家蚕单粒卵DNA的快速制备方法研究

研究了含量甚微的家蚕单粒卵DNA的抽提方法。将蚕卵催青至转青,以增加蚕卵的DNA含量。在Eppendorf管内用牙签刺破 蚕卵,再用酚、氯仿速提法抽提,能够在1h左右制备出符合RAPD需要的DNA模板,每粒卵能够提取到100ng左右的DNA,制备量接近常规方 法。     

适于滞育期蚕卵的基因组DNA提取方法

家蚕以卵滞育,蚕卵保存时间长,取样方便,但是DNA含量较低,抽提较为困难,利用不多。从处于滞育期(丙2胚子前)的蚕卵中快速高效地获取基因组DNA,对于提高家蚕研究效率具有实用价值。本试验对两种SDS法和一种CTAB法的抽提效果进行比较,结果表明SDS-II提取效果较好,单粒蚕卵提取基因组DNA即可用作PCR模板,5粒蚕卵获得DNA可以基本满足分子生物学研究需要。     

家蚕微孢子虫原位杂交诊断技术研究

根据家蚕微孢子虫rRNA基因高度保守的特点,设计合成了1对PCR引物,从家蚕微孢子虫基因组DNA上扩增出1个12kb片段,用同位素标记后作为检测家蚕微孢子虫的特异性探针。采用原位杂交的方法,对家蚕卵及感染家蚕微孢子虫4、6、10d的幼虫进行原位杂交检测。实验结果表明,该方法可以从家蚕单粒卵内检测到296粒孢子,对感染家蚕微孢子虫4、6、10d的幼虫均有阳性杂交信号出现。     

多引物PCR检测家蚕卵微粒子病的新方法

利用几种PCR引物的混合物，评估多引物PCR是否可以实际应用于同时感染几种能导致家蚕微孢子病的微孢子虫的早期检测。从感染了家蚕微粒子病原虫（BmNb）的蚕卵中抽提的基因组DNA，并以此作为DNA模板，用多引物PCR扩增这种特异的DNA序列。此外，从感染了BmNb的家蚕中获得的基因组DNA作为DNA模板，也获得了相同的结果。这些发现表明用本研究设计的多引物PCR对蚕卵微孢子病的检查具有实用价值。     

一种家蚕微孢子虫感染成品卵检测方法的研究

感染家蚕微孢子虫的成品卵检测是业内关注的技术问题之一。用磨碎管分装1 000粒蚕卵并加海绵塞，进行一段式催青的实验室二日孵化率达98.25%或以上，对生产用不同蚕品种、越年或冷藏浸酸蚕种及不同单位生产蚕种的二日孵化率最低为94.40%。用含0.01%十二烷基磺酸钠和2.00%氢氧化钠的溶液浸泡和磨碎蚕卵样本(约1 000粒),固形物去除率为83.38%。5龄起蚕添食感染5×10⁵颗/mL家蚕微孢子虫孢子悬浮液后获取的混合蚕卵，在催青孵化后第7天检出率明显上升。1 000粒蚕卵混入3 000颗家蚕微孢子虫孢子的检出率为100%。蚕卵磨碎液用PBS缓冲液(pH=7.2～7.6)稀释40倍或以上时，qPCR法检测可稳定检出家蚕微孢子虫，检测灵敏度为4×10⁶颗/mL,低于光学显微镜法的1.5×10³颗/mL。105个一代杂交蚕种母蛾检疫批(166 623张毛种)母蛾检测和蚕卵集团检测的检出情况类似。不论是母蛾检测还是成品卵检测都涉及家蚕微孢子虫的胚传率和流行病学风险管控的阈值确定，上述研究提供了一种成品卵集团检测的方法，但实际...     

多重引物PCR特异性扩增微孢子虫DNA片段

利用几种引物的混合物,检验多重引物PCR早期检测不同种类家蚕传染性微孢子虫的适用性。结果是:当用目的微孢子虫的基因组DNA作为DNA模板时,用本研究设计的多重引物进行PCR可以扩增出特异性DNA片段。而当采用家蚕或其他微生物的基因组DNA作为DNA模板时,没有获得PCR产物。另外,只有当家蚕被各种微孢子虫感染时,多重引物PCR才能扩增出特异性ONA片段。当从受到家蚕微孢子虫感染的蚕卵中抽提基因组DNA作为DNA模板时,采用多重引物PCR也可以扩增出特异性DNA片段。从受家蚕微孢子虫感染的家蚕中抽提基因组DNA作为DNA模板时,也可以得到类似的结果。这些发现说明本研究设计的多重引物PCR适合用于蚕种微粒子孢子感染性检验。     

模拟感染家蚕微粒子病的蚕卵、蚕蛾PCR检测的初步研究

在比较研究不同浓度家蚕微孢子虫 (Nosemabombycis,N .b)孢子与模拟染毒N .b孢子蚕卵、蚕蛾的模板DNA制备方法的基础上 ,选用MP1/MP2和V1F/ 5 30R两对引物进行PCR扩增检测。结果为 :碱性条件预处理N .b孢子后再抽提的DNA ,其得率略高于常规方法抽提的DNA ,但两者的模板质量相同 ;MP1/MP2和V1F/ 5 30R两对引物均可有效地检出N .b孢子DNA ,前者的检测灵敏度为 1μL 3× 10 6mL-1以上浓度的N .b孢子DNA ,后者为 1μL 3× 10 5mL-1以上浓度 ;对不同浓度N .b孢子DNA与蚕蛾DNA混合后进行PCR检测 ,V1F/ 5 30R引物的检测灵敏度为1μL 3× 10 6mL-1N .b孢子DNA。     

家蚕胚胎期单卵基因组DNA的快速抽提

本文对用磁珠法抽提家蚕单粒蚕卯基因组DNA进行了探讨。结果表明从催青24h后到收蚁前一天的单卵中所提取的DNA断裂少、纯度高，能够满足特异性引物或随机引物进行PCR扩增的需要。每粒卯可获得100ng以上的DNA，能够进行多次重复检测，完全能够满足蚕种鉴定及纯度检测的需要。     

基于ImageJ图像处理技术检测家蚕一代杂交种的良卵数和良卵率

家蚕一代杂交种的良卵数、良卵率是蚕种品质检验的2项重要指标。为了提高检验效率,利用ImageJ图像处理软件建立检测家蚕一代杂交种良卵数、良卵率的新方法。分别利用这种图像处理方法和人工计数方法检测12个家蚕品种的蚕卵样本每克蚕卵的良卵数、总卵数,采用新方法检测获得的结果数据的相对误差均<1%。对2种方法获取的每克蚕卵良卵数、总卵数数据进行t测验,其t值均小于t0.05(22)=2.074,说明2种检测方法获取的检测结果差异不显著。相关性分析表明,利用2种检测方法对每克蚕卵良卵数、总卵数的检测结果的相关系数分别为0.9979、0.9982,2种检测方法获得的结果数据间呈极显著的线性相关。与人工计数检测方法相比,采用ImageJ图像处理技术的检测方法具有方便快捷的特点,可用于生产上家蚕一代杂交种的良卵数、良卵率检测。     

实时荧光定量PCR检测高温即时浸酸对蚕卵中家蚕微孢子虫的灭活效果

家蚕微孢子虫(Nosema bombycis,Nb)引起的家蚕微粒子病是对蚕种生产危害最为严重的家蚕病害,蚕种浸酸处理是蚕业生产中常用的一种防病处理手段。为探明浸酸处理对家蚕微粒子病的防治效果,将家蚕二化性四元杂交组合两广二号的带毒蚕卵分别进行常规即时浸酸处理和高温即时浸酸处理,采用实时荧光定量PCR对卵龄24~240 h蚕卵中的家蚕微孢子虫进行定量检测。结果发现,常规和高温浸酸处理后每日取样蚕卵中家蚕微孢子虫的检测值较阳性对照组均显著降低,高温浸酸组又明显低于常规浸酸组,表明2种浸酸处理对蚕卵中的家蚕微孢子虫均有灭活作用,且高温处理的灭活效果更为显著。对蚕卵孵化后饲养至3龄眠和5龄起的幼虫逐条进行显微镜镜检,结果显示高温即时浸酸处理对家蚕微粒子病的相对防治效果分别为92.30%±2.95%和81.80%±0.06%。综上表明,高温即时浸酸处理带毒蚕卵对家蚕微粒子病有显著的防治作用。     

家蚕几种病原微孢子虫的比较研究

从不同地区养蚕生产及桑园害虫中分别收集到四种微孢子虫，ＭＡ—１、ＭＤ—１、Ｐｈａ—Ｍ和Ｈａ—Ｍ。从它们孢子的形态、对蚕的致病性、相互间的血清学关系、在蚕体内的寄生部位和引起的组织与细胞病变以及在蚕体内增殖的生活史等方面与典型的家蚕微粒子病病原Ｎｏｓｅｍａｂｏｍｂｙｃｉｓ进行了比较研究。结果表明，ＭＡ—１与Ｎ．ｂｏｍｂｙｃｉｓ相同；Ｈａ—Ｍ可能亦来源于Ｎ．ｂｏｍｂｙｃｉｓ；ＭＤ—１为Ｎ．ｂｏｍｂｙｃｉｓ的形态变异株，定名为Ｎ．ｂｏｍｂｙｃｉｓｍｏｒ．ｖａｒ．；而Ｐｈａ—Ｍ为与Ｎ．ｂｏｍｂｙｃｉｓ不同的种，暂称为Ｎｏｓｅｍａｓｐ。     

不同容量母蛾样本检验微粒子灵敏度的测试

本试验通过用不同剂量的家蚕微粒子虫孢子感染5龄期家蚕幼虫，获得微粒子病毒蛾，并将这些有病蛾混入数量不等的未感染母蛾中，进行微粒子病检出率的测试，结果表明：在样本容量为180蛾时，检出率仍可达到现行生产要求的100%。     

家蚕微孢子虫感染BmN细胞的差异表达基因筛选及Akirin的原核表达

为探究家蚕微孢子虫(Nosema bombycis,Nb)感染宿主细胞的分子机制,以感染Nb的家蚕卵巢上皮细胞(BmN)为材料,通过GeneFishing技术进行基因差异表达分析,发现感染Nb的BmN细胞有10个基因被诱导或抑制表达,这些差异表达基因功能涉及蛋白质合成、细胞信号转导、线粒体呼吸链电子传递、细胞能量代谢、细胞免疫及一些未知功能。运用RT-PCR方法克隆在感染Nb的BmN细胞中差异表达的免疫相关基因Akirin,获得一个长588 bp的完整ORF,编码195个氨基酸,预测蛋白质分子质量21.98 kD,等电点为8.97,属于碱性蛋白,该蛋白质经SignalP在线预测未见信号肽。通过原核表达获得家蚕Akirin的外源融合表达蛋白,为进一步研究家蚕Akirin在家蚕先天免疫系统中的功能奠定了基础。     

家蚕微孢子RAD51基因的克隆、原核表达与体外翻译

从家蚕微孢子 (Nosemabombycis)中通过RT PCR扩增出RAD5 1(DNArepairprotein)基因的 3′端部分序列 ,经5′ RACE(RapidAmplificationofcDNAEnds)后得到全长cDNA序列 ,共 10 0 2bp ,编码 334个氨基酸。虽然用NorthernBlot检测不出mRNA的特异性表达带 ,但用RT -PCR直接扩增出全长cDNA而证实了该基因。该cDNA已作为新基因提交到GenBank数据库中 ,登录号为AF0 3730 5。将该基因在大肠杆菌 (E .coli)中进行表达 ,得到表达量较高的分子量约 37ku的蛋白质 ,经亲和层析纯化后得到较浓的单一蛋白带 ,纯化效果较好。用兔网织红细胞裂解液在体外也翻译出该分子量为 37ku的蛋白质 ,进一步确证了该蛋白。通过BLAST查询GenBank数据库 ,发现它与许多生物体的RAD5 1同源性很高     

从家蚕体分离的一种新微孢子虫SLN1的研究

从家蚕体中分离到一种新的病原性微孢子虫SLN1,其孢子形态大小与Nosemabombycis相似 ,而极丝较短。感染寄生于肌肉、气管上皮细胞、脂肪等组织 ,致病性弱 ,胚种传染率低。在孢子形成期产生多孢子芽膜 ,孢子形成数为 8个 ,与Nosemabombycis无血清学关系 ,分类于Thelohania属。     

野外昆虫与蚕种生产中的微粒子病防治

家蚕体内分离发现的 5种微粒子虫中 ,除家蚕微粒子虫 ( N osema bombycis)外未发现对家蚕具有较强致病性和胚传性的微粒子虫。野外昆虫中已有大量微粒子虫被发现 ,其中有些对家蚕也有很强的致病性和胚传性 ,但其原始寄主尚有诸多不明之处。所以 ,蚕种生产中防止野外昆虫微粒子虫对生产影响的根本途径在于控制家蚕微粒子虫污染的扩散和桑园治虫     

柞蚕微孢子虫单克隆抗体的研制及诊断

研究报告了柞蚕微孢子虫Nosemaantheraeae(简称N .a)单克隆抗体制备及免疫胶体金银染色法 (IGSS)诊断的结果。用抗N .a的单抗结合间接免疫胶体金银染色法 (IGSS)对 6种微孢子虫进行检测 ,在光学显微镜下柞蚕微孢子呈现特异的褐色 ,能与包括家蚕微孢子虫在内的其它 5种微孢子虫加以区别。     

不同来源的昆虫微孢子虫对家蚕的感染力与体外发芽率调查

从广西蚕区的野外昆虫菜粉蝶、桑尺蠖、斜纹夜蛾的体内收集到5种微孢子虫,以家蚕微孢子虫(Nosema bombycis,Nb)为对照,检测不同来源昆虫微孢子虫对家蚕的感染力,并调查各种微孢子虫在体外用家蚕肠液与KOH混合液(pH10.5)处理后的发芽率。从菜粉蝶分离的微孢子虫(PrL M)、从不同来源桑尺蠖分离的2种微孢子虫(PaB MⅠ和PaB MⅡ)、从不同来源斜纹夜蛾分离的2种微孢子虫(Sl MⅠ和Sl MⅡ)以及家蚕微孢子虫对家蚕(蚁蚕)的半数感染浓度(IC50)分别为2.15×105、2.90×105、5.62×106、3.38×107、9.05×106和1.86×105mL-1;PrL M、PaB MⅠ、PaB MⅡ、Sl MⅠ、Sl MⅡ和Nb的体外发芽率分别为76.75%、76.00%、12.50%、2.25%、2.75%和59.25%。PrL M和PaB MⅠ对家蚕的半数感染浓度与Nb接近,对家蚕的致病性较强,2种微孢子虫经家蚕肠液与KOH混合液处理后的体外发芽率也较高;PaB MⅡ、Sl MⅠ和Sl MⅡ对家蚕的半数感染浓度依次是Nb的30倍、182倍、49倍,说明这3种昆虫微孢子虫对家蚕的感染力较弱,并且3种微孢子虫的体外发芽率也很低。     

重度感染家蚕微孢子虫的家蚕丝腺cDNA文库构建及EST测序分析

用家蚕微孢子虫(Nosema bombycis,Nb)感染家蚕品种大造的3龄幼虫,于感染后第10天选择有Nb重度感染特征的家蚕丝腺组织无菌操作提取RNA,构建Nb和家蚕丝腺混合样品cDNA文库(文库滴度≥1.6×106PFU/mL)。对文库进行测序,获得EST序列5 026条,其中家蚕丝腺EST3 901条、家蚕微孢子虫EST970条。拼接后,分别获得家蚕丝腺和Nb的单一EST(unique EST)563和383条。对EST和unique EST进行分析发现,感染后第10天家蚕丝腺中Nb的组蛋白、细胞分裂激酶等与孢子分裂增殖相关的基因表达水平较高,一些可能与Nb侵染或寄生适应相关的基因,如Nb孢壁蛋白、极丝蛋白、转运体蛋白等基因亦在此时期较高水平表达,尤其是此期间有相对高水平的组蛋白脱乙酰基酶基因表达,说明Nb基因的表达受到组蛋白去乙酰化方式的调控。对家蚕微孢子虫uniqueEST的序列特征分析发现,Nb mRNA UTR的长度和GC含量与其它微孢子虫差异较小,但ORF区的AT含量较高,即家蚕微孢子虫基因ORF序列较其它微孢子虫发生了高AT变化。Nb unique EST的功能注释及分类结果表明感染后第10天家蚕丝腺中的Nb孢子仍处于多形期,还未完全成熟化。