广西首例体细胞克隆猪诞生

10月13日，过生日的广西养猪分会理事长、广西大学动物科学技术学院何若钢教授双喜临门。上午9时，作为国家自然科学基金资助项目《广西地方优良品种巴马小型猪体细胞核移植研究》课题组成员的他收到了一份特殊的“生日礼物”——广西首例体细胞克隆猪在广西畜牧研究所陆川猪保种场诞生。     

体细胞克隆猪胚胎的研究进展

自"多利"羊问世以来,体细胞克隆研究已取得了很大进展,相继获得了牛、山羊、鼠等克隆动物.相对而言,猪的体细胞克隆研究进展较慢,其主要原因是猪的生殖细胞、胚胎体外显微操作难度较大;妊娠维持有别于其他家畜,需具备一定量的胚胎数.所以直至2000年才有所突破,获得了体细胞克隆后代.然而,猪体细胞核移植的效率很低,用占移植卵母细胞的比例来衡量,只有1%～2%.本文主要就猪体细胞克隆的关键技术加以简要论述,供参考.     

体细胞克隆猪皮肤和毛发色素脱失的研究

利用杜洛克猪供体细胞已成功培育了9头克隆猪,其中1头在初情期皮肤和毛发出现明显的色素脱失,本试验对该头克隆猪的体细胞核移植异常的病因进行了研究。假设Waardenburg综合征的相关基因(Mitf、Pax-3、Sox-10、Slug和Kit)与克隆猪体细胞核移植(scNT)所致的色素脱失密切相关。试验从受scNT影响和未受scNT影响的猪耳组织中分别提取总RNA,运用反转录聚合酶链反应扩增Mitf、Pax-3、Sox-10、Slug的转录体和Kit基因,测序并分析。cD-NA序列反转录结果表明,毛发逐渐褪色的scNT猪的这些基因并没有发生突变。尽管没有发现任何突变,但与未受scNT影响的猪相比,Waardenburg氏综合征相关的这些基因在受scNT影响猪中的表达出现明显的负调控。基因表达的负调控可能产生一种黑素细胞不稳定的新表型,并最终导致色素沉着逐渐消失。     

我国首例成体体细胞作为核供体的东北民猪克隆成功

10月12日，在哈尔滨市三元畜产实业有限公司种猪场，由东北农业大学刘忠华博士带领的《东北民猪体细胞核移植研究》课题组与哈尔滨市三元畜产实业有限公司合作，培育出的我国首例采用成体体细胞作为核供体的3头健康雌性克隆东北民猪以剖腹产的方式顺利出生．克隆猪各项形态特征与供核体细胞个体完全一致。     

供体细胞对哺乳动物体细胞核移植的影响

哺乳动物体细胞核移植技术(克隆)在农业、生物技术、医药生产和濒危动物保护等方面具有很大的潜力和应用价值,已成为目前发育生物学研究的重要方法.文章依据近年来国内外在动物克隆技术方面的资料,分析了供体细胞类型、供体细胞动物年龄、供体细胞所处细胞周期、体外传代次数以及供体动物性别等因素对克隆动物效率的影响及可能原因.     

我国科学家新建立两种基因敲除克隆猪模型

中国科学院广州生物医药与健康研究院研究员、吉林大学教授赖良学博士的研究团队针对猪的酪氨酸酶、PARK2和PINK1基因的外显子设计了Cas9打靶质粒,将其分别转染版纳小型猪的胎儿成纤维细胞和巴马小型猪的胎儿成纤维细胞后,获得了纯合的酪氨酸酶基因敲除以及PARK2和PINK1双基因敲除的细胞系。细胞系用于体细胞核移植后获得15头酪氨酸酶基因敲除克隆猪,20头PARK2和PINK1双基因敲除克隆猪。     

PGM-CSF对手工克隆猪生产效率的影响

为了优化猪的手工克隆技术方案,从而提高猪手工克隆效率,通过比较不同浓度(2和10 ng/m L)的猪粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(PGM-CSF)对孤雌胚胎和克隆胚胎的囊胚发育率及囊胚细胞数的影响,并将PGM-CSF处理过的手工克隆囊胚进行移植,比较对照组和试验组的妊娠率、产仔率及克隆整体效率。结果显示:用10 ng/m L PGM-CSF处理重构胚后,试验组胚胎细胞数统计略高于对照组((47.74±3.88)vs(43.69±3.72)),囊胚率高于对照组((39.10±0.01)%vs(36.27±0.02)%),但差异均不显著(P0.05);试验组10只受体中有5只怀孕且分娩,而对照组10只受体只有1只怀孕且分娩;试验组出生仔猪存活率略高于对照组(36.36%vs 30.00%),克隆总效率略高于对照组(0.37%vs 0.30%),但没有显著差异(P0.05)。综上所述,PGM-CSF有利于提高猪手工克隆胚胎整体发育能力,有提高猪手工克隆对受体的利用率的潜在可能性。     

水牛体细胞连续核移植的效果

为探讨水牛体细胞连续核移植的效果,以水牛胎儿成纤维细胞为核供体,进行了水牛体细胞连续核移植。结果显示,连续核移植的融合率显著高于原代核移植(87.9%vs76.2%,P<0.05),但两者之间的分裂率和囊胚率没有显著差异(P>0.05);这说明水牛体细胞核移植胚胎可被再次克隆而不降低其发育能力,水牛体细胞连续核移植是可行的。     

克隆猪的胚胎移植技术及其应用

胚胎移植是生产克隆猪的重要环节。猪的胚胎移植技术目前在我国还处于起步阶段,中国农业大学生产的克隆胚胎在河北明慧集团有限公司二元母猪场进行了胚胎移植试验．并最终成功地接生了克隆仔猪。此次成功,也为猪胚胎移植技术的普及和今后转基因猪的生产做出了巨大贡献。     

体细胞核移植生产梅山猪

本研究以中国优良地方品种梅山猪为材料,采用胰酶消化法获得猪胎儿成纤维细胞,通过使用Y染色体SRY基因引物SRY-1、SRY-2进行PCR扩增,结果发现,雄性胎儿样本能扩增出250 bp的Y染色体特异性基因片段,而雌性胎儿样本未扩增出此条带;G1、G2、G3、G4和G5代的融合效率差异不显著(P>0.05),但G5代作为供体细胞核移植的重组胚胎卵裂率显著高于G1、G2、G3和G4代(P<0.05);使用G5代的胎儿成纤维细胞作为供核细胞,通过手术移植的方法,将重构胚胎移植到二元后备母猪体内,结果成功地获得了体细胞克隆梅山仔猪,并且仔猪全部为雄性胎儿,说明该性别鉴定方法不但操作简单,而且准确度高;经微卫星DNA 多态性鉴定,确定克隆猪来自供核细胞,与代孕母猪无亲缘关系。本研究将为中国优质猪品种改良、保种、性别控制及建立人类疾病模型等研究提供有效可行的方法,为批量生产克隆优秀种猪提供了坚实的理论基础。     

水牛体细胞核移植方法的研究

探讨电融合参数对水牛体细胞核移植效果的影响。体外成熟培养 22~24 h的水牛卵母细胞,在含有 5μg/mL细胞松弛素的操作液中进行去核,然后将经0 .1 mg/L Aphidicolin (APD)处理1 d, 再用0. 5% FBS培养2~9 d的水牛耳皮成纤维细胞或颗粒细胞注射到去核的卵母细胞卵周隙中,再经电融合形成重构胚。重构胚经 5μmol/L离子霉素激活处理5 min并在2 mmol/L的 6 DMAP中培养 3 h后,在含有颗粒细胞单层细胞的微滴中(30μL)培养7~9 d,观察其卵裂和胚胎发育情况。当电融合的电场强度为1 500 V·μs/mm(电压100 V/mm×脉时15μs)时,电脉冲3次,颗粒细胞核移植的融合率为 74.18%,分裂率为 71.82%,囊胚发育率为 10%,融合率显著高于2次电脉冲(52.03%,P<0. 05),卵裂率显著高于4次电脉冲(53.95%,P<0. 05);当电脉冲次数为 3 次时,电场强度为2 000 V·μs/mm的分裂率(53.54%)显著低于1 500 V·μs/mm,2 500 V·μs/mm的融合率(62.0%)和分裂率(53.23%)均显著低于1 500 V·μs/mm(P<0 .05)。采用耳皮成纤维细胞作供核的融合率(59.75%)和分裂率(57.45%)均显著低于颗粒细胞。染色体组型分析显示,66.7%的核移植胚胎具有正常的供体细胞二倍体核型。将来自1头22岁的摩拉公牛耳皮成纤维细胞的2枚冻胚移植给受体母牛,妊娠到215 d时发生流     

水牛体细胞核移植的研究

系统探讨了水牛体细胞核移植的各种影响因素，并初步建立了水牛体细胞核移植的一整套程序。体外成熟培养22～24h的水牛卵母细胞去核后，将经血清饥饿(0.5％FBs)培养2～9d、0．1mg／L Aphidicolin(APD)培养 0．5％FBs培养2～9d或一般培养法(10％FBS)培养的水牛耳皮成纤维细胞或颗粒细胞，直接注射到去核的卵母细胞质中，或注射到卵周隙中再经电融合(100V／mm，15μs，电脉冲3次)构建重构胚。重构胚经化学激活后(5pmol／L离子霉素5min，2mmol／L6-DMAP3h)培养7～8d，评定其胚胎发育能力。耳皮成纤维细胞和颗粒细胞经0．1mg／L APD 0．5％FBs培养处理后的重组胚卵裂率，均极显著高于血清饥饿和一般培养处理的同种供体细胞(P＜0.01)，但囊胚发育率无显著差异(P＞0．05)。耳皮成纤维细胞和颗粒细胞经0.1mg／L APD 0.5％FBS处理后进行核移植的分裂率和发育率均无显著差异(63．06％比58．70％，P＞0．05)。以水牛颗粒细胞为核供体时，电融舍法的重构胚分裂率显著高于胞质内注入法(P＜0.05)，囊胚发育率无显著差异(P＞0.05)。培养3代和6代的水牛颗粒细胞以及培养6代和10代的耳皮成纤维细胞，其具有正常二倍染色体的细胞比例均无显著差异(P＞0.05)；以这2种细胞不同培养代数作供体进行核移植时，各代之间核移胚的体外分裂率、囊胚发育率无显著差异P＞0.05)。这些结果表明：(1)水牛耳皮成纤维细胞和颗粒细胞经培养传代所建立起来的细胞系相对比较稳定；(2)0.1mg／L APD预培养处理供体细胞能提高水牛体细胞核移植的效果，但血清饥饿培养则无作用；(3)水牛耳皮成纤维细胞和颗粒细胞均可作供核细胞，核移植后都能得到体细胞克隆的囊胚，但前者的效果略优于后者，且其核移植效果不受供核细胞培养代数的影响；(4)电融合核移植胚胎的发育率高于胞质内直接注入法，但两者的总体效率相似。     

绵羊卵丘细胞细胞周期同步化对核移植胚胎发育的影响

供体细胞周期同步化是影响体细胞核移植成功率的重要因素之一.试验分别对绵羊卵丘细胞采用血清饥饿和接触抑制的方法进行细胞周期同步化处理,使用流式细胞仪检测各组细胞周期的分布.结果发现,与对照组相比,卵丘细胞经血清饥饿24~72 h后,显著地增加了G₀/G₁期细胞的百分比(P <0.05);接触抑制24~72 h,G₀/G₁期细胞所占比例与血清饥饿组无显著差异(P >0.05),但显著高于对照组(P <0.05);用经血清饥饿与接触抑制的供体细胞进行核移植后,重构胚卵裂率、桑椹胚率和囊胚率差异不显著(P >0.05),但二者囊胚率显著高于对照组(P <0.05).上述结果证实,血清饥饿和接触抑制均能使绵羊卵丘细胞周期同步化至G₀/G₁,均可用作绵羊体细胞核移植的供体细胞细胞周期同步化处理.     

哺乳动物体细胞克隆技术的应用前景

体细胞克隆的成功为农业、医学以及生物学基础研究提供了新的工具。体细胞核移植技术和转基因、胚胎干细胞等现代生物技术的相互渗透更是活跃。当前,尽管体细胞核移植效率仍然不甚理想,而且克隆后代成活率低、畸形率高,但人们还是对该技术的发展充满了憧憬,尤其希望借助这一手段在攻克一些长期困扰人类的疑难疾病上有所突破。作者则总结了体细胞核移植在上述各方面的应用价值,供同行参考。     

提高猪核移植效率的研究进展

哺乳动物体细胞核移植(克隆)经过多年的发展,获得了多种后代。猪的核移植研究意义重大,应用价值颇高,是当今生物技术的热点研究之一。尽管猪核移植已取得了很大进展,但移植效率依然很低。本文就目前已有的资料,综述了提高猪体细胞核移植效率的各项技术环节的研究进展。     

小鼠体细胞核移植研究进展

体细胞核移植是目前生物技术领域研究的热点之一。小鼠作为一种广泛使用的实验动物模型,具有遗传背景清楚、繁殖周期短、饲养成本较低等优点,因此小鼠体细胞核移植具有较大的研究价值。作者简要回顾了小鼠体细胞核移植的发展史,并对体细胞核移植方法、影响核移植效率的因素,包括供核细胞的类型、供核细胞的体外处理、核质细胞周期协调、重构胚的激活、体外培养体系及核移植分子机制等进行了综述,并展望了小鼠体细胞核移植的应用前景。     

绵羊去透明带卵母细胞体细胞核移植研究

为探索简化的核移植程序,本研究分析不同成熟培养时间、去核过程中紫外光照时间、融合电压强度、激活剂种类、不同培养方法对绵羊去透明带卵母细胞核移植的影响。结果表明:卵母细胞成熟培养18～19 h后去除透明带,其极体排出和附着效果最佳。采用1.9 kV/cm直流电压融合去核卵母细胞与颗粒细胞,融合率为88.2%,效果最好。离子霉素对重构胚具有较好的激活效果,卵裂率为82.1%,囊胚率为10.4%;压制WOW(s孔中孔)发育组卵裂率和囊胚发育率与四孔板培养组相比无显著差异,但卵裂率和囊胚发育率并不高;去除透明带的绵羊卵母细胞采用衰减1/4的UV照射10 s辅助去核后,卵裂率为35.6%,但重构胚未能发育至囊胚。结果显示,通过去透明带辅助显微操作去核的方法进行的绵羊体细胞克隆程序较易掌握。     

哺乳动物异种体细胞核移植技术的应用及影响因素

哺乳动物异种体细胞核移植技术是在同种细胞核移植技术基础上发展起来的动物生殖技术,其在濒危动物保护、人类胚胎干细胞及生物基础学科研究等方面已展现出美好的前景.目前,该技术处于发展阶段,还存在很多值得研究的问题.文章介绍了动物异种体细胞核移植技术在国内外的研究现状,分析了影响异种体细胞核移植技术发展的因素,并对该技术的发展前景进行了展望.