应用多重RT-PCR检测甘蔗黄叶病毒和高梁花叶病毒

建立了多重RT-PCR同时检测甘蔗黄叶病毒(Sugarcane yellow leaf virus,ScYLV)和高梁花叶病毒病毒(Sorghum mosaic virus,SrMV)的技术体系,该体系可有效地对甘蔗田间植株和试管苗进行检测.根据引物之问的互补性及引物的Tm值筛选多重PCR引物.确定适宜的PCR缓冲液的...     

禽流感病毒H5亚型及H7亚型基因的引物设计与多重RT-PCR扩增

[目的]设计能用于多重RT-PCR扩增禽流感病毒H5、H7亚型基因的引物。[方法]在GenBank中搜索H5、H7亚型禽流感病毒的基因序列,并利用DNAStar分析其同源性,采用Primer Premier 5.0软件设计引物。[结果]多重RT-PCR扩增、琼脂糖凝胶电泳及测序结果显示引物设计成功。[结论]该方法用于禽流感病毒的快速诊断是可行的。     

禽流感病毒H5,H7,H9亚型多重RT-PCR检测方法的建立

依据GenBank中亚洲流行株禽流感病毒(AIV)H5,H7,H9亚型血凝素基因及M基因序列保守区域设计特异性引物,利用多重反转录聚合酶链式反应技术建立了AIV及H5,H7,H9亚型的检测方法.该方法能一次性检测出AIV保守区域M基因的同时,直接区分H5,H7,H9亚型.对新城疲病毒、传染性法氏囊病毒、传染性支气管炎病毒、传染性喉气管炎病毒等特异性检测均为阴性.样品经100倍稀释后仍能检出.     

禽流感病毒H5、H7和H9亚型基因的引物设计与多重RT-PCR扩增

PCR技术是分子生物学领域最基本也是最重要的技术手段之一.然而,找到一对合适的核苷酸片段作为引物,使其有效地扩增模板DNA序列,决定着PCR的成败.在GENEBANK中搜索H5、H7和H9亚型禽流感病毒的血凝素基因序列,并利用DNAStar软件分析它们的同源性,利用Primer Premier 5.0软件进行引物设计.多重RT-PCR扩增和琼脂糖凝胶电泳结果显示引物设计成功.     

H7N9亚型禽流感病毒RT-PCR检测方法建立

【目的】2013年3月,中国国家卫生和计划生育委员会宣布在上海、安徽地区发现了人感染H7N9亚型流感病毒事件,由于这种新型重组H7N9流感病毒未曾有过感染人或者动物的报道,因此出现了一系列亟待解决的问题,引起了全世界范围的广泛关注。根据H7N9亚型禽流感病毒 HA和NA核苷酸序列,设计并合成靶基因为HA和NA的2对引物,建立快速检测H7N9亚型禽流感病毒的一步法RT-PCR检测方法。【方法】根据测序结果,用DNAStar生物软件进行同源性分析比较,选出H7和N9基因中高度保守且特异的核苷酸区域,用oligo6.0软件设计针对H7和N9基因的引物。用Trizol LS提取RNA,采用一步法Access RT-PCR扩增反应液,建立了一步法检测H7N9亚型禽流感病毒RT-PCR 方法。以H7N9亚型流感病毒为阳性对照,其他亚型流感病毒以及新城疫、传染性支气管炎、传染性法氏囊等其他禽病病原作为阴性对照,按所建立的反应体系和反应程序进行RT-PCR反应,验证所建立方法的特异性。对病毒含量为 10^6.5 EID₅₀·mL^-1 的 H7N9 亚型禽流感病毒尿囊液依次进行 10 倍倍比稀释,提取RNA用RT-PCR 方法检测,评价其敏感性。另外,采取双盲试验用荧光定量RT-PCR对该方法进行了比对验证。【结果】用H7亚型特异性引物检测 H1-H15 亚型禽流感病毒和鸡新城疫病毒等其他禽病病原,除H7亚型流感病毒外,其他样品均为阴性;用N9亚型特异性引物检测N1-N9 亚型禽流感病毒和其他禽病病原,仅当前流行的H7N9 亚型 AIV 样品有特异性目的条带,与其他N1-N9 亚型禽流感病毒和鸡新城疫病毒等其他禽病病原均无交叉反应。通过对 H7N9亚型禽流感病毒尿囊液进行10倍倍比稀释检测,证实该方法最低检出量为 1.4×10^2.5 EID₅₀·mL^-1,并可以从阳性棉拭子浸出液中扩增出目的基因片段。【结论】该RT-PCR 方法具有特异性强和准确率高的特点,可以作为H7N9亚型AIV核酸检测的一种有效候选方法。     

一步法多重RT-PCR禽流感病毒分型诊断法的建立与应用

根据禽流感病毒(AIV)的M基因序列设计合成了1对AIVM基因的通用诊断引物AMDI／AMD2,针对H5N1、H9N2两种亚型的HA基因分型设计合成了2对分型诊断引物H15D1／H5D2,H9D1／H9D2。采用一步法多重RT-PcR技术建立了一种禽流感病毒快速分型诊断方法,并对其特异性和灵敏度进行验证。结果表明,该诊断方法速度快,一般只需要28～30 h即可鉴定出结果,比病毒分离鉴定(5～7 d)至少缩短4～6 d;特异性强,试验组53株AIV全部扩增出与预期同样长度的目的条带,与病毒分离及血清学鉴定方法的检测结果完全一致。对照组中新城疫病毒(NDV)、减蛋综合征病毒(EDS76V)、传染性支气管炎病毒(IBV)均未扩增出特异性基因条带,;灵敏度高,试验组将AIV接种SPF鸡胚,培养后的鸡胚尿囊液(AAF)进行10-2稀释后,仍可以检测到其中的AIV。     

利用内标为基础的多重RT-PCR技术检测草莓斑驳病毒和草莓轻型黄边病毒

草莓斑驳病毒(SMoV)和草莓轻型黄边病毒(SMYEV)分布较广,危害较重。应用CTAB法提取草莓总RNA,以优质的草莓总RNA为模板,结合扩增内标的检测体系,建立了SMoV和SMYEV的多重RT-PCR检测体系,可以对草莓田间植株和试管苗进行快速稳定的病毒检测。     

禽流感病毒H5和H9亚型RT-PCR检测方法的建立

根据H5和H9亚型的HA基因,设计合成2对特异性引物,分别建立了RT-PCR检测方法,优化了反应体系及反应条件,该方法敏感性可达10^-3,特异性好,与NFV、IBV与H5与H9相互间无交叉反应。利用所建立的RT-PCR检测了10份活禽及禽产品中存在的H5和H9亚型禽流感病毒,其检测结果与病毒的分离培养一致,比电镜和琼扩的检出率高30％,与其他NDV、IBV的病料无交叉反应,证明该方法具有很好的应用价值。     

多重RT-PCR方法在凡纳滨对虾病毒检测中的应用

病毒检测在预防和控制对虾病毒性疫病实践中具有重要的作用和意义.为了提高对虾病毒检测的快速性和简便性,建立了一种可同时检测6种对虾病毒的RT-PCR方法,并利用该方法对来自广西沿海地区的130份病虾样品中的黄头病毒(YHV)、白斑综合征病毒(WSSV)、桃拉病毒(TSV)、肝胰腺坏死病毒(HPV)、传染性皮下组织坏死病毒(IHHNV)以及杆状病毒(MBV)进行了检测.检测结果:白斑综合征病毒发病率最高,检出率高达73.8 %;传染性皮下组织坏死病毒发病率为18.5 %;桃拉病毒检出率为3.1 %;未检出黄头病毒、肝胰腺坏死病毒和杆状病毒.该RT-PCR方法扩增得到的片段经测序,结果与标准毒株的核酸数据高度吻合.实践证明,该实验建立的RT-PCR方法具有高度的准确性,与其他检测方法相比具有快速、简便的特点,在对虾病毒检疫、流行病学调查等方面具有重要的应用价值.     

禽流感病毒H5亚型及H7亚型基因的引物设计与多重RT-PCR扩增

RT-PCR作为一种现代分子生物学基因诊断技术,具有高度敏感性和特异性,能在数小时内检出痕量病原,可克服传统的禽流感病毒（AIV）诊断技术病毒分离鉴定试验周期长的缺点,为AIV早期快速诊断提供了敏感、快速、实用的方法。引物设计是保证RT-PCR成功的重要前提。笔者对运用Primer Premier5.0软件设计H5和H7亚型AIV的多重RT-PCR引物进行了探讨。     

禽流感检测能力比对试验的结果分析

对40份盲样采用琼脂扩散试验（AGP）、血凝抑制试验（HI）和反转录聚合酶链反应（RT-PCR）进行了检测。结果表明,在AGP试验中K1～K4盲样为禽流感抗体阳性,K5为阴性样本。在HI试验中,AJ5、AJ9、AJl3、AJl7、AJ23盲样为禽流感H5亚型抗体阳性;AJ4、AJ6、AJl2、AJl6、AJ2。为H7亚型抗体阳性;AJ2、AJl0、AJl4、AJl9、AJ22为H9亚型抗体阳性;其它盲样为阴性。在RT-PCR检测中,B20”B217、B232、B241盲样被扩增出分子长为229bp和372bp两条特异性的DNA片段,确定为H5亚型禽流感病毒,其它盲样为阴性。     

禽流感病毒H1、H3亚型和M基因三重PCR检测方法的建立

【目的】建立用于检测禽流感病毒（Avianinfluenzavirus,AIV）且能同时区分H1和H3亚型AIV的方法,为有效防控禽流感（Avianinfluenza,AI）奠定基础。【方法】根据H1亚型、H3亚型AIV-HA基因和M基因的保守核苷酸序列,分别设计3对特异性引物,以含有H1亚型AIV和H3亚型AIV的cDNA为模板,对三重PCR扩增条件进行优化,验证其特异性和敏感性,并对临床样品进行AIV检测。【结果】H1和H3亚型AIV混合模板经三重PCR扩增可获得3条特异性条带,其中302bp为H1亚型HA基因、453bp为M基因、626bp为H3亚型HA基因;含有H1或H3亚型AIV的模板均出现两条特异性条带,大小分别为302和453bp、453和626bp;含有其他亚型AIV的模板仅出现一条特异性条带（453bp）;而其他禽呼吸道疾病病毒均未扩增出任何条带。优化后的三重PCR最低能同时检测出7.00pg的H1亚型AIV、3.62pg的M基因和20.60pg的H3亚型AIV;对100个临床样品进行AIV检测,AIV总阳性率为36%,其中H1亚型阳性率4%、H3亚型阳性率9%、其他亚型阳性率23%。【结论】禽流感病毒H1、H3亚型和M基因三重PCR检测方法具有快速、敏感、特异等特点,适用于AIV的检测及H1和H3亚型AIV的分型检测。     

禽流感病毒LAMP快速诊断方法的建立

参考禽流感病毒(AIV)基质蛋白(M)基因设计了两对引物,特异性识别其6个不同位点,建立了基于颜色判定的环介导等温扩增反应(LAMP)方法。试验对不同禽源病毒进行了测试,结果发现该方法仅特异性地检出禽流感病毒(H9和H5亚型)核酸,对AIV病毒的检测极限为10 EID50。人工感染病料检测结果与鸡胚病毒分离法的符合率为967%。数据表明,建立的LAMP方法特异、敏感、简便,在禽流感的诊断中具有很大的临床应用潜力。     

基于荧光熔解曲线模式RT-PCR快速检测H5N1亚型禽流感病毒

针对H5N1亚型禽流感病毒(AIV)的HA、NA基因保守序列设计2对引物,建立了SYBR Green Ⅰ双重荧光RT-PCR(RRT-PCR)方法,实现了同一反应管内同时检测AIV的H5和N1亚型基因.熔解曲线分析显示,H5和N1扩增片段的熔解温度分别为(795±03)℃和(833±03)℃,无引物二聚体形成,扩增产物片段大小分别为150bp和474bp,与预期大小相符,测序结果证实为H5和N1亚型基因的靶序列.该方法能从H5N1样本中检出阳性扩增信号,熔解曲线可见H5和N1双特异峰;而H5N2样本有阳性扩增,熔解曲线仅见H5单特异峰.AIV的其他HA亚型和其他病毒的RNA、DNA 无扩增信号.本法最低可检测210拷贝·μL-1和195拷贝·μL-1 H5和N1重组质粒,敏感度分别是RT-PCR的100、1 000倍.本研究建立的基于荧光熔解曲线模式RT-PCR可用于H5N1亚型AIV的检测.     

抗H5N1型禽流感病毒单克隆抗体的制备与鉴定

制备抗H5N1型禽流感病毒单克隆抗体并对其进行鉴定.采用纯化抗原免疫BALB/c小鼠,取免疫小鼠脾细胞与骨髓瘤细胞融合,筛选分泌抗AIV-H5N1的单克隆抗体细胞株,将阳性细胞株接种小鼠腹腔制备单克隆抗体腹水并对腹水抗体进行纯化,测定抗体亚类,并对其抗原结合位点进行分析.共获得了5株单克隆抗体杂交瘤细胞株,均为抗AIV-H5N1的特异性单克隆抗体,而且与H9N1型禽流感病毒,H13型禽流感病毒,鸡新城疫病毒,产蛋下降综合征病毒,鸡传染性支气管炎病毒均无交叉反应.     

应用套式RT—PCR检测广西临床病料猪流感病毒

套式RT-PCR技术是在常规RT-PCR的基础上设计1对内套引物,对常规RT-PCR的产物再进行一次PCR扩增,该技术比常规RT-PCR技术的检测敏感度更高,更适于检测病原RNA含量极其少的临床病料。通过应用套式RT-PCR方法对来自广西7个市不同猪场的疑似猪流感的临床病料进行猪流感病毒检测,结果发现,被检的7个市均检出猪流感病毒,72份病料中31份为阳性,阳性率为43．06％,可见广西有呼吸道症状的病猪中有较高猪流感病毒感染率,必须重视和加强广西猪流感的监测与防控工作。     

R-藻红蛋白标记抗体荧光探针的高效制备及其在禽流感病毒检测中的应用

用适宜摩尔浓度的异型双功能交联剂SPDP将R-藻红蛋白与纯化的禽流感病毒H9亚型多克隆抗体交联,并经高效液相色谱纯化制备R-藻红蛋白标记抗体荧光探针.以溴化氰活化的琼脂糖微球为固相载体,采用双抗体夹心法建立固相免疫荧光检测法,以制备的R-藻红蛋白标记抗体荧光探针检测禽流感病毒H9尿囊毒.结果表明,阳性微球在蓝、绿光激发下发射桔黄色荧光,荧光明亮,无背景光干扰,特异性好,灵敏度高,可检测蛋白浓度为1.85×10-5 mg·mL-1的H9亚型尿囊毒.R-藻红蛋白标记探针的检测灵敏度高于FITC标记探针,R-藻红蛋白可替代FITC或与FITC等荧光染料一起用于多色荧光免疫检测.     

鸡新城疫病毒和禽肺炎病毒二重RT-PCR检测方法的建立及应用

[目的]建立一次性可同时扩增鉴别鸡新城疫病毒(NDV)和禽肺炎病毒(APV)的二重RT-PCR,为有效防控鸡新城疫和禽肺炎病毒病提供技术支持.[方法]根据GenBank已发表NDV的F基因序列(GenBank登录号JX840454)和APV的F基因序列(GeneBank登录号AF187154)分别设计2对特异性引物,应用这2对引物建立可同时检测鉴别NDV和APV的二重RT-PCR,对扩增条件进行优化,并通过特异性试验、敏感性试验和临床样品检测等验证其实用性.[结果]优化后的二重RT-PCR可特异性扩增出参试NDV毒株(LaSota株、F48E9株、I株)及APV/MN-10毒株的目的条带,其大小分别为247和424 bp,而其他对照参试毒株在247和424 bp处均无特异条带出现.二重RT-PCR针对NDV和APV的最低检出限均为10 pg的RNA.应用建立的二重RT-PCR对132份从广西采集的病鸡样品进行检测,结果得到NDV阳性样品26份、APV阳性样品2份,与血清学方法的鉴定结果一致.随机选取的2份NDV阳性PCR产物与NDV(GenBank登录号JX840454)的F基因序列一致,同源性达100%;2份APV阳性PCR产物与APV(GenBank登录号AF187154)的F基因序列也完全一致,同源性达100%.[结论]针对NDV和APV建立的二重RT-PCR具有特异性好、灵敏度高、简便快速的特点,可用于临床快速鉴别诊断,为有效防控鸡新城疫和禽肺炎病毒病提供了技术支持.     

AIV、NDV和安卡拉病毒多重PCR检测方法的建立及应用

【目的】建立鉴别禽流感病毒(AIV)、新城疫病毒(NDV)和安卡拉病毒(FAV-4)的多重PCR检测方法。【方法】根据GenBank已登录的AIV的M基因、NDV的F基因和FAV-4的Hexon基因序列,设计合成了3对特异性引物。提取3种病毒DNA/RNA,通过优化多重PCR反应中的引物浓度和退火温度,建立快速鉴别3种病毒的多重PCR方法,并对该方法的特异性、敏感性和重复性进行检验。应用建立的多重PCR方法对67份临床病料进行检测,并将其结果与已建立的单重PCR检测结果进行比较。【结果】成功建立了能快速鉴别3种病毒的多重PCR方法,该方法特异性良好,对传染性支气管炎病毒(IBV)、传染性法氏囊病病毒(IBDV)、鸡痘病毒(FPV)、鸡马立克病病毒(MDV)的扩增结果均为阴性;敏感性较强,能检测出的NDV、FAV-4和AIV最低核酸质量浓度分别为24.3,30.4和28.0pg/μL。多重PCR方法临床病料的检测结果与单重PCR检测结果一致。【结论】建立的AIV、NDV和FAV-4多重PCR检测方法方法可以用于临床上3种病原的鉴别诊断。