青稞CHI基因的克隆及原核表达分析

为了进一步了解CHI基因在青稞黄酮合成中所起的作用,以青稞品系94-19-1为材料,通过同源克隆技术分离CHI基因,并对分离得到的CHI基因进行生物信息学分析及原核表达。结果表明,从青稞94-19-1中克隆得到的CHI基因编码区长为696bp,编码231个氨基酸。序列分析表明,青稞CHI基因有4个碱基和大麦不同,导致1个氨基酸发生改变。SDS-PAGE检测结果表明,将该基因克隆到表达载体pET-32a上,并转化大肠杆菌BL21后,经诱导可成功表达出融合蛋白。     

青稞Hva1基因的表达模式及表达载体的构建

为了解青稞种子胚胎成熟晚期丰富蛋白(LEA)基因Hva1与青稞抗旱性的关系,以抗旱性强的旱地紫青稞和抗旱性弱的大麻青稞为材料,研究了不同浓度PEG胁迫下Hva1基因在两个青稞品种中的表达模式。结果表明,Hva1基因在抗旱性不同的两个青稞品种中的表达均呈单峰模式,且抗旱性强的旱地紫青稞表达峰值和对应的PEG胁迫浓度均高于抗旱性弱的大麻青稞;PEG胁迫浓度大于13.18%时,旱地紫青稞的Hva1基因表达量高于大麻青稞。可见,Hva1基因的表达在青稞的抗旱中起到重要的作用,为此我们成功构建了青稞Hva1基因的过量表达载体,期望为抗逆性基因在青稞中的应用和抗旱新品种的选育奠定基础。     

小麦AQPs蛋白TaPIP1基因cDNA克隆及其表达分析

为探索小麦水通道蛋白在氮素处理过程中的生物学功能,以0.1%尿素处理6.0 h的周麦19幼根为材料,利用RTPCR方法克隆了小麦PIPs类型的水通道蛋白基因TaPIP1,并分析了该基因的组织表达特性及其在尿素处理过程中的表达特征。TaPIP1全长1 062 bp,包括61 bp的5′非翻译区,128 bp的 3′非翻译区和一个长度为873 bp、编码290个氨基酸的开放阅读框。序列分析表明,TaPIP1基因与已知小麦（GQ452384和AAM00368）、大麦（BAA23746,CAA54233和BAA23745）、水稻（BAA24016）和玉米（AAK26754 ,ACG39699,ACG37183,CAA57955和AAK26756）等单子叶植物来源的同类基因同源性较高,相似性为85.9%～99.3%。半定量RTPCR表达谱分析显示,TaPIP1在抽穗期小麦的根、茎和旗叶中均能表达。氮素处理下该基因表达分析结果显示,TaPIP1在萌发期小麦根系中的表达受尿素的诱导。     

香蕉NPR1E基因的克隆及表达分析

NPR1基因可参与调节植物对病原菌的广谱抗性,在植物系统抗性中起着关键的调控作用。通过RACE(rapid-amplification of cDNA ends)方法从香蕉根系中获得NPR1E基因,命名为MaNPR1E(GenBank登录号分别为：KF582550)。MaNPR1E是香蕉NPR1基因编码框全长cDNA,包含一个1 755 bp的最大开放阅读框,编码一个含584个氨基酸的蛋白质。经蛋白质序列同源比对发现,其含有完整的BTB/POZ结构域、锚蛋白重复ANK序列和NPR1-like-C结构域,属于典型的NPR1蛋白。系统进化树比对分析表明,MaNPR1E与海枣PdNPR3(XP_008808341.1)和油棕EgNPR3(XP_010914123.1)的亲缘关系较近。组织特异性研究表明,该基因组成型表达于香蕉各组织。实时荧光定量PCR分析表明,接种枯萎病菌后MaNPR1E的表达在感病品种中被抑制,而在抗病品种中被激活;MaNPR1E的表达受乙烯利和水杨酸的诱导。上述结果表明,MaNPR1E可能在香蕉抗枯萎病过程中扮演重要的调控角色。     

西藏青稞品种喜玛拉雅10号干旱胁迫的SSH文库构建及干旱诱导表达基因分析

为了研究西藏青稞抗旱的分子机制,以西藏耐旱青稞(Hordeum vulgare L.var.nudum HK.f.)品种喜玛拉雅10号为材料,利用抑制性差减杂交技术(SSH)构建青稞苗期叶片干旱胁迫诱导基因表达的正向差减文库。挑取600个阳性克隆进行PCR验证,并对验证后的单克隆进行测序分析,共获得420个有效序列。去除冗余序列和嵌合序列后,获得220条高质量EST序列,其中183条singlets,37条contigs。BlastN分析表明,其中189个EST序列可以在GenBank的unigene中找到同源序列,31个未能找到unigene同源序列;BlastX分析表明,62个EST序列unigene与未知功能蛋白或假定蛋白有较高的相似性;158条EST序列与已知功能蛋白有较高的同源性。获得的EST序列多数不仅与植物的非生物胁迫相关,也与植物的生物胁迫反应相关,说明植物在胁迫反应中有明显的共同机制。其中与大麦表达序列高度同源的EST占58%;这些基因涉及参与信号转导和转录调节的基因(11.96%),编码保护、防御和胁迫耐受蛋白的基因(9.78%),跨膜转运相关基因(5.43%),光合作用基因(6.52%),参与结构和功能代谢合成途径中的一些酶(30.43%)等代谢过程。实验结果表明,青稞在干旱复水条件下可诱导一系列特异基因的表达,如参与抗旱反应相关酶和蛋白基因锌指蛋白、衰老相关蛋白、CAS、细胞色素P450、热激蛋白、胁迫诱导蛋白,以及LEA蛋白、脱水蛋白、P5CS等保护蛋白基因。用KOBAS系统将56个EST定位到32个Pathways中,初步分析发现,谷氨酸盐代谢途径(Glutamate metabolism)、精氨酸和脯氨酸代谢途径(Arginine and proline metabolism)、泛素蛋白介导的蛋白质水解代谢(Ubiquitin mediated proteolysis)途径可能与青稞抗旱相关性较大。     

青稞CHS基因的克隆及原核表达分析

为进一步研究查尔酮合酶（Chalcone synthase,CHS）在黄酮化合物代谢过程中的作用,以青稞94-19-1为材料,通过同源克隆技术分离CHS基因,并对分离得到的CHS基因进行生物信息学分析及原核表达。结果表明,从青稞94-19-1中克隆得到的CHS基因编码区长为1 197 bp,编码398个氨基酸。生物信息学分析表明,该基因编码的蛋白质分子量为43.479 kDa,预测等电点(pI)为5.92,是酸性蛋白;该酶蛋白体外红细胞中的半衰期为30 h,不稳定系数(II)大于40,属于不稳定蛋白;平均亲水指数为-0.090,是亲水性的蛋白。SDS-PAGE检测结果表明,将该基因克隆到表达载体pET-32a上,并在大肠杆菌BL21中表达,可得到64 kDa左右的融合蛋白,在IPTG诱导浓度为1.0 mmol·L^-1时,最佳诱导时间为3 h。     

小麦多蛋白桥梁因子基因 TaMBF1c的克隆与表达分析

多蛋白桥梁因子(multiprotein bridging factor 1,MBF1)是一类广泛存在于植物中的转录共激活因子,在植物生长发育和逆境响应过程中发挥重要作用。为进一步了解该蛋白的功能,利用同源克隆法从小麦中获得 MBF1基因,根据其染色体位置分别命名为 TaMBF1c-A、 TaMBF1c-B和 TaMBF1c-D,通过生物信息学方法分析其蛋白序列特征、蛋白三级结构及顺式作用元件,并利用RT-qPCR技术分析其组织表达特异性以及干旱、热胁迫响应模式。序列分析表明,TaMBF1c-A、TaMBF1c-B和TaMBF1c-D分别含有456、471和465 bp的开放阅读框;三维结构预测发现,TaMBF1c-A、TaMBF1c-B和TaMBF1c-D在N端和C端分别含有MBF1结构域和4个α螺旋组成的helix-turn-helix结构域;系统进化分析结果表明, TaMBF1c基因与二粒小麦(Triticum dicoccum)的亲缘关系最近。顺式作用元件分析发现, TaMBF1c-A、 TaMBF1c-B和 TaMBF1c-D启动子区都含有干旱响应元件(MBS element/MYB element)和热响应元件(HSE element)。RT-qPCR分析显示, TaMBF1c-A和 TaMBF1c-B基因在叶片中特异性表达, TaMBF1c-D只在根部特异性表达;在干旱胁迫条件下, TaMBF1c在干旱敏感小麦品种中表达量较高,其表达量是 TaMBF1c在耐旱小麦品种中表达量的280倍, TaMBF1c在干旱信号途径中起负调控作用。在热胁迫条件下, TaMBF1c-A和 TaMBF1c-B在热敏感与耐热小麦品种中上调表达,而 TaMBF1c-D仅在热敏感小麦品种中上调表达,明显高于耐热小麦品种。     

青稞F7-OMT基因的克隆及原核表达分析

类黄酮7-O-甲基转移酶(F7-OMT)具有甲基转移酶功能,能催化底物类黄酮甲基化产生植物抗毒素,提高植物的抗菌性。为了给进一步研究该酶蛋白的功能奠定基础,以青稞"94-19-1"为材料,采用同源克隆方法得到青稞F7-OMT基因编码片段。生物信息学分析表明,青稞F7-OMT开放阅读框(ORF)全长为1173bp,编码390个氨基酸,蛋白分子质量为42 207.8Da,等电点pI为5.36,无信号肽序列,具有甲基转移酶2(Methyltransf_2,pfam00891)和二聚化(Dimerization,pfam08100)保守域。通过亚克隆将F7-OMT连接到表达载体pET-32a上,构建pET-32a-F7-OMT融合表达载体,在E.coli BL21(DE3)pLysS中诱导表达,并采用亲和层析纯化法得到纯化蛋白。     

青稞HvnWRKY26基因的克隆及表达分析

WRKY家族转录因子广泛参与植物的生物和非生物胁迫过程。为探索WRKY家族转录因子在青稞抗条纹病过程中的作用,本课题组前期利用条纹病菌分别侵染抗病青稞品种昆仑14号和感病品种Z1141,并进行转录组测序,发现一个在侵染时期差异表达的WRKY基因家族成员。序列分析发现,该基因的开放阅读框为765 bp,可编码255个氨基酸,具有典型的WRKY结构域,属于WRKY基因家族。Uniprot注释结果表明,该蛋白为HvnWRKY26。启动子区域预测表明,该区域含有脱落酸和茉莉酸响应元件以及与干旱、低温、盐胁迫和防御应激等逆境胁迫相关的顺式作用元件。序列比对分析显示,HvnWRKY26蛋白与其他物种中同源蛋白的氨基酸序列一致性均不高,但该蛋白与大麦HvWRKY26蛋白的WRKY结构域序列完全相同。系统进化分析表明,青稞HvnWRKY26与大麦WRKY26的亲缘关系最近;进一步对HvnWRKY26及与其亲缘关系较近的大麦、玉米、水稻WRKY蛋白进行进化分析,发现这些WRKY蛋白被分为A、B和C三大类,其中HvnWRKY26蛋白属于A类。RNA-seq和qRT-PCR分析结果表明,青稞在遭受条纹病菌侵染时,HvnWRKY26基因的相对表达量在抗病品种昆仑14号和感病品种Z1141中均显著上调表达,且抗病品种的表达量显著高于感病品种,推测HvnWRKY26基因在青稞抗条纹病过程中发挥重要作用。     

文心兰ACC氧化酶基因OnACO1克隆与表达分析

以文心兰切花品种黄金2号(Oncidium Gower Ramsey‘Gold2’)为材料,通过RT-PCR和RACE技术,从文心兰的花中分离得到了1个ACO基因成员的cDNA,命名为OnACO1(GeneBank登录号为JQ822088)。该基因全长为1 424 bp,包括972 bp的ORF,172 bp的5′-UTR和280 bp的3′-UTR,编码324个氨基酸,其氨基酸序列与石斛兰等兰科植物的ACO氨基酸序列有较高的同源性。构建原核表达载体pGEX-OnACO1,转化大肠杆菌BL21进行诱导表达,在SDS-PAGE中显示出了特异性表达条带,与预测的蛋白大小一致。荧光定量PCR分析表明OnACO1基因的表达具有组织特异性,主要在蕊柱中表达,并且乙烯对该基因的表达有上调作用。     

小麦抗逆相关基因 TaGB1的克隆及其表达特性分析

为了解小麦的 TaGB1基因特性、表达情况及其与双子叶植物同源基因的进化关系,以小麦品种济麦22为研究对象,采用同源克隆的方法获得小麦G蛋白β亚基编码区序列, TaGB1编码区全长1 143 bp,编码380个氨基酸,预测分子量为41 kD,基因组序列中包含6个外显子和5个内含子,分别位于小麦基因组的4A、4B、4D染色体上,不同拷贝的氨基酸同源性高达99.91%。 TaGB1基因结构中包含7个WD40保守域,表达产物位于胞质和质膜上。经系统发育进化关系分析,单子叶植物与双子叶植物的G蛋白β亚基分化形成两大分支; TaGB1在进化关系上与单子叶植物较近,而与拟南芥等双子叶植物较远。 TaGB1在ABA、盐、热和干旱胁迫条件下上调表达,植物的根、茎、叶等部位均有表达,叶片中表达量较高,说明该基因可能参与调控植物的抗逆反应。     

大麦气孔发育相关基因HvSPCH的克隆及初步功能分析

气孔是植物与外界进行气体交换的通道,对植物的生长发育至关重要。SPCH转录因子与气孔的发育关系密切,为揭示其在大麦中的功能,以大麦G1614为材料,利用PCR方法克隆大麦SPCH（HvSPCH）基因后,进行生物信息学分析,并对该基因在干旱胁迫条件下的表达模式进行分析。结果表明,HvSPCH基因编码区长为1 098 bp,可编码365个氨基酸,相对分子量为90 504.73 Da,理论等电点为4.96,为疏水的、不稳定的碱性蛋白质。氨基酸序列分析表明,HvSPCH蛋白的氨基酸序列不含有跨膜结构域和信号肽,含有40个磷酸化位点和27个糖基化位点。二级结构分析表明,HvSPCH蛋白包含35.62%的α-螺旋、8.77%的延长链、2.47%的β-转角和53.13%的无规则卷曲。系统进化分析表明,大麦HvSPCH蛋白与水稻、野生二粒小麦、二穗短柄草的SPCH蛋白亲缘关系较近。qRT-PCR分析结果表明,干旱处理4 h和12 h时,HvSPCH基因的相对表达量显著升高,说明其有可能参与大麦的干旱逆境响应过程。     

大麦单株产量性状的杂种优势及其稳定性分析

为研究不同环境下大麦单株产量性状的杂种优势及其稳定性,以113个(Nasonijo×泰兴9425)DH系配制226个杂交种构建的永久F_2群体及亲本为材料,分别调查参试材料在4个环境下的单株穗数、主穗粒数、千粒重、单株产量和单株生物量,利用方差分析、聚类分析及稳定性分析对大麦单株产量性状的杂种优势及其稳定性进行了分析。结果表明,大麦杂种F_1各被测性状大多表现中亲优势,超亲优势组合出现率相对较低。各被测性状的杂种优势不仅受自身遗传因素影响,而且受试点生态条件及年度气候条件的影响。杂种优势的稳定性因性状不同而异,千粒重和主穗粒数杂种优势的稳定性较好,单株生物量和单株产量杂种优势的稳定性较差,仅有2个组合在多环境下表现出稳定的强杂种优势。     

小麦 TaSABP2基因的克隆及表达分析

为挖掘小麦抗逆基因,进一步解析小麦抗逆机制,采用电子克隆结合RT-PCR的方法,从小麦叶片中分离出 TaSABP2基因;利用生物信息学手段分析其序列特征;运用实时荧光定量反转录PCR(qRT-PCR)技术检测其在不同条件下的表达情况。结果表明,小麦 TaSABP2基因的cDNA全长为878 bp,包含一个长度为807 bp的开放阅读框,编码268个氨基酸。 TaSABP2基因的编码蛋白包含Abhydrolase及PLN02211两个结构域及一个酶活性中心(VVLVGHSLGG),属于Abhydrolase超家族的成员。其蛋白二级结构由四种形式构成,包括40.3%的α-螺旋、16.42%的延伸链、4.48%的β转角、38.81%的无规则卷曲。通过与其他植物的氨基酸序列进行多重序列比对,发现功能区域的氨基酸序列较为保守。qRT-PCR结果表明, TaSABP2基因的表达具有较强的组织特异性,植物激素ABA和BR处理及干旱和盐胁迫处理,均能诱导该基因的表达量迅速增加。以上结果表明, TaSABP2基因在小麦抵抗逆境胁迫过程中起到一定作用。     

燕麦AsRBP1基因克隆及表达特性分析

为了给AsRBP1基因在小麦抗逆转基因分子育种中的应用奠定理论基础,采用同源克隆方法从燕麦中克隆、获得AsRBP1基因,其cDNA序列全长447 bp,编码148个氨基酸.AsRBP1在氨基端具有典型的RNA识别基序(RNA-Recognition Motif,RRM),在羧基端富含甘氨酸,其含量达35.8％.系统进化树分析表明,AsRBP1与拟南芥AtGR-RBP7亲缘关系很近.实时荧光定量聚合酶链式反应(Real-time PolymeraseChain Reaction,RT-PCR)分析该基因的表达特性表明,AsRBP1明显受到外源脱落酸(Abscisic acid,ABA)与低温的诱导,同时对干旱和高盐胁迫也做出响应.由此,推测该基因属于GR-RBPs基因家族成员,可能参与逆境胁迫应答,在增强植物的抗逆性中发挥着重要的作用,可以为小麦抗逆分子育种提供优良候选抗逆基因资源.     

小麦BES1转录因子基因 TaBEH3的克隆及表达分析

BES1(油菜素内酯不敏感1-甲磺酸乙酯-抑制剂1)是一类植物特有的转录因子家族, TaBEH3基因是小麦 BES1基因家族成员之一,为进一步了解该基因的功能,以中国春为材料,克隆了 TaBEH3基因,将其3个同源基因分别命名为 TaBEH3-A、 TaBEH3-B和 TaBEH3-D。序列分析显示,3个同源基因均包含2个外显子,分别编码356、354和358个氨基酸,启动子区含有大量与植物生长发育、激素响应相关的顺式作用元件,其中,分生组织表达元件（CAT-box）和脱落酸响应元件（ABRE）在3个基因中普遍存在。系统进化树分析显示, TaBEH3基因在麦类作物中具有更近的亲缘关系。基于qRT-PCR进行的时空表达分析显示, TaBEH3基因在不同组织和不同器官间均有组成性表达,表明 TaBEH3基因在植物生长发育（特别是花器官的发育和形成）过程中具有重要的作用。 TaBEH3-A、 TaBEH3-B和 TaBEH3-D基因响应ABA激素胁迫处理,且3个基因的表达量变化趋势一致。     

大麦基因组中Helitron转座元件的计算预测

Helitron是一类新发现的DNA转座元件,具有捕获宿主基因片段的能力,因而对植物基因及基因组的进化具有重要意义。为了研究麦类作物中这类元件对基因组的进化所起的作用,本研究采用一种改进的局部组合变量(LCV)方法对大麦基因组中的Helitron转座元件进行了预测,共鉴定了16 560个潜在的Helitron元件,去除假阳性后这些元件约占基因组的2.2%。基于序列分歧的计算发现,绝大多数Helitron形成于最近的900万年内,并且在大约250和550万年前各经历了一次剧烈扩张。在大麦基因组中发现了3个自主型Helitron元件,它们包含Rep和Helicase结构域的编码区。基因片段捕获分析发现,66.5%的元件平均捕获了1.9个基因片段,除了反转座和转座相关的基因外,参与发育调控的NAM家族转录因子和参与水分运输和环境胁迫响应的软木脂素合成酶基因也被高频捕获,表明Helitron转座元件不仅影响大麦基因组的结构,同时可以驱动特定功能基因的扩增。     

小麦 TaWIN1基因的克隆和表达分析

14-3-3蛋白家族在植物生长发育和逆境胁迫响应中发挥着重要作用。 TaWIN1基因是小麦14-3-3基因家族成员之一,为了进一步了解该基因的功能,本研究以普通小麦中国春为材料克隆了 TaWIN1基因并进行了生物信息学分析和表达分析。结果表明, TaWIN1基因含有801 bp的开放阅读框,编码266个氨基酸,含有完整的14-3-3蛋白家族结构域;该基因的编码蛋白为酸性蛋白,不具有跨膜区,可能定位于细胞质;进化分析显示,小麦TaWIN1蛋白与大麦14-3-3E、二穗短柄草GF14-D的亲缘关系最近; TaWIN1基因在小麦不同发育时期和不同组织中均有表达,但在10 mm幼穗中的相对表达量最高,其次为苗期叶片和旗叶,在根中表达量最低;根中 TaWIN1基因在干旱、高温、低温和盐胁迫下均显著上调表达;叶片中 TaWIN1基因在干旱、低温和盐胁迫下均显著上调表达,而在高温下则显著下调表达。