番木瓜eIF4E家族蛋白的亚细胞定位

真核翻译起始因子eIF4E是多种病毒侵染植物的必须因子。笔者通过扩增番木瓜eIF4E家族基因Cp-eIF4E和Cp-e IFiso4E,分别构建他们与绿色荧光蛋白(GFP)融合的植物表达载体,转化烟草叶片的原生质体后研究了番木瓜eIF4E家族蛋白的亚细胞定位情况。结果表明,Cp-eIF4E和Cp-e IFiso4E在细胞质和细胞核中均有表达。本研究为进一步探讨番木瓜eIF4E家族蛋白与病毒的互作机制以及解析其在病毒侵染中的功能奠定了理论基础。     

番木瓜eIF4E和eIFiso4E酵母双杂交诱饵表达载体的构建及自激活检测

通过RT-PCR获得番木瓜eIF4E和eIFiso4E基因的编码区,将其分别克隆到pBD-GAL4载体中,构建酵母双杂交系统的诱饵载体pBD-GAL4-eIF4E,pBD-GAL4-eIFiso4E。测序正确后,将重组质粒导入YRG-2酵母菌株,检测其表达产物对酵母细胞有无毒性及对报告基因有无激活作用。结果表明,获得了正确的番木瓜eIF4E,eIFiso4E基因编码区,并成功克隆到pBD-GAL4诱饵载体中,且转化有诱饵载体的YRG-2在SD/-Trp营养缺陷平板上生长良好,在SD/-His-Trp营养缺陷平板上不能生长,说明表达产物对酵母细胞无毒性,对报告基因也无自激活作用,这为下一步利用酵母双杂交系统检测番木瓜eIF4E,eIFiso4E蛋白与病毒的相互作用奠定了基础。     

菊花翻译起始因子4E基因的克隆、 表达分析及其互作蛋白的筛选

【目的】为了研究翻译起始因子4E在菊花中的表达特性及功能,克隆菊花翻译起始因子4E（CmeIF4E）基因,分析其表达特性并初步筛选得到菊花CmeIF4E的互作蛋白。【方法】根据已报道植物的eIF4E序列设计引物,采用RT-PCR和RACE技术克隆菊花eIF4E基因,荧光定量PCR及亚细胞定位分析菊花CmeIF4E的表达特性,并用酵母双杂交系统筛选其互作蛋白。【结果】克隆获得菊花eIF4E基因全长914 bp,其开放阅读框（ORF）654 bp,编码1条包含218个氨基酸残基的多肽,将该基因名为CmeIF4E,GenBank登录号为JQ904591。氨基酸序列比对和系统进化分析表明,菊花CmeIF4E与已报道的莴苣的同源基因亲缘关系最近,该结果与植物分类学相符。荧光定量PCR分析结果显示,CmeIF4E基因在切花菊‘神马’各个器官中均有表达,幼嫩的根中表达量最高,其次是叶片,而茎中表达量最低。亚细胞定位分析发现,CmeIF4E在细胞的核、质、膜上都有表达。筛选得到菊花CmeIF4E互作蛋白,其中包括蛋白翻译和翻译后修饰、光合作用、抗逆和防御等相关蛋白。【结论】CmeIF4E在菊花组织中为组成型表达,亚细胞定位显示其在细胞核、细胞质、细胞膜上都有表达。候选蛋白分析验证了CmeIF4E在翻译起始中的作用,还推测其可能与光合系统、植物的抗逆防御相关,结果为进一步研究该蛋白在菊花中的作用提供了重要依据。     

翻译起始因子4E及其异构体与植物病毒感染的联系

近年来,对植物隐性基因抗病毒感染的研究取得了一些新的进展。从植物抗病毒与感病,eIF4E及其异构体对植物抗病毒感染作用的影响及机制,以及在此理论基础上设计抗病毒的新策略作一阐述。     

家蚕eIF2α全长cDNA克隆及生物信息学分析

【目的】克隆家蚕eIF2α全长cDNA,分析家蚕抗BmDNV-Z品系、感性品系eIF2α的点突变。【方法】利用荧光差异显示技术,在易感浓核病毒中国镇江株(BmDNV-Z)的家蚕品系华八中获得感性特异条带G13-1b650,通过电子延伸,设计特异引物验证。【结果】克隆了家蚕eIF2α（BmeIF2α）全长cDNA。其全长为1 100 bp（GenBank登录号：DQ073458）,ORF框为999 bp,编码332个氨基酸。BmeIF2α蛋白与草地贪夜蛾eIF2α蛋白同源性高达94.3%。具有保守的磷酸化位点S（51）R（52）R（52）R（54）R（56）K（60）R（63）。BmeIF2α有推定的3个蛋白激酶C磷酸化、5个酪氨酸激酶磷酸化、9个酪蛋白激酶Ⅱ磷酸化、3个依赖cAMP与cGMP蛋白激酶磷酸化位点,2个酪氨酸硫酸盐化位点,1个糖基化位点。【结论】家蚕易感品系的eIF2α在113～127位的"H V A E L L H Y E T S E Q S E"为酪氨酸硫酸盐化位点,而完全抗性品系eIF2α发生C378→T突变,导致Ser126→Leu,缺少了113～127位的酪氨酸硫酸盐化位点。     

番木瓜果实酵母双杂交文库的构建及CpMYB114L互作蛋白的筛选

【目的】从番木瓜4个不同成熟期果实的转录组中筛选并克隆得到1个转录因子CpMYB114L,构建番木瓜果实的cDNA文库,筛选与CpMYB114L互作的蛋白,探究CpMYB114L参与调控果实成熟的分子机理。【方法】以番木瓜‘GZBG’品种的果实为材料,设计特异引物,克隆CpMYB114L CDS区,利用生物信息学软件分析该基因序列及其编码的蛋白序列。提取番木瓜不同成熟期果实的总RNA,利用all-direct法建立酵母双杂交cDNA文库。构建pGBKT7-CpMYB114L诱饵载体,对其自激活检测后,通过共转化从文库中筛选CpMYB114L互作蛋白。通过在NCBI网站上进行序列比对,明确互作蛋白的功能分类,最后对各类蛋白基因在番木瓜不同成熟期果实中的表达进行分析。【结果】CpMYB114L基因的CDS序列编码227个氨基酸,预测其相对分子质量为26 304.3,理论等电点为6.23,亲水性总平均值为－0.893。CpMYB114L蛋白序列与甜樱桃（PaWERL）、蒺藜苜蓿（MtMYB1）、黧豆（MpMYB113）、大豆（GmMYB1）和苹果（MdMYB308L）的同源性较近。cDNA文库总库容为1.15×10⁷ CFU,重组率100%,插入片段长度为750~2 000 bp。诱饵载体pGBKT7-CpMYB114L不存在自激活。从酵母双杂交文库中筛选到30个初始阳性克隆,经回转验证后最终获得26个与CpMYB114L互作的蛋白,共分为4类,包括乙烯响应受体1（CpERS1）、酰基辅酶A硫酯酶13（CpAcots13）、热休克蛋白42（CpHSP42）和叶绿体转运子159（CpTOC159）。在果实成熟过程中,CpERS1和CpHSP42表达量先上升后下降,CpAcots13表达量持续上升,CpTOC159表达量剧增后趋于平稳。【结论】推测CpMYB114L与CpERS1蛋白互作参与番木瓜果实成熟的调控。     

鼠源eIF4A1基因克隆及其原核/真核表达鉴定

【目的】克隆昆明小鼠真核生物翻译起始因子4A1基因（eIF4A1）并构建其原核/真核表达载体,探究其结构和生物学特性,为在体内外鉴定e IF4A1互作蛋白网络打下基础。【方法】以昆明小鼠脑组织总RNA反转录合成的cDNA为模板,PCR扩增鼠源e IF4A1基因编码区（CDS）序列,然后克隆到pGEX-4T-1和pcDNA3.0载体上分别构建原核/真核表达载体;利用大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞对原核表达载体进行诱导表达、纯化及鉴定;同时以真核表达载体转染HEK-293T细胞,通过Western blotting和间接免疫荧光（IFA）检测eIF4A1蛋白在HEK-293T细胞内的表达及分布情况;并以ProtParam、ProtScale、TMHMM-2.0、SignalP-5.0、SOPMA和SWISS-MODEL等在线软件对鼠源eIF4A1蛋白进行生物学信息分析。【结果】鼠源eIF4A1基因CDS序列长1221 bp,克隆到pGEX-4T-1载体能成功构建原核表达载体pGEX-4T-eIF4A1-Flag,在25和30℃下经0.5 mmol/L IPTG诱导均能大量表达出融合蛋...     

侵染豌豆和蚕豆的蚕豆萎蔫病毒研究

从浙江省豌豆和蚕豆病株上获得两个病毒分离物，编号为Ｐ－９３５和Ｂ－９３４．人工摩擦接种６科１９种植物，Ｐ－９３５能侵染４科１３种植物，Ｂ－９３４能侵染４科１４种植物，除菜豆外，它们在这些植物上的症状十分相似。Ｐ－９３５和Ｂ－９３４的钝化温度为５０－５５℃，稀释限点为１０￣（－３）－１０￣（－４），体外保毒期分别为５天和４天。两个分离物均能由桃蚜以非持久性方式传毒，用昆诺藜作繁殖寄主均提取到了大量病毒粒子，提纯病毒粒子球形，平均直径２５ｎｍ。病毒外壳蛋白均由两种亚基组成，分子量分别为４２．５ｋＤ和２１．２ｋＤ，感病叶片组织中观察到了无定形的泡状内含体，在琼脂双扩散试验中，Ｐ－９３５和Ｂ－９３４均能与蚕豆萎蔫病毒（ＢＢＷＶ）抗血清（血清型Ⅱ）形成清晰沉淀线。根据以上特性，Ｐ－９３５和Ｂ－９３４均被鉴定为蚕豆萎蔫病毒，且都属血清型Ⅱ．初步调查表明杭州郊区豌豆病毒病均由ＢＢＷＶ引起，蚕豆病毒病主要有ＢＢＷＶ和黄瓜花叶病毒（ＣＭＶ）。     

动脉炎病毒PRRSV和EAV的Nsp4蛋白对mTANK蛋白的降解

为研究猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)和马动脉炎病毒(EAV)等动脉炎病毒的Nsp4蛋白在病毒免疫逃逸中的作用,通过免疫沉淀和质谱技术筛选到与Nsp4互作的宿主蛋白mTANK.将pCAGGS-PRRSV-Nsp4-Flag、pCAGGS-EAV-Nsp4-Flag质粒分别与pCAGGS-mTANK-HA质粒共转染HEK293T细胞,发现Nsp4可特异性降解mTANK.为了进一步揭示其中的机制,利用蛋白酶体抑制剂MG-132、凋亡途径抑制剂Z-VAD-FMK、溶酶体抑制剂NH₄Cl和自噬抑制剂3-MA分别处理共转染的细胞,发现这些抑制剂处理并不影响Nsp4对mTANK的降解作用,随后构建了PRRSV Nsp4(E39、E64、E118)和EAV Nsp4(E39、E65、E120)的酶活性突变体质粒.将突变体质粒分别与pCAGGS-mTANK-HA质粒共转染后发现,Nsp4蛋白酶活性缺失后无法降解mTANK.进一步研究发现,mTANK降解产生的片段分别位于30和25～30 ku附近.综上,PRRSV和EAV的Nsp4蛋白可通过其3C样蛋白酶活性特异性切割宿主蛋白...     

翻译起始因子4E在植物病毒侵染中的作用

在自然演化发展的过程中，植物进化产生了一系列抗外界微生物侵染的能力，其中包括抵抗依靠植物的生物合成及能量的病毒。植物突变产生的隐性抗性基因可以表达破坏或限制病毒的侵染所必须的翻译起始因子4E，从而达到抑制病毒在体内增殖的效果。综述了翻译起始因子4E在植物病毒侵染过程中的作用。     

利用反向遗传技术对H_3N_2亚型流感病毒NA基因突变的研究

为了拯救出H3N2亚型流感病毒的重组新病毒,利用反向遗传学手段,8个质粒共同转染293T细胞,包装带有双点突变（第119位氨基酸由E突变为V,第222位氨基酸由I突变成L）、单点突变和野生型的流感病毒H3N2;在MDCK细胞中传代包装成的H3N2病毒。结果表明,野生流感病毒H3N2和其突变株包装成功,第119位氨基酸单点突变型滴度与野生型的相近,而第222位氨基酸单点突变和双突变型滴度要比野生型的低。本实验成功证明了H3N2神经氨酸酶上两个位点（第119和222位氨基酸）对病毒包装及复制起到关键的作用,且NA上第222位氨基酸相对于第119位氨基酸显得要更重要。     

浙江省38种园林绿化植物对氟化氢气体的抗性及吸收能力

为充分发挥城市绿地吸收有害气体的生态功能,采用人工熏气法,对浙江省38种园林绿化植物对氟化氢气体的抗性及吸收能力进行了研究．通过系统聚类分析方法,将参试植物的抗性及吸收能力划分为弱、较弱、中等、较强和强等5个等级。结果显示,38种植物对氟化氢的抗性差异较大,抗性最强的熏气持续时间为9h（麦冬Ophiopogon japonicus）,抗性最弱的仅2h（枫香Liquidambar formosana等）;参试的落叶植物中弱和较弱抗性物种占87．50％,而常绿植物在弱至较强各等级的分布较均匀,表现出比落叶植物的抗性更强。植物对氟化氢气体的吸收能力差异非常显著,部分植物具有十分惊人的吸收能力。大叶榉Zelkova serrata的绝对吸收能力最强,达13．66g·kg^-1,是最小吸收能力植物湿地松（Pinus elliottii,117．06mg·kg^-1）的116．65倍;落叶植物中吸收能力中等的所占比例最大,为37．5％。常绿植物则由弱到强吸收能力等级呈现出逐渐递减趋势。试验各植物对氟化氢抗性与吸收能力线性相关不显著。     

转基因甘蔗抗黑穗病鉴定研究

用分离得到的甘蔗黑穗病病菌单孢子菌丝体对5个甘蔗转基因株系进行体外抑菌作用鉴定,结果显示,5个转基因株系对甘蔗黑穗病均有不同程度的抗性表现;通过人工接种方法对转基因植株（T1）进行了甘蔗黑穗病病菌的田间接种实验,利用病害流行指标LP、SDD、IPmax、Ymax、AUDPC对其后代（他）进行抗病性鉴定,结果表明,SCG1和SCG2两个株系表现为抗病（R）,而SCG3、SCG4和SCG5三个株系表现为中抗（Ⅰ）;并结合RT-PCR技术鉴定目的基因在转基因甘蔗无性系后代（T2）中的表达,结果显示两个目的基因在转基因甘蔗无性系12中均有表达,此结果与其抗病表现一致。     

养殖场分离的耐氟喹诺酮类药物的大肠杆菌基因突变研究

【目的】探讨从养殖场动物、环境和饲养员分离的大肠杆菌的gyrA 和parC 基因突变特征。【方法】用琼脂稀释法测定环丙沙星和恩诺沙星对菌株的最小抑菌浓度。PCR扩增gyrA 和parC 基因的喹诺酮耐药决定区，扩增的片段长度分别为525 bp和487 bp，PCR产物直接测序。【结果】在63株突变株中，在GyrA 亚基发生的氨基酸替代有Ser83→Leu（62株）和Asp87→Asn（52株）、Asp87→Tyr（2株）、Asp87→His（2株）；ParC 亚基的氨基酸替代有Ser80→Ile（47株）、Ser80→Arg（2株）和Glu84→Val（3株）、Glu84→Lys（4株）、Glu84→Gly（5株）、Glu84→Ala（1株）。环丙沙星对菌株的MIC小于0.125μg·ml-1时，GyrA和ParC亚基均没有任何变异；环丙沙星的MIC为0.125～0.25 μg·ml-1时，GyrA亚基出现单一氨基酸替代；环丙沙星的MIC为0.5～32μg·ml-1时，出现GyrA 83位和87位双替代或者GyrA83和ParC80位双替代；环丙沙星的MIC为4～128μg·ml-1，发生GyrA 双替代和ParC单替代；环丙沙星的MIC在16～128μg·ml-1，发生GyrA双替代和ParC 双替代。【结论】不同来源的耐氟喹诺酮类药物的大肠杆菌GyrA和ParC具有多种氨基酸替代类型，而且GyrA和ParC突变位点的数量与菌株对氟喹诺酮类耐药水平呈正相关。     

5个品种白羽肉鸡大肠杆菌耐药差异分析

【目的】通过开展5个品种白羽肉鸡养殖过程中大肠杆菌流行病学研究及耐药性差异情况调查,了解不同品种肉鸡大肠杆菌耐药现状及其差异,为科学指导肉鸡相关疾病诊治和兽药监管提供参考依据。【方法】选用5个品种白羽肉鸡（2个为江苏养殖量较大的国外引进品种,3个为我国自主选育配套系）为研究对象,分别采集0日龄胎粪样品及4、8、12、16、20、24、28、32、36和40日龄的泄殖腔棉拭子,经麦康凯培养基分离大肠杆菌后进行PCR鉴定,并采用Kirby-Bauer(K-B)法进行药敏试验。【结果】从1075份样品中共分离获得978株大肠杆菌,总分离率为91.0%。其中,广明2号（A品种）和圣泽901(C品种)的大肠杆菌分离率最高,均为93.0%;WOD168(E品种)的分离率最低,为88.4%。5个品种白羽肉鸡的胎粪样品分离率、2个重复的分离率、5个品种白羽肉鸡大肠杆菌总分离率及不同日龄的分离率均无显著差异（P>0.05）。5个品种白羽肉鸡大肠杆菌对氨苄西林（AMP）、阿莫西林（AML）、红霉素（E）、四环素（TE）和氯霉素（C）已产生较强的耐药性,对阿米卡星（AK）、磷霉素（FOS）、阿奇霉素（...     

密度对北疆复播大豆生长动态及产量的影响研究

在滴灌条件下,通过设置37.5万株/hm2（A处理）、45.0万株/hm2（B处理）、52.5万株/hm2（C处理）、60.0万株/hm2（D处理）、67.5万株/hm2（E处理）5种不同种植密度,研究不同密度条件下北疆复播大豆株高、茎粗、叶面积指数（LAD、干物质积累的动态变化、产量及产量构成因素.结果表明,随着密度的增加,株高增高、茎粗变细,二者呈显著的负相关关系,相关系数达-0.8928;叶面积指数随着密度的增加而增大,单株干物质重则随着密度的增加而降低;产量随着密度的增加呈现开口向下的抛物线,以52.5万株/hm2的C处理产量最高,为3 205.04 kg/hm2,分别较A处理、B处理、D处理、E处理的分别高出14.26％,4.09％,1.42％,5.88％,均达到了极显著差异水平（P＜0.01）.北疆复播大豆的密度控制在52.5万～60.0万株/hm2可获得高产.     

褐色橘蚜在健康与CTV植株上的EPG比较

利用刺探电位图谱（EPG）技术对褐色橘蚜Toxopter acitricida （Kirkaldy）在健康与感染CTV的植株上的取食行为进行了比较研究.结果显示,褐色橘蚜在二者上均产生8种取食波形,分别为非刺探波（np波）、路径波（A波、B波、C波）、Pd波、韧皮部分泌唾液波（E1波）、韧皮部被动吸食波（E2波）以及木质部主动吸食波（G波）.刺探过程中,二者非刺探总时间（np波）存在差异;褐色橘蚜在健康植株上的刺探次数最多且C波的总持续时间最长,与感病植株差异显著.感病植株上,E1波的次数和持续时间均显著多于健康植株.褐色橘蚜在感病植株上E2波的总持续时间为（241.33±24.12 min）,显著长于在健康植株上（160.30 ±24.63 min）的持续时间.由此可初步推断,感染CTV的植株在一定程度上会增加褐色橘蚜获毒与传毒的几率.