2种harpin内源表达对短短芽孢杆菌HAB-5菌株抑制和促生能力的影响

采用化学方法分别将来自水稻白叶枯病菌(Xanthomonas oryzae pv.oryzae)、棉花角斑病菌(X.citri subsp.malvacearum)hrp基因簇中的hpa1_(Xoo)、hpa_(Xm)基因转化至生防菌短短芽孢杆菌(Brevibacillus brevs)HAB-5菌株,测定2种harpin蛋白对短短芽孢杆菌抑菌和促生能力的影响,以期获得更高效的生防菌株。结果表明,获得转入hpa1_(Xoo)的突变体581个,转入hpa_(Xm)的突变体有650个;经PCR及PCR Southern Blot验证,确定hpa1_(Xoo)、hpa_(Xm)基因均成功转化至HAB-5菌株中;经SDS-PAGE电泳,在分子量大小约39、41 ku处可见明显条带,表明hpa1_(Xoo)、hpa_(Xm)基因分别编码的融合蛋白GST-harpin Xoo、GST-harpin Xm在突变体菌株中得到表达;与出发菌株HAB-5菌株相比,转化后的突变体在菌落形态、拮抗活性上均发生了改变,且突变体总蛋白可在烟草叶片上激发过敏性反应,而HAB-5菌株总蛋白不能激发过敏性反应;突变体菌株对番茄种子的促生作用显著提高,且转入hpa_(Xm)基因的菌株效果更佳,使胚芽、胚根的生长分别提高100.77%、69.14%。可见,harpin能够在短短芽孢杆菌HAB-5菌株中得到表达,且转化后的突变体表现出良好的促生效果。     

载HarpinXooc蛋白纳米粒的制备及生物学效应测定

为了评价载HarpinXooc蛋白纳米粒的性状及其在农业领域的应用效果,利用静电聚合原理,以壳聚糖为载体,多聚磷酸钠为交联剂制备载HarpinXooc蛋白纳米粒,测定其粒径、zeta电位、包封率、载药量和释放情况,考察振荡时间对纳米粒的影响.结果显示:载HarpinXooc蛋白纳米粒形态均一,粒径、zeta电位、包封率和载药量分别为(270.0±3.0)nm、(16.5±0.9)mV、62.7%±1.8%和12.6%±2.4%,具有缓释效应,可以诱导烟草产生过敏性反应和更好地促进植物生长.表明:此方法制备条件缓和,工艺简单,包封率较高,制得的载HarpinXooc蛋白纳米粒生物学效应好.     

β-氨基丁酸保护烟草抵抗TMV侵染的研究

[目的]研究B-氨基丁酸（β-amino—butyricacid,BABA）保护烟草增强其抗烟草花叶病毒（TMV）侵染的能力。[方法]以云烟87为材料,分别用O．5、1．0、5．0、7．0、10．0mmol／L的BABA处理烟草,以喷清水为对照,统计BABA对TMV的抑制率,筛选最适BABA浓度。用5．0mmol／LBABA喷施处理,观察烟叶的发病情况,同时用组织化学法鉴定BABA诱导烟草产生的过敏反应,进行H202原住检测以及苯丙氨酸解氨酶（PAL）活性测定,采用SDS．PAGE检测病程相关（PR）蛋白。[结果]BABA处理后能显著诱导氧进发,引起过敏性反应,烟叶中的PAL活性升高,有分子量为20kDa的PR蛋白出现。烟叶TMV发病率明显减轻,BABA增强了烟草对TMV的抗性,5．0mmol／LBABA能保护烟草抵抗TMV侵染。[结论]为进一步揭示BABA的诱导机理提供了理论依据。     

茶园土壤拮抗放线菌的分离和筛选

以辣椒炭疽病菌（Colletotrichum capsici）为指示菌,采用平板对峙法,从茶园土壤中筛选到9株具有明显拮抗效果的放线菌,菌株抗菌谱较广,对茶白星病菌、烟草黑胫病菌、水稻纹枯病菌、黄瓜腐霉病菌有较好的拮抗作用．其中3株菌株发酵液对烟草黑胫病菌抑制作用较强,其抑制率分别达78．8％、61．2％、56．5％．     

表达全长与截短HarpinXoo对转基因烟草抗病性的影响

将水稻黄单胞细菌白叶枯致病变种(Xanthomonas oryzae pv.oryzae)编码HarpinXoo的hrfA基因及其N-末端缺失突变基因AB分别连接到双元载体pBI121上,构建成转基因载体,并经冻融法转化土壤杆菌EHA105.采用叶盘法转化烟草,用卡那霉素抗性筛选再生植株.通过PCR扩增检测了转化烟草中的靶基因序列及35S启动子序列,对T1代PCR阳性植株进行了PCR-Southern杂交和RT-PCR分析.结果显示,外源基因已经整合到转基因烟草基因组中,并在转录水平正常表达.用从转hrfA基因和AB片段的烟草中提取的可溶性蛋白注射烟草都能引起过敏反应,说明目的基因在转基因烟草中能表达出有活性的蛋白.抗病性鉴定结果表明,转N-末端AB片段的烟草和转hffA全长基因的烟草一样表现出对烟草花叶病毒(TMV)的抗性.     

表达全长与截短HarpinXoo对转基因烟草抗病性的影响

将水稻黄单胞细菌白叶枯致病变种(Xanthomonas oryzae pv.oryzae)编码HarpinXoo的hrfA基因及其N-末端缺失突变基因AB分别连接到双元载体pBI121上,构建成转基因载体,并经冻融法转化土壤杆菌EHA105.采用叶盘法转化烟草,用卡那霉素抗性筛选再生植株.通过PCR扩增检测了转化烟草中的靶基因序列及35S启动子序列,对T1代PCR阳性植株进行了PCR-Southern杂交和RT-PCR分析.结果显示,外源基因已经整合到转基因烟草基因组中,并在转录水平正常表达.用从转hrfA基因和AB片段的烟草中提取的可溶性蛋白注射烟草都能引起过敏反应,说明目的基因在转基因烟草中能表达出有活性的蛋白.抗病性鉴定结果表明,转N-末端AB片段的烟草和转hffA全长基因的烟草一样表现出对烟草花叶病毒(TMV)的抗性.     

水稻白叶枯病菌转录调控因子OxyRxoo对细菌抗氧化系统的调控作用

病原细菌对活性氧的降解是抗氧化和侵染中的重要毒性机制之一。阐述了水稻白叶枯病菌（Xanthomonas oryzaepv.oryzae）的转录调控因子OxyRxoo在病菌抗氧化系统中的调控作用,以及目前对OxyRxoo的研究进展。     

恩诺沙星纳米粒的制备及稳定性研究

[目的]优化恩诺沙星纳米粒制备参数,考察其稳定性。[方法]以壳聚糖为辅料,采用离子交联法和冷冻干燥法制备恩诺沙星壳聚糖纳米粒,以包封率为参考指标设计正交试验,确定优化制备参数,以透射电镜观察其表观特征,并对其热稳定性及紫外稳定性进行考察。[结果]以优化参数制备的恩诺沙星壳聚糖纳米粒平均粒径237．4nm平均包封率（71．9±2．2）％,平均载药量（12．4±0．6）％。与原料药相比,4h热降解率和紫外降解率分别减少了38．4％和13．3％。[结论]离子交联法和冷冻干燥法适用于制备恩诺沙星壳聚糖纳米粒,其产品具有良好的热稳定性和紫外稳定性。     

水稻白叶枯病菌对拌种灵抗药性分子机制研究

  通过紫外诱变获得了抗拌种灵水稻白叶枯病菌（Xanthomonas oryzae pv.oryzae）的突变体，这些突变体可以在含100 μg·ml-1拌种灵平板上生长，而敏感菌株在10 μg·ml-1浓度下则不能生长。敏感菌株琥珀酸脱氢酶活性受拌种灵强烈抑制，而抗药突变体的酶活性较低，且不受药剂抑制。应用6对引物，从水稻白叶枯病菌野生敏感菌株和室内诱导抗药性菌株中扩增到琥珀酸脱氢酶基因全序列。该基因全长3 616 bp，编码1 115个氨基酸，含有2个内含子。与柑橘溃疡病菌（Xanthomonas axonopodis pv. citri）琥珀酸脱氢酶核苷酸同源性93%，氨基酸同源性97%；与其它6种病原细菌琥珀酸脱氢酶基因编码的氨基酸序列同源性为43%～95%。敏感菌株和抗药菌株的琥珀酸脱氢酶序列分析表明，琥珀酸脱氢酶铁硫蛋白亚基中229位氨基酸由组氨酸（CAC）突变为酪氨酸（TAC）是导致X. oryzae对拌种灵产生抗药性的主要原因。     

水稻白叶枯病菌hrp调节基因hrpXoo的克隆与序列分析

 用化学方法诱变水稻白叶枯病菌PXO99A 菌株 ,获得 6株hrp-突变体 ,此突变体除丧失在非寄主烟草上激发过敏反应和在感病寄主水稻上的致病能力外 ,有些缺乏激发烟草产生HR的信号物质 ,有些在胞内存在此信号物质 ,而不能泌至胞外。来自Xanthomonasoryzaepv .oryzaeJXOIII粘粒基因文库的hrp基因克隆pUHRX2 4 5 ,所携hrp基因片段大小为 36 .8kb。系列亚克隆 36 .8kbhrp基因片段及各亚克隆对hrp-突变体功能互补作用的结果显示 ,3.3kbSacI片段为最小酶切功能片段。序列测定和分析结果表明 ,3.3kbhrp片段含hrpX oo基因和含与热激蛋白 90家族有关的 2个开放阅读框hspORF1和hspORF2。HspORF1在蛋白质数据库中未发现序列蛋白。HspORF2与Hsp90 Xo的同源性达 99%。hrpXoo与黄单胞菌中已报道的hrpX基因有很高的同源性(90 %以上 )。在黄单胞菌中高度保守的编码α 螺旋 转 α 螺旋结构的 6 0 bp核苷酸序列 ,在交叉功能互补时是必需的。不含此结构的hrpXoo (1.1kb)片段 ,可使JXOIII的hrp-突变体在水稻上具致病性和在非寄主烟草上激发产生HR ,但不能使来自PXO99A 和RS10 5的hrp-突变体恢复在烟草上激发产生HR的功能。黄单胞菌中已知HrpX的同列比较显示 ,X .oryzae和X .campestris种间在 88、196和 2 4 7位点的氨基酸上有     

水稻白叶枯病菌解毒蛋白的纯化及其对热和蛋白酶K的稳定性

采用(NH4 )2SO4分步沉淀法,从水稻白叶枯病菌培养液中分离到对水稻白叶枯病菌毒素有解毒作用的物质,即解毒粗蛋白(Crudedetoxificationprotein,简称CDP)。该解毒粗蛋白可以明显解除水稻白叶枯病菌毒素对水稻苗期生长的抑制作用、减轻毒素注射引起的烟草叶片组织坏死反应。运用滚动式等电聚焦电泳(RPIE)和离子交换层析(FPLC)技术,对解毒粗蛋白进行了分离纯化,SDS PAGE电泳鉴定结果表明,该解毒蛋白相对分子质量为 47 9kD。研究结果还表明该解毒粗蛋白对热和蛋白酶K不稳定。     

HarpinXoo诱导烟草过敏性细胞死亡的细胞及分子特征

 HarpinXoo是水稻白叶枯病菌分泌的蛋白质，用harpinXoo注射烟草后20 h，可表现过敏性细胞死亡（hypersensitive cell death, HCD）。对harpinXoo诱导的烟草叶片用DNA特异染料（DAPI）染色后经荧光显微镜观察发现，烟草细胞在harpinXoo诱导后不同时间表现明显的染色质浓缩；对诱导后的烟草DNA经2％琼脂糖凝胶电泳发现，诱导后12 h烟草DNA开始出现弥散的条带，24 h后弥散的小片段大量增加；定量RT-PCR检测发现，harpinXoo诱导的烟草HCD早期即有标志基因hin1和hsr203J的诱导表达。这些结果表明，harpinXoo诱导的烟草细胞死亡，是植物的一种主动反应，具有细胞编程死亡的重要特征。     

Exchangeability of Two hrp Gene Fragments from Xanthomonas oryzae pv.oryzae and pv.oryzicola for Hypersensitive Response on Tobacco and Pathogenicity on Rice

hrp- mutants were produced from strain JXOIII of Xanthomonas oryzae pv.oryzae (Xoo) and strain RS105 of X.o.pv.oryzicola (Xooc), respectively, by using diethyl sulfate (DES) as a mutagenic che-mical. All the hrp- mutants lost their pathogenicity on a susceptible host plant, rice (Shanyou63), and elicitation of the hypersensitive response (HR) on a nonhost plant, tobacco (NC89). Extracellular enzyme (amy-lase, pectate lyase, proteinase, cellulase and lipase) activities of all the hrp- mutants were similar to those of the corresponding wild type strains. The response of tobacco to cell-sonicated integrations of the wild type strains and the hrp- mutants demonstrated that there existed an HR eliciting substance which was heat-stable and sensitive to protease. No HR appeared on tobacco after infiltration of the lipopolysaccharide (LPS) of both the wild strains and hrp mutants into tobacco leaves. The ability of the Xooc hrp- mutants to induce HR on tobacco and cause streak disease on rice was restored by complementation with pUHRX245 from JXOIII genomic DNA library and by pUHRS138 from RS105 genomic DNA library, respectively. Subcloning of a 38.6-kb hrp fragment insert in pUHRX245 and a 39.3-kb insert in pUHRS138 revealed that a 3.3-kb SacⅠ fragment from pUHRX245 and a 4.5-kb BamHⅠ-KpnⅠ fragment from pUHRS138 were the minimal functional portions required for restoration of the ability of Xooc hrp- mutants to induce HR on tobacco and cause disease on rice. The disease symptom caused by the conjugant (M1005 plus 3.3-kb) on rice was similar to that caused by the wild type of Xooc. It suggests that the two fragments contain the same hrp gene(s) and are responsible reciprocally for HR induction on tobacco and pathogenicity on rice.     

拮抗细菌Bacillus subtilis A30对水稻病原菌的抑制作用

由杭州郊区水稻叶围分离得到ＢａｃｉｌｕｓｓｕｂｔｉｌｉｓＡ３０菌株，平板检测表明它对Ｘａｎ－ｔｈｏｍｏｎａｓｏｒｙｚａｅｐｖ．ｏｒｙｚａｅ、Ｒｈｉｚｏｃｔｏｎｉａｓｏｌａｎｉ、Ｆｕｓａｒｉｕｍｍｏｎｉｌｉｆｏｒｍｅ和Ｍａｇｎａｐｏｒｔｈｅｇｒｉｓｅａ等多种水稻病原真菌、病原细菌均有很好的拮抗作用．以水稻白叶枯病、水稻纹枯病为代表进行小区试验，结果表明，Ａ３０菌株的防病效果分别为５８．１％和３９．０％．Ａ３０菌株的培养去菌液经７０％饱和度（ＮＨ４）２ＳＯ４处理，拮抗物可被（ＮＨ４）２ＳＯ４沉淀，其拮抗粗提液经Ｄｉｏｌ１５０及ｐｒｏＲＰＣＨＲ５／１０等色谱柱分离得到两种对Ｘ．ｏｒｙｚａｅｐｖ．ｏｒｙｚａｅ的拮抗峰和两种对Ｒ．ｓｏｌａｎｉ的拮抗峰．     

烟草和水稻中水稻条斑病菌过敏反应激发子Ssb_x互作因子的鉴定

【目的】水稻条斑病菌(Xanthomonas oryzae pv.oryzicola)中单链DNA结合蛋白(single-stranded DNA-binding protein,SsbX)通过病原菌III型分泌系统(type-III secretion system,T3SS)分泌,在非寄主植物烟草上产生过敏反应(hypersensitive response,HR),研究旨在明确SsbX激发烟草产生HR的机理。【方法】将水稻条斑病菌RS105菌株注射水稻和烟草叶片,应用CreatorTM SMARTTM cDNA文库构建试剂盒构建水稻和烟草cDNA文库,借助pGADT-Sfi AB载体上特殊酶切位点SfiⅠ,酶切检测水稻和烟草cDNA文库质量;以SsbX为诱饵,通过酵母双杂交技术(Y2H)从水稻和烟草cDNA文库中筛选在SD/-Ade/-Leu/-Trp/-His培养基上能够生长的阳性克隆;并利用β-gal试验验证阳性克隆;序列测定后,使用MEGA 4序列分析软件,并利用邻位相连法(neighbor-joining,NJ)对筛选获得的互作因子进行同源序列和系统进化树分析;利用荧光双分子互补试验(BiFC)于488 nm处黄色激发光和520—550 nm透射光、20×物镜下,在激光共聚焦显微镜(Leica TCS SP5-II)观察SsbX与烟草和水稻中互作因子的互作位点。【结果】水稻和烟草cDNA文库构建和质量检测结果显示,随机挑选20个克隆中水稻来源的cDNA插入在pGADT-Sfi AB载体上,平均片段大小1.0kb;随机挑选20个克隆中烟草来源的cDNA均插入在pGADT-Sfi AB载体上,平均片段大小1.2 kb,说明水稻和烟草的cDNA文库构建质量较好;Y2H和β-gal试验结果显示,SsbX可与烟草和水稻的ADF2(actin-depolymerization factor 2)蛋白互作,使酵母AH109能够在SD/-Ade/-Leu/-Trp/-His平板上生长,并且β-gal染色显示为蓝色。水稻Os ADF2编码139氨基酸,蛋白质分子量为15.9 k D,而烟草Nb ADF2编码137氨基酸,蛋白质分子量为15.kD,两者同源性达69.02%。同源性以及系统进化树分析显示,植物中ADF2广泛存在,同源性高达60%以上。双子叶植物烟草和拟南芥的ADF2同源性最高,相似性达69.05%;单子叶禾本科植物水稻和狗尾草的ADF2同源性最高,相似性为88.81%。BiFC试验结果显示,在488 nm波长的激光共聚焦显微镜下,仅SsbX和Os ADF2以及SsbX和Nb ADF2共同存在时,可在烟草细胞膜上显示黄色荧光,与阳性对照显示黄色荧光一致,说明SsbX可与Os ADF2或Nb ADF2互作,互作位点发生在植物细胞膜上。【结论】通过T3SS分泌的水稻条斑病菌中的SsbX,在植物细胞膜上与ADF2互作,从而激发植物的免疫性。这为进一步揭示SsbX如何激发植物产生HR的机制提供了依据。     

水稻白叶枯病菌基因组简单重复序列分析

［目的］分析水稻白叶枯病菌基因组中的串联简单重复序列（simple sequence repeats,SSRs）,为其在白叶枯病菌基因组分析和遗传多样性研究提供标记信息。［方法］利用开放的基因组数据库资源,对已完成测序的3个白叶枯病菌菌株KACC10331、MAFF311018和PXO99^A进行系统的比较分析,包括基因组中SSR的结构类型、分布、丰度等;并以实例解读了在应用中可能遇到的问题。［结果］在这3个白叶枯病菌菌株的基因组中,由1～6个核苷酸为基序的SSR序列分别有940、926和1 035个;平均每隔5.26、5.34和5.06 kb的距离就有1个大于15 bp的SSR序列。在1～6个核苷酸为基序的SSR序列中,数量最多的是6碱基重复,其次分别是3、5、4、2碱基重复序列,而单碱基重复数目极少。在这3个菌株的基因组中,种类丰富、变异性高的是4、5、6个核苷酸的重复基序,但等位序列上3种菌株间的基序可能不同。［结论］3种白叶枯病菌菌株的SSR在结构类型和分布规律上均具有一定的相似性。     

蔬菜根际细菌R2–2的鉴定及其抑菌活性

从云南昆明市郊蔬菜根际分离细菌,经平板对峙培养筛选出1株抑菌能力较强的菌株R2-2,通过对其进行形态观察、Biolog微生物自动鉴定系鉴定和16S rDNA序列测定及其系统发育学分析,鉴定为甲基营养型芽孢杆菌(Bacillus methylotrophicus)。对R2-2与植物病原细菌(甘蓝黑腐病菌、魔芋细菌性软腐病菌、海棠斑点病菌、水稻白叶枯病菌、水稻细菌性条斑病菌)和病原真菌(疫霉菌、尖镰孢菌、茄镰孢菌、立枯丝核菌)进行对峙试验,结果显示,R2-2对水稻白叶枯病菌和水稻条斑病菌有较强的抑菌效果,抑菌圈直径分别达6.83 cm和7.03 cm。该菌株的16S rDNA序列已在GenBank中注册,登录号为JN648098。