土壤养分和酶活性特征

为探讨柴达木盆地不同程度盐渍化土壤养分和酶活性特征，沿察尔汗盐湖至昆仑山方向依次选择5个样点，分析土壤养分和酶活性特征及其二者的相关性。结果表明：除土壤全钾外，土壤盐渍化程度、土壤深度及其两者交互作用对土壤养分含量及土壤酶活性的影响均达到显著水平(P<0.05)。在盐渍化程度较低的土壤，养分有效性(速效钾除外)和酶活性较高，且随土壤深度的增加而降低。以有机碳和蔗糖酶为例，在盐渍化程度最低的S5样地中含量为13.83 g·kg^-1和21.01 mg·g^-1·d^-1(0～5 cm)、12.85 g·kg^-1和19.29 mg·g^-1·d^-1(5～10 cm)、9.83 g·kg^-1和12.19 mg·g^-1·d^-1(10～20 cm)，显著高于盐渍化程度最高S1中的8.56 g·kg^-1和1.41 mg·g^-1·d^-1(0～...     

一种改进的尖孢镰刀菌的实时荧光定量PCR检测方法

为实现荧光定量PCR对土壤病原真菌数量更为高效、灵敏的检测,本研究将液体培养的孢子悬浮液和长年耕作的水稻土制作成孢子浓度为4×10~1~4×10~6 spore/g的带菌土,采用MoBio PowerSoil@DNA Isolation Kit提取模拟带菌土壤总DNA,引入常规PCR预扩增包含qPCR目标序列的1 446bp片段,以预PCR产物为模板进行qPCR,构建荧光定量PCR标准曲线。研究结果表明:以试剂盒提取的带菌土壤总DNA为模板绘制的qPCR标准曲线相关系数r为0.985,检测下限为4×10~3 spore/g土;引入预PCR后,qPCR标准曲线相关系数r为0.974,检测下限为4×10~2 spore/g土,较未引入时提高了10倍,结合不同土壤病原真菌的特异性引物,该检测方法可为土壤病原真菌的有效定量检测提供技术支撑。     

青花菜根肿病苗期抗性鉴定技术的建立

为建立快速、有效的青花菜根肿病苗期抗性鉴定技术,将芸薹根肿菌Plamodiophora brassicae Woron.人工接种于高感根肿病青花菜自交系90196,研究了接种菌液浓度、接种寄主苗龄、接种基质p H和接种方法等对人工接种鉴定效果的影响。结果表明,在一定范围内,根肿病发病率及病情指数随着接种菌液浓度的升高而增大,接种菌液浓度为3×108CFU/m L时,发病率及病情指数分别为97.22%和86.11,可以反映寄主真实的抗性水平;接种寄主苗龄为2~6叶期均能使植株发病,但2~3叶期发病效果最佳;接种基质偏酸性(p H 5~6)有利于根肿病的发生;使用伤根灌菌法进行鉴定,青花菜根肿病发病率和病情指数均最高,分别为100.00%和88.10,优于蘸根法和浸芽法。用已知抗性水平的12个自交系和8个杂交种进行验证,鉴定结果表明该苗期抗性鉴定技术可客观反映供试材料的实际抗性水平。     

甜瓜黄斑病毒SYBR Green Ⅰ实时荧光定量PCR方法

为建立检测甜瓜黄斑病毒(melon yellow spot virus, MYSV)的SYBR Green Ⅰ实时荧光定量PCR(qPCR)方法。基于MYSV核衣壳蛋白基因保守序列设计qPCR特异性引物对,针对引物退火温度、引物浓度、特异性和敏感性进行系列优化。结果显示,优化后的qPCR方法最适退火温度为61.3℃,最适引物浓度为0.65μmol·L^-1,特异性强,灵敏度高,比PCR高100倍。以携带目的基因片段的重组质粒为标准品,构建的qPCR标准曲线循环阈值与模板浓度呈良好的线性关系,相关系数为0.999 7。实验样品验证表明建立的qPCR方法可用于MYSV的定量检测。     

茎瘤芥(榨菜)根肿病综合防治方法

正茎瘤芥(榨菜)根肿病是由芸薹属根肿病菌(Plasmodiophora brassicae Worom)引起的重要土传性病害,自1994年涪陵榨菜首次受到根肿病菌的侵害以来,迅速扩展蔓延并成为制约榨菜生产的主要病害之一~([1])。近年来,该病侵染性强、传播速度快、传播方式多,并在土壤中可保持长期侵染活性,防治难度大~([2])。笔者对榨菜根肿病的研究进行综述,为防治该病害提供参考依据。1发病症状和病原菌     

三重PCR检测黄瓜炭疽病菌、菌核病菌和细菌性萎蔫病菌

 本试验建立一种可同时检测黄瓜炭疽病(Colletotrichum orbiculare)、黄瓜菌核病(Sclerotinia sclerotiorum(Lib.)de Bary)和黄瓜细菌性萎蔫病(Erwinia tracheiphila)等黄瓜主要病害病原菌的三重PCR检测体系。采用正交试验设计方法, 对三重PCR的影响因素分析研究, 进行退火温度优化, 并以3个引物组、Taq DNA聚合酶、dNTP和Mg²⁺ 共6因素3水平进行多重PCR体系优化, 成功建立了适合黄瓜主要病害的三重PCR最佳检测体系, 即25 μL的反应体系中含有0.24 μmol·L^-1 CY1/CY2;0.72 μmol·L^-1 SSFWD/SSREV;0.336 μmol·L^-1 ET-P1/ ET-P2;1 U Taq聚合酶;0.15 mmol·L^-1 dNTP;1 mmol·L^-1 MgCl₂, 最适退火温度为63℃。该方法能够快速从田间黄瓜发病植株和根围土壤中将黄瓜炭疽病菌、黄瓜菌核病菌和黄瓜细菌性萎蔫病菌检测出来, 灵敏度可以达到10 pg·μL^-1。     

臭氧水消毒土壤与木霉菌组合防治白菜根肿病的效果

为推动白菜根肿病绿色防控,开展臭氧水消毒土壤与木霉菌组合防治白菜根肿病研究.通过温室盆栽试验,比较了不同浓度臭氧水对土壤中芸苔根肿菌的消减效果及其与木霉菌组合处理对根肿病的防效和对白菜生长的影响.结果表明:臭氧水可显著降低土壤中芸苔根肿菌的丰度,消减效果与浓度正相关,8 mg/L的臭氧水可将病土中含量为105-109c...     

向日葵黑茎病菌TaqMan-MGB探针实时荧光快速检测方法

 向日葵黑茎病菌是我国进境检疫性有害生物名录中的一种检疫性真菌。根据向日葵黑茎病菌及其近似种的ITS序列差异,设计并合成特异性引物和探针,建立了向日葵黑茎病菌的实时荧光PCR检测方法。特异性试验结果表明,该检测方法能特异性检测向日葵黑茎病菌;灵敏度试验结果表明,最低检测限量为20 μL反应体系中总DNA含量0.1 pg;实时荧光PCR优化反应条件为引物终浓度0.6 μmol·L^-1,探针终浓度0.3 μmol·L^-1。实际样品检测结果表明,该方法可用于疑似携带向日葵黑茎病菌样品的检测与初筛。此方法快速、灵敏,整个反应过程约1 h,检测过程完全闭管,无需PCR后续处理,为早期快速检测向日葵黑茎病菌提供了重要参考。     

枯草芽胞杆菌微粉剂的研制及其对黄瓜白粉病的防治效果

 以枯草芽胞杆菌母药为研究对象,通过对载体、分散剂、表面活性剂、保护剂的筛选,确定了枯草芽胞杆菌微粉剂的最佳配方。其配方为:枯草芽胞杆菌母药50%、载体白炭黑20%、分散剂萘磺酸钠盐甲醛缩合物(NNO)2%、表面活性剂烷基萘磺酸盐(EFW)3%、保护剂羧甲基纤维素(CMC)1.5%、载体硅藻土补足至100%。测定结果表明:枯草芽胞杆菌微粉剂含菌量为2.11×10¹⁰ CFU·g^-1,分散指数89.56,浮游指数87.57,坡度角74°,pH 6.1,杂菌率2.1%,含水率0.67%,粒径8.15 μm,热贮分解率为4.67%,产品各项指标均达到标准。盆栽条件下,枯草芽胞杆菌微粉剂用量1 000 g·(hm²)^-1时喷粉对黄瓜白粉病的保护效果优于治疗效果,防效分别为89.08%和84.95%;田间试验,枯草芽胞杆菌微粉剂在用量为1 000 g·(hm²)^-1时喷粉对黄瓜白粉病的保护效果为80.66%。     

枯草芽胞杆菌微粉剂的研制及其对黄瓜白粉病的防治效果

 以枯草芽胞杆菌母药为研究对象,通过对载体、分散剂、表面活性剂、保护剂的筛选,确定了枯草芽胞杆菌微粉剂的最佳配方。其配方为:枯草芽胞杆菌母药50%、载体白炭黑20%、分散剂萘磺酸钠盐甲醛缩合物(NNO)2%、表面活性剂烷基萘磺酸盐(EFW)3%、保护剂羧甲基纤维素(CMC)1.5%、载体硅藻土补足至100%。测定结果表明:枯草芽胞杆菌微粉剂含菌量为2.11×10¹⁰ CFU·g^-1,分散指数89.56,浮游指数87.57,坡度角74°,pH 6.1,杂菌率2.1%,含水率0.67%,粒径8.15 μm,热贮分解率为4.67%,产品各项指标均达到标准。盆栽条件下,枯草芽胞杆菌微粉剂用量1 000 g·(hm²)^-1时喷粉对黄瓜白粉病的保护效果优于治疗效果,防效分别为89.08%和84.95%;田间试验,枯草芽胞杆菌微粉剂在用量为1 000 g·(hm²)^-1时喷粉对黄瓜白粉病的保护效果为80.66%。     

天山高寒草原植物叶片氮磷化学计量特征对氮沉降的响应

人类活动和气候变化导致的大气氮沉降急剧升高,将会影响高寒草原植物养分循环。为了研究氮沉降对高寒草原植物养分含量及生态化学计量学特征的影响。依托2009年在新疆天山巴音布鲁克高寒草原设置的长期氮沉降研究平台,于2017年7月和10月采集溚草（Koeleria cristata）、二裂委陵菜（Potentilla bifurca）和天山赖草（Leymus tianschanicus）3种植物的成熟叶和老叶,分析3种植物叶片N、P元素生态化学计量对不同施氮水平的响应规律。结果表明：① 3种植物养分浓度及其化学计量比在成熟叶和老叶之间存在较大差异,成熟叶和老叶的N、P含量分别为12.78 mg·g^-1、0.88 mg·g^-1和6.88 mg·g^-1、0.46 mg·g-1mg·g^-1。3种植物成熟叶和老叶的N元素含量均为：二裂委陵菜>天山赖草>溚草,P元素含量同N元素含量趋势一致;② 氮添加增加了成熟叶和老叶N浓度,分别达12%和48%;成熟叶与老叶P浓度对氮添加的响应规律不一致,成熟叶P浓度对氮添加的响应与物种有关,而老叶P浓度呈一致的下降趋势;氮添加对成熟叶和老叶N∶P的比值影响亦不同,其中相对于成熟叶,老叶的N∶P呈显著增加趋势。③ 植物叶片的N元素、P元素和N∶P比三者之间的相关分析表明:N元素和N∶P之间呈显著正相关关系(P<0.05),在生长旺盛期和枯黄期,溚草和天山赖草的N与P元素之间没有发现显著相关性(P>0.05),而二裂委陵菜呈现一定的差异性,在生长旺盛期二裂委陵菜叶片N与P元素呈显著的正相关、枯黄期呈显著的负相关(P<0.05)。表明长期氮的添加显著影响了3种植物叶片的养分含量和生态化学计量,不同物种间存在一定差异,未来氮沉降升高将会影响天山山地草原的植物养分循环。     

基于Ypt1靶标的大豆疫霉环介导等温扩增技术的研究

大豆疫霉侵染大豆引起的根腐病是大豆生产上的毁灭性病害之一。本研究以Ypt1基因作为靶标,利用环介导等温扩增(LAMP)技术,设计了特异性检测体系,整个过程仅需60 min,即可通过肉眼直接目测检测结果。反应后经浊度仪验证浊度变化、琼脂糖凝胶进行电泳验证和在扩增前加入染料HNB(羟基蔡酚蓝)作为反应指示剂验证扩增结果。特异性检测中,111个大豆疫霉菌株均能产生浊度曲线和扩增到梯形状的条带,同时HNB显色观察到天蓝色的阳性反应,而其它疫霉、腐霉和真菌供试菌株中均没有观察到这些现象;在灵敏度检测中,PsYpt1-LAMP技术最低检测限达到100 pg·μL~(-1),比普通PCR技术的最低检测限高出10倍;在田间应用方面,PsYpt1-LAMP检测技术明显提高了检测效率。本研究建立的LAMP检测体系可用于口岸和田间对大豆疫霉的快速检测。     

扁桃拟茎点霉TaqMan荧光定量PCR检测方法的建立与应用

扁桃拟茎点霉(Phomopsis amygdali)引起的桃缢缩溃疡病是桃生产上重要的病害之一。带菌苗木及接穗是病害向无病区传播的主要途径。严格的检疫措施是保证无病区健康生产的关键。准确、灵敏、快速的检测方法是严格执行检疫措施及研究病害发生规律的有力工具。将扁桃拟茎点霉组蛋白H3(histone H3)基因与其近缘种比对发现,该基因特异性强,适合作为分子检测的靶标。针对histone H3基因为靶标,设计了特异性引物和Taq Man探针,建立了扁桃拟茎点霉的荧光定量PCR检测方法。结果发现,该方法只能特异识别扁桃拟茎点霉。检测灵敏度可达4×10~1copies·uL~(-1),比常规PCR检测方法高1 000倍;孢子检测最低限达2个孢子,比常规PCR检测方法高10倍,且仅需1 h即可完成检测。该方法用于田间样品检测,扁桃拟茎点霉的阳性检出率达86%,高于分离培养法和常规PCR检出结果。本研究建立的基于Taq Man探针的荧光定量PCR检测体系可用于田间对扁桃拟茎点霉的快速检测。     

乙酸对淡紫紫孢菌生长发育及杀线虫能力的影响

为探究乙酸对淡紫紫孢菌生长发育及杀线虫能力的影响,比较了不同乙酸浓度下淡紫紫孢菌的生长速率、孢子萌发率、菌落形态及产孢量的变化。在0~200μg·mL~(-1)的浓度范围内,乙酸对淡紫紫孢菌的生长发育无抑制作用;淡紫紫孢菌在PDB中培养3 d后,发酵液中乙酸含量为146μg·mL~(-1),随着培养时间的增加,养分不断消耗,发酵液中乙酸产量逐渐减少;当碳源匮乏时,无乙酸产生。在碳源匮乏时,淡紫紫孢菌能够将乙酸根作为碳源利用,在3~10 mg·mL~(-1)的乙酸根浓度范围内,淡紫紫孢菌表现出较好的生长态势。此外,乙酸能够增强淡紫紫孢菌的杀线虫效果,随着乙酸浓度的增加,抑制根结线虫卵孵化和杀二龄幼虫(J2)的效果呈上升趋势。     

基于URP-PCR多态性片段的苦瓜枯萎病菌特异性检测技术的建立

 通过URP(Universal Rice Primers)-PCR分析尖孢镰孢菌苦瓜专化型基因组DNA扩增片段多态性,筛选检测尖孢镰孢菌苦瓜专化型的特异性引物,并建立了基于该引物的PCR检测方法。结果表明,特异性引物为FOMM-SPF/FOMM-SPR, PCR检测体系为25 SymbolmAL,包括2SymboltB Green Taq Master Mix 12.5 SymbolmAL,10 mmol·L^-1 的上下游引物各1 SymbolmAL,模板DNA 1 SymbolmAL,灭菌去离子水补足至25 SymbolmAL;PCR程序为95℃预变性3 min,94℃变性15 s,57℃退火30 s,72℃延伸20 s,共30个循环,循环结束后72℃延伸5 min;特异性扩增片段大小294 bp,检测灵敏度为2 ng·μL^-1 DNA或50个孢子·500 mg^-1土壤。该引物及其检测方法对尖孢镰孢菌苦瓜专化型的检测特异性好、灵敏度高,可以从土壤和植物样品中快速准确地检测出苦瓜枯萎病菌,无需病原菌的分离培养和致病性检测,对苦瓜枯萎病的早期诊断和预警及有效防控具有重要的指导意义。     

利用常规PCR和实时荧光定量PCR检测杨梅凋萎病菌

凋萎病是近年来危害杨梅的主要病害。为了快速灵敏的检测杨梅凋萎病菌(Pestalotiopsis versicolor和P.microspora),本研究开发了常规PCR和SYBR Green实时荧光定量PCR技术各一套。利用P.versicolor(JN861773)和P.microspora(JN861776)的ITS1-5.8S rDNA-ITS2序列的相同部分设计引物对(Pvm1L/Pvm1R)。该引物对利用常规PCR技术能特异性扩增出杨梅凋萎病菌188 bp的目标产物而对照菌株则呈阴性。该常规PCR体系能够检测人工接种后21 d和田间自然发病的有病症杨梅组织中的凋萎病菌,检测下限是0.6×10~5拷贝数。利用Pvm1L/Pvm1R进行SYBR Green实时荧光定量PCR,检测灵敏度是常规PCR的100倍,检测下限是0.6×10~3拷贝数,能够检测出人工接种及田间已经感染但尚未表现症状的杨梅组织中的凋萎病菌。这两项技术简单、快速、灵敏特异性强,可以应用于杨梅凋萎病的诊断和苗木检疫。     

石楠叶斑病病原鉴定及对药物敏感性测定

石楠(Photinia serrulata Lindl.)是华中地区一种重要的绿化树种。近年来在武汉地区石楠上发现一种新的叶斑病。本文通过组织分离法、致病性测定等从病株分离得到致病病原菌,并通过形态学鉴定、分子生物学鉴定等,最终确定该致病菌为小孢拟盘多毛孢(Pestalotiopsis microspora)。在室内测定了P.microspora对7种常见杀菌剂的敏感性,结果表明,7种杀菌剂对P.microspora的菌丝生长均有抑制作用,但不同杀菌剂之间EC50值相差较大。450 g·L~(-1)咪鲜胺水剂、70%甲基托布津可湿性粉剂、10%苯醚甲环唑水分散粒剂EC50值分别为0.099、0.142和0.631μg·mL~(-1)。25%三唑酮可湿性粉剂EC50值在7种杀菌剂中最大,为37.625μg·mL~(-1)。这是国内外关于P.microspora引起石楠叶斑病的首次报道。