牛原代肌肉卫星细胞和前体脂肪细胞不同混合比例共培养细胞活性的比较

为探索不同细胞混合比例对牛原代肌肉卫星细胞和前体脂肪细胞共培养体系细胞活性的影响,本研究采集新生秦川犊牛背最长肌和肾周脂肪,分离提取肌卫星细胞和前体脂肪细胞,采用DMEM/F12培养基,建立不同血清浓度(5%、10%、15%、20%的胎牛血清,FBS)的牛原代肌肉卫星细胞和前体脂肪细胞的共培养体系,然后通过分别调整各共培养体系中肌卫星细胞和前体脂肪细胞的混合比例(肌肉细胞∶脂肪细胞=10∶1、5∶1、2∶1),来研究细胞混合比例对各共培养体系的影响。共培养14d,每两天更换培养基,并采用MTT染色法测定细胞活性。统计分析后发现∶随着共培养体系中前体脂肪细胞比例增加,共培养细胞活性增加;共培养10d以后不同混合比例细胞活性有着显著差异(P<0.05);混合比例为2∶1时共培养细胞活性最高。综上,为了获得最好的牛肌卫星细胞和前体脂肪细胞共培养效果,达到较高的细胞培养活性,建议牛肌卫星细胞和前体脂肪细胞按5∶1或2∶1的混合比例进行共培养。     

犬造血干细胞分离、鉴定和培养特性研究

【目的】研究骨髓来源的犬造血干细胞(cannie hematopoietic stem cells, cHSCs)的分离、鉴定和培养特性,建立体外培养最优条件,为临床应用奠定理论基础。【方法】取3月龄犬骨髓,采用Ficoll密度梯度离心法分离出单个核细胞(mononuclear cells, MNCs),通过流式细胞仪分选cHSCs并进行体外悬浮培养。用CCK-8法检测cHSCs在不同培养基、不同浓度胎牛血清(FBS)、不同细胞因子、不同cHSCs与cBMSCs接种比例条件下的细胞活性,筛选最优体外培养方案。使用台盼蓝染色计数法统计体外共培养1、7、14、21 d后cHSCs增殖情况。利用流式细胞术和实时荧光定量PCR分别检测P0、P1、P2和P3代cHSCs表面标志物CD34分子阳性百分比以及干性基因性别决定相关基因簇2(SOX2)和八聚体结合蛋白-4(OCT-4)的mRNA表达水平。【结果】成功分离获得cHSCs,不同培养基中细胞活性无显著差异(P>0.05);不同浓度FBS中,5%FBS组cHSCs活性显著低于10%、15%、20%FBS组(P<0.05),10%FB...     

胎牛血清及热处理家蚕体液对家蚕微孢子虫体外增殖的影响

对家蚕微孢子虫在体外增殖的研究表明 :培养基中胎牛血清 (FBS)添加量在 5 %～ 15 %范围内与微孢子产生量呈线性正相关关系 ;加热家蚕体液对家蚕微孢子虫体外增殖的促进作用则主要表现在与FBS的复合效应上 ,5 %FBS +5 %加热家蚕体液添加区的微孢子产生数为 10 %FBS添加区的 133 5 2 %。     

梅花鹿鹿茸间充质层细胞的体外培养和冷冻保存

为了研究梅花鹿鹿茸间充质层细胞的生物学特性,取梅花鹿鹿茸生长顶端间充质层组织,分离间充质层细胞进行体外培养及冷冻保存。结果表明:在含10%胎牛血清(FBS)的DMEM培养基中,鹿茸间充质层细胞能进行短期体外培养,培养的细胞呈成纤维细胞样,培养7 d可长至汇合。以含5%二甲基亚砜(DMSO)和10%FBS的DMEM为冻存液,经梯度降温后冻存,间充质层细胞复苏后存活率较高。在4℃条件下,间充质层组织在含10%FBS的DMEM中可保存7 d。     

牛骨髓间充质干细胞体外培养体系的优化

结合红细胞裂解法和全骨髓细胞贴壁培养法分离获得胎牛骨髓MSCs(bBMSCs),经贴壁培养、传代纯化后对其生物学特性进行检测,进而设定不同浓度胎牛血清-血清替代物(FBS-KSR)组合培养基(10%FBS、5%FBS+5%KSR、2.5%FBS+7.5%KSR、10%KSR),对第5代bBMSCs进行体外培养,并对其增殖、多能性及凋亡情况进行检测。结果显示:原代bBMSCs具有贴壁特性,呈成纤维样细胞形态,表达MSCs相关标记分子CD73、CD90、CD105,不表达相关阴性分子标记CD45、CD34;体外具有成脂及成骨分化潜能,生长曲线呈典型的"S"型。CCK8检测显示,5%和7.5%的KSR可作为FBS的替代品,对bBMSCs体外增殖有显著促进作用。荧光定量PCR结果显示:添加不同浓度KSR后增殖相关基因bFGF mRNA水平显著升高(P0.01),进一步证明KSR可以提高bBMSCs的增殖能力;多能性相关基因检测显示,添加KSR组中Oct4、Sox2mRNA表达水平也显著上调;凋亡相关基因检测显示,5%FBS+5%KSR组中抗凋亡基因Bcl2mRNA水平显著上调,而2.5%FBS+7.5%KSR组中Bcl2表达显著下降而促凋亡基因Bax mRNA水平显著提高。推测这是由于细胞传代培养1周时,各组中细胞可能处于生长周期的不同时期,5%FBS+5%KSR和2.5%FBS+7.5%KSR组中细胞已到达平台期,发生生长抑制,需及时传代,而10%FBS组中细胞仍处于对数生长期,未发生细胞凋亡。这也进一步说明,适当浓度KSR缩短了bBMSCs体外增殖周期,提高了细胞的增殖效率。结果表明:培养基中适当添加KSR有利于bBMSCs的体外扩增和多能性维持,同时需注意根据增殖周期变化调整传代时间,这对进一步优化牛及其他动物BMSCs的体外培养条件具有借鉴意义。     

不同冻存液对奶牛乳腺上皮细胞冻存质量的影响

试验旨在探究奶牛乳腺上皮细胞(bovine mammary epithelial cells,BMECs)最佳的冻存液以改善乳腺上皮细胞的冻存质量。BMECs传至第5代后分别加入以下10种不同配方的冻存液。A组:85%DMEM+10%胎牛血清+5%DMSO;B组:80%DMEM+10%胎牛血清+10%DMSO;C组:75%DMEM+10%胎牛血清+15%DMSO;D组:70%DMEM+10%胎牛血清+20%DMSO;E组:85%DMEM+5%胎牛血清+10%DMSO;F组:75%DMEM+15%胎牛血清+10%DMSO;G组:70%DMEM+20%胎牛血清+10%DMSO;H组:80%DMEM+10%胎牛血清+10%甘油;I组:70%DMEM+10%胎牛血清+20%甘油;J组:60%DMEM+10%胎牛血清+30%甘油,冻存前统一调整细胞密度到1×106个/mL冻存。分别对复苏后的细胞进行台盼蓝染色计算存活率和PI/Hoechst33258双染计算凋亡率。结果表明,BMECs经不同冻存剂冻存复苏后,细胞活力、形态学及凋亡率表现有所不同,其中B组和G组的活力和24h贴壁率较其他组高,二者的凋亡率较低,二者之间差异无显著性(P>0.05);传代后B组细胞的生长状况最好。     

共培养体系中猪骨骼肌卫星细胞对肌内前体脂肪细胞脂质沉积的影响

本试验旨在研究共培养体系中猪骨骼肌卫星细胞对肌内前体脂肪细胞脂质沉积的影响。试验分离培养了猪骨骼肌卫星细胞和肌内前体脂肪细胞,2种细胞分离培养鉴定后,接种于Transwell细胞小室共培养板进行共培养,待细胞密度达到90%以上分别进行诱导分化。骨骼肌卫星细胞诱导分化8 d后,检测肌内前体脂肪细胞分化水平、分化标志基因的表达以及脂质代谢关键酶的表达。结果显示:与肌内前体脂肪细胞单独培养相比,共培养体系内肌内前体脂肪细胞的脂滴数量和脂滴面积极显著减少(P0.01),肌内前体脂肪细胞增殖分化转录因子过氧化物酶体增殖物激活受体γ和CCAAT增强子结合蛋白的基因和蛋白表达水平极显著下降(P0.01),肌内前体脂肪细胞的乙酰辅酶A羧化酶、脂肪酸合成酶的基因和蛋白表达水平极显著下降(P0.01)。由此可见,共培养体系中猪骨骼肌卫星细胞对肌内前体脂肪细胞脂质沉积具有抑制作用。     

水牛生精上皮细胞的冷冻保存

为探讨水牛睾丸生精上皮细胞冷冻保存的适宜冷冻保护剂及其浓度,在DMEM中分别添加不同浓度的冷冻保护剂二甲基亚砜(DMSO)、甘油(G)、丙二醇(PG)和乙二醇(EG),以及10%的胎牛血清(FBS),对3～5月龄水牛生精上皮细胞进行冷冻保存,解冻后台盼蓝染色测定细胞活率.结果显示,当以0%,5%.10%,15%,20%DMSO添加时,10%DMSO组的细胞解冻后活率均显著高于其他各组(P<0.05);当以0%,20%,25%,30%,35%,40%G添加时,35%G组的细胞解冻后活率均显著高于其他各组(P<0.05);当以0%,5%,10%,15%,20%,25%PG添加时,15%～25%PG各组的细胞解冻后活率均显著高于其他各组(P<0.05),但以20%PG组为最高;当以0%,5%,10%,15%,20%EG添加时,5%～20%EG各组的细胞解冻后活率均显著高于0%EG组,但以10%EG组为最高;而对4种冷冻保护剂各最优浓度组的细胞解冻后活率比较,10%DMSO、35%G组的细胞活率均显著高于20%PG、10%EG组(P<0.05).结果表明,以添加10%DMSO或35%G于含10%FBS的DMEM冷冻液中,采用两步慢速冷冻,液氯保存,37℃水浴1 min解冻,是一种具有较高复苏率的冷冻保存水牛生精上皮细胞的方法.     

猪骨骼肌卫星细胞体外分离培养研究进展

猪骨骼肌是动物机体重要的运动组织及人类主要的肉食来源,也是研究肌肉生长发育和疾病的良好模型。猪出生后,骨骼肌的生长发育、损伤修复都需要肌卫星细胞的参与,体外分离培养猪骨骼肌卫星细胞是深入研究骨骼肌生长发育及疾病发生机理的基础,是在细胞水平进行分子功能验证的前提。随着肌肉发育和病理分子机制研究的不断深入,猪骨骼肌卫星细胞的体外分离培养技术也迅速发展起来。背最长肌、后腿肌和半腱肌常用于分离骨骼肌卫星细胞,1日龄猪背最长肌的分离效果最好。常用于分离骨骼肌卫星细胞的酶包括链酶蛋白酶、胶原酶、胰蛋白酶、胶原蛋白酶等,各酶及酶联合消化的时间不同,最优的过滤方式是200目+400目联合过滤,3次离心法可获得纯度较高的细胞。常使用的培养基为DMEM/F12+10%胎牛血清(FBS)+1%青-链霉素(P/S)。骨骼肌肌卫星细胞常见标记物有配对盒基因3(PAX3)、PAX7、生肌决定因子5(Myf5)、Myf4、肌分化因子(MyoD)、肌细胞生成素(MyoG)等。作者通过对猪骨骼肌肌卫星细胞的分离、培养及鉴定等方面进行综述,梳理出各步骤中最佳参数,为建立规范猪骨骼肌卫星细胞分离程序提供参考,以期为肌肉发育和疾病研究提供理论及技术支持。     

胎牛血清在猪孤雌囊胚玻璃化冷冻后恢复培养中的作用研究

【目的】研究胎牛血清(fetal bovine serum, FBS)在猪孤雌囊胚玻璃化冷冻后恢复培养中的作用。【方法】本试验以体外培养第5天的猪孤雌激活囊胚为材料,将新鲜和冷冻囊胚分别在含10%FBS(V/V)的胚胎培养液中继续培养48 h,即分为新鲜组(Fresh)、新鲜+FBS组(Fresh+FBS)、冷冻组(Vitrified)、冷冻+FBS组(Vitrified+FBS)。观察各组囊胚的扩张和孵化能力,检测胚胎的细胞膜损伤、凋亡细胞数目、总细胞数目、胞内活性氧(ROS)水平、线粒体活性以及发育相关基因的表达水平。【结果】与Fresh和Vitrified组相比,Fresh+FBS和Vitrified+FBS组的完全扩张率、孵化率和囊胚细胞总数均显著提高(P<0.05),细胞膜损伤率和细胞凋亡率均显著降低(P<0.05)。与Fresh组相比,Vitrified组ROS水平显著升高(P<0.05),Fresh+FBS和Vitrified+FBS组ROS水平均显著降低(P<0.05)。Vitrified+FBS组的线粒体活性显著高于Vitrified组(P&l...     

不同冻存液对奶牛乳腺上皮细胞冻存质量的影响

试验旨在探究奶牛乳腺上皮细胞（bovine mammary epithelial cells,BMECs）最佳的冻存液以改善乳腺上皮细胞的冻存质量。BMECs传至第5代后分别加入以下10种不同配方的冻存液。A组：85%DMEM＋10%胎牛血清＋5%DMSO;B组：80%DMEM＋10%胎牛血清＋10%DMSO;C组：75%DMEM＋10%胎牛血清＋15%DMSO;D组：70%DMEM＋10%胎牛血清＋20%DMSO;E组：85%DMEM＋5%胎牛血清＋10%DMSO;F组：75%DMEM＋15%胎牛血清＋10%DMSO;G组：70%DMEM＋20%胎牛血清＋10%DMSO;H组：80%DMEM＋10%胎牛血清＋10%甘油;I组：70%DMEM＋10%胎牛血清＋20%甘油;J组：60%DMEM＋10%胎牛血清＋30%甘油,冻存前统一调整细胞密度到1×106个/mL冻存。分别对复苏后的细胞进行台盼蓝染色计算存活率和PI/Hoechst33258双染计算凋亡率。结果表明,BMECs经不同冻存剂冻存复苏后,细胞活力、形态学及凋亡率表现有所不同,其中B组和G组的活力和24h贴壁率较其他组高,二者的凋亡率较低,二者之间差异无显著性（P〉0.05）;传代后B组细胞的生长状况最好。     

Effects of Confluent, Roscovitine Treatment and Serum Starvation on the Cell-cycle Synchronization of Bovine Foetal Fibroblasts

The present study was designed to examine the effects of cell-cycle synchronization protocols, such as confluent, roscovitine treatment and serum starvation, in bovine foetal fibroblasts on synchronization accuracy at G0/G1, viability, apoptosis, necrosis and ploidy for use as a nuclei donor. The cells in 5-10 passages were randomly allocated into three treated groups. Cells were cultured either in Dulbecco's modified Eagle's medium (DMEM) + 10% foetal bovine serum (FBS) until 90% confluent (group 1, confluent), in DMEM + 10% FBS + 30 microM roscovitine for 12 h (group 2, roscovitine), or in DMEM + 0.5% FBS for 5 days (group 3, serum starvation). Most of the cells (>80%) in all groups were arrested at the G0/G1 stage. Although the rates did not differ, cells in group 1 showed an increased cell population arrested at the G0/G1 phase. Significantly (p < 0.05) higher rates of apoptosis occurred in group 3 than in group 1 and 2 (10% vs 6% and 6%, respectively). No differences in chromosomal abnormality were observed among groups. However, by increasing the number of cell culture passages up to 15, significantly (p < 0.05) higher chromosomal abnormality was observed than in 5 and 10 passages (39% vs 28% and 23%, respectively) in group 1. The results clearly indicated that bovine foetal fibroblasts could be effectively synchronized at G0/G1 stages by all the three different treatments, confluent, roscovitine and serum starvation. However, cells in confluent showed reduced apoptosis and necrosis when they underwent 5-10 passages, exhibiting increased percentage of cells with stable chromosome diversity. Hence, cells in confluent merit further studies before they could be used as nuclear donors.     

The Establishment and Application of Metabolic Model of Blood Cells in Chicken

The experiment was aimed to establish a drug metabolic model of the blood cells in chicken. The effects of three kinds of culture medium (L-15,M199 and RPMI1640) and different concentrations of fetal bovine serum (FBS) were compared to optimize the culture condition of blood cells,and the proper time of medication was determined after the cell vitality was measured by MTT assay. The content of ribavirin and its metabolites (TCONH₂ and RTCOOH) were detected after the ribavirin was dosed. The results showed that the cell viability was highest when the blood cells cultured in L-15 medium,the state of blood cells was better when 10% FBS was added to the medium. The best time for medication was when blood cells were cultured for 3 h. The content of ribavirin was decreased with the time of administration,the metabolites of ribavirin were increased quickly after half an hour, it changed slowly after 3 h. In conclusion,the metabolic model of blood cells in chicken was successfully established,and the blood cells cultured in vitro were better using L-15 medium supplemented with 10% FBS. The metabolic transformation function of blood cells in chicken was indicated by the medication test of ribavirin and it could be used to study the drug metabolism in vitro.     

鸡血细胞药物代谢模型的建立与应用

试验旨在建立鸡血细胞药物代谢模型,并用利巴韦林进行验证。本试验比较了3种不同培养基（L-15、M199和RPMI1640培养基）及添加不同浓度胎牛血清的细胞培养效果,采用MTT法测细胞活力,确定最佳给药时间,之后用利巴韦林进行给药,检测培养液中利巴韦林及其代谢物（TCONH₂和RTCOOH）含量。结果发现,3种培养基中用L-15培养基培养时细胞存活率最高,胎牛血清添加浓度为10%时血细胞状态较好;血细胞活力检测表明其最佳给药时间为培养3 h;利巴韦林给药后,其含量随着时间的延长而降低,TCONH₂和RTCOOH在给药0.5 h时迅速产生,给药3 h后其浓度变化趋于平缓。综上所述,本试验建立的鸡血细胞代谢模型操作简便,用添加10%胎牛血清的L-15培养基培养效果较好,利巴韦林给药试验表明,鸡血细胞存在一定的代谢转化功能,该鸡血细胞代谢模型可用于某些药物的体外代谢研究。     

Effect of Basic Fibroblast Growth Factor on the Proliferation of Bovine Skeletal Muscle Satellite Cells

To investigate the effect of basic fibroblast growth factor (bFGF) on the proliferation of bovine skeletal muscle satellite cells,bovine skeletal muscle satellite cells were isolated and cultured in the medium with bFGF,the growth and differentiation state of muscle satellite cells were observed,and the growth curve and EDU cell proliferation assay were conducted.The results showed that cell morphology of bovine skeletal muscle satellite cells cultured in medium containing bFGF was better and proliferation rate was significantly higher than that in control group (P<0.05).The results indicated that bFGF could promote proliferation of bovine skeletal muscle satellite cells efficiently in growth medium and differential medium.Our study established an efficient method to culture bovine skeletal muscle satellite cells,which could provide reference for studying and using of skeletal muscle satellite cells.     

碱性成纤维细胞生长因子对牛骨骼肌卫星细胞增殖的影响

为研究碱性成纤维细胞生长因子(basic fibroblast growth factor,bFGF)对牛骨骼肌卫星细胞增殖的影响,试验对牛骨骼肌卫星细胞进行体外分离培养,在生长培养基和分化培养基中分别添加bFGF,观察细胞生长及分化情况,绘制细胞生长曲线,并进行EDU细胞增殖检测试验。结果显示,添加了bFGF培养基的细胞生长状态较对照组良好,细胞增殖速度快,细胞增殖率显著高于对照组(P<0.05),说明bFGF对牛骨骼肌卫星细胞在生长培养基和分化培养基中增殖都具有良好的促进作用。本研究建立了一种高效的牛骨骼肌卫星细胞培养方案,为骨骼肌卫星细胞的研究利用提供参考。     

不同冷冻液对鸡精原干细胞冷冻-解冻后存活力的影响

采用两步酶解和差异贴壁法分离、纯化鸡精原干细胞(SSCs),比较了6种冷冻保护液对其冷冻保存效果,结果表明:FBS浓度为10%时,10%DMSO与10%甘油解冻后细胞存活率分别为54.05%和37.49%,差异显著(P<0.05);以10%DMSO为冷冻保护剂时,FBS浓度从10%增加到20%,解冻后细胞存活率分别为54.05%和69.06%,差异显著(P<0.05);在冷冻液Ⅰ基础上,添加3种不同浓度的蔗糖溶液,解冻后细胞存活率分别为52.49%、47.65%和51.94%,三者之间差异不显著(P>0.05),且与冷冻液Ⅰ组差异也不显著(P>0.05);将解冻后细胞接种饲养层上培养,除甘油组外,SSCs均能增殖并形成AKP阳性集落,但10%DMSO加上20%FBS组细胞增殖速度和集落数优于其他组合,表明10%DMSO加上20%FBS为鸡SSCs最佳冷冻保护剂。