聚合酶链反应,病毒分离和血凝试验检测犬粪样中细小病…

对聚合酶链反应（ＰＣＲ）特异性扩增犬细小病毒（ＣＰＶ）衣壳基因的诊断方法与用Ｇｒａｎｄｅｌｌ猫肾细胞（ＣＲＦＫ）或Ｍａｄｉｎ－Ｄａｒｂｙ犬肾细胞（ＭＤＣＫ）分离病毒和能被ＣＰＶ特异性抗血清抑制的粪便血凝（ＨＡ）试验进行了比较；ＰＣＲ检测的５９例粪样中有１例假阴性（１．７％）。它与用ＭＤＣＫ细胞分离病毒同样敏感，而比用ＣＲＦＫ细胞分离病毒或ＨＡ试验更敏感。这些结果表明，ＰＣＲ可作为粪样ＣＰＶ检测的常     

犬瘟热,猫细小病毒,犬腺病毒弱毒株的理化特性及生物学试验

以鸡胚成纤维细胞（ＣＥＦ）、猫肾传代细胞（ＣＲＦＫ）、狗肾传代细胞（ＭＤＣＫ）从引进的疫苗中分别分离到犬瘟热ＣＤＶ－Ａ株、猫细小病毒ＦＰＶ株、犬腺病毒ＣＡＶ１株。对三个弱毒株的细胞病变规律,形态特征,病毒滴度,理化特性,核酸型,血清学交叉反应,本动物的安全性及免疫原性等内容进行了试验。鉴定结果表明,３个弱毒株均可作为制苗用毒种     

犬瘟热,细小病毒,腺病毒三联弱毒疫苗的研究

以犬瘟热（ＣＤＶＡ）、猫细小病毒（ＦＰＶ）、犬腺病毒（ＣＡＶ１）三个弱毒株为毒种,用ＳＰＦ鸡胚成纤维细胞、ＣＲＦＫ细胞、ＭＤＣＫ细胞分别增毒制苗,按一定比例与冻干保护剂混合,经冻干工艺精制成冻干三联弱毒疫苗。试验对制苗工艺参数、半成品与成品的检验、疫苗的安全性与免疫原性、疫苗的临床应用等内容进行了研究。结果显示：三联苗对犬、貉、狐等动物预防三种病毒性传染病效果显著。     

PCR法检测血清I型马立克氏病病毒及其敏感性试验的研究

以人工合成的针对血清Ｉ号马立克氏病病毒（ＭＤＶ１）Ａ抗原基因（ｇＡ）部分序列的两端寡聚核苷酸为聚合酶链反应（ＰＣＲ）的引物，分别对马立克氏病病毒血清Ｉ型（京－１株，ＭＤ１１／７５Ｃ株）；２型（ＳＢ－１株）；３型（火鸡疱疹病毒的ＦＣ１２６株）毒株和ＧＡ株ＢａｍＨＩ Ｂ片段的ＰＡＣＹ１８４克隆重组质粒ＤＮＡ进行基因扩增反应及其敏感性试验。结果表明，该引物不仅对ＭＤＶ１具有较强的特异性，而且由此引物引导     

猪生殖-呼吸道综合征国内分离毒株的病毒纯化及其结构蛋白分析

本研究主要对猪生殖呼吸道综合征（ Ｐ Ｒ Ｒ Ｓ） 国内分离毒株（ Ｃ Ｈ Ｉａ） 进行了病毒纯化及其结构蛋白的分析。选用聚乙二醇（ Ｐ Ｅ Ｇ６０００） 沉淀和差速离心法粗提了经 Ｍａｒｃ１４５ 细胞系增殖的猪生殖呼吸道综合征病毒（ Ｐ Ｒ Ｒ Ｓ Ｖ） 。并采用非线性蔗糖密度梯度离心法纯化了 Ｐ Ｒ Ｒ Ｓ Ｖ, 经免疫电镜观察纯化病毒, 发现有较多的胶体金颗粒吸附在直径为４２ ～７８ｎｍ 的病毒粒子周围。经 Ｄｏｔ Ｅ Ｌ Ｉ Ｓ Ａ 测定纯化病毒的滴度可达１ １６００ 以上, 并利用 Ｓ Ｄ Ｓ Ｐ Ａ Ｇ Ｅ 和 Ｗｅｓｔｅｒｎｂｌｏｔ 两种方法对国内分离毒株（ Ｃ Ｈ Ｉａ） 与欧洲型（ Ｌｅｌｙｓｔａｄ） 、美洲型（ Ｖ Ｒ２３３２） 等参考毒株的病毒结构蛋白组成和部分抗原特性进行了初步的研究。测得国内分离毒株主要结构蛋白的分子量为１４５ Ｋ Ｄ,１９２ Ｋ Ｄ 和２６３ Ｋ Ｄ, 并均能被 Ｐ Ｒ Ｒ Ｓ Ｖ 的高免血清识别, 这与国外的同类报道很相似。     

分泌抗禽呼肠孤病毒单克隆抗体杂交瘤细胞株的建立与鉴定

采用腹腔的接种１次脾内注射禽呼肠孤病毒（ＡＲＶ）蛋白免疫小鼠，经３次融合后，共筛选８株分泌抗禽呼肠孤病毒（单克隆抗体杂交瘤细胞株，这８株ＭｃＡｂ均可与ＡＲＶＳ１１３３株，ＦＤＯ株发生反应，而与ＩＢＤＶ，ＭＤＶ，ＥＤＳ－７６病毒不发生反应，经亚类鉴定，ＡＥ７，ＡＦ８，ＢＤ１，ＤＨ１０，ＥＥ５为ＩｇＧ１；ＡＤ６，ＣＧ４为ＩｇＣ２ａ，ＡＧ７为ＩｇＧ２ｂ。腹水效价在１０＾３～１０＾５之间。     

狐狸脑炎病毒的分离鉴定

通过ＭＤＣＫ传细胞从黑龙江某狐场疑似狐狸脑炎病狐的肝脏中分离到对本动物具有较强致病能力的强毒株,定名为ＦＥＶ－Ｈ。经系统鉴定,并与已知国内分离毒株狐狸脑炎病毒ＦＥＶ－８８０１,狐喉气管炎病毒ＦＡＶ－２比较,证实为狐狸脑炎病毒,属犬１型腺病毒（ＣＡＶ－１）。     

用RT—PCR检测犬外周血液单核细胞中犬瘟热病毒核衣壳蛋…

为了迅捷地诊断犬瘟热病毒（ＣＤＶ）感染，本研究采用及转录－聚合酶链反应（ＲＴ－ＰＣＲ）技术，检测犬外周血液核细胞（ＰＢＭＣ）中ＣＤＶ核衣壳蛋白（ＮＰ）基因。以两套引物针对ＣＤＶＯｎｄｅｒｓｔｅｐｏｏｒｔ毒株ＮＰ基因的两个片段。应用ＲＴ－ＰＣＲ〉以６株ＣＤＶ毒株感染Ｖｅｒｏ细胞，用ＣＤＶ人工感犬染的的ＰＢＭＣ，在这两处细胞的提的ＲＮＡ中，手增ＮＰ基因片段，取得了较好的结果。在３２例临床疑为ＣＤＶ感染     

狂犬病 犬肠炎 犬瘟热 犬腺病毒病犬副流感五联弱毒冻干疫苗的研究

从国外引进的犬瘟热病毒（ＣＤＶ）、犬细小病毒（ＣＰＶ）、犬腺病毒－２型（ＣＡＶ２）和犬副流感病毒病毒（ＣＰＩＶ）四联弱毒样品中，分离筛选出增殖性良好的ＣＰＶ０ＸＮ１，ＣＡＶ２－ＸＮ３和ＣＰＩＶ－ＸＮ４株。另外还通过离体异种细胞交叉传代，获得的ＣＤＶ－ＸＮ１１１２弱毒株；从狂犬病毒株疫苗样品中筛选出ＥＲＡ８３６株。经试验证明这５株病毒在５代以内可作为制苗用种毒。采用静置和旋转培养法高滴度扩增这５株弱     

微量PCR检测鸡马立克氏病病毒早期感染

为了建立一种监测鸡群马立克氏病病毒（ＭＤＶ）早期感染的微量ＰＣＲ方法,根据血清Ⅰ型马立克氏病病毒（ＭＤＶ１）基因组ＢａｍＨＩ－Ｌ片段的核酸序列设计了１对寡核苷酸引物,用含０．３ＵＴａｑ酶的１０μＬ反应体系分别扩增了ＭＤＶ１型（京－１株、ＭＤ１１／７５ｃ株）、ＭＤＶ２型（ＳＢ－１株）和ＨＶＴ（ＦＣ－１２６株）的核酸,并用京－１株感染细胞ＤＮＡ作了敏感性试验。结果显示,该引物对ＭＤＶ１型病毒特异,京－１株和ＭＤ１１／７５ｃ株都扩增到４２５ｂｐ的核酸条带,而ＳＢ－１株、ＦＣ－１２６株和正常ＣＥＦ细胞的ＤＮＡ都没有得到任何条带;敏感性试验结果表明,微量ＰＣＲ能够检测到０．１ｐｇ的京－１株感染细胞ＤＮＡ;对京－１株感染鸡,在接种后第５天就能在血液细胞中检测到ＭＤＶＤＮＡ。微量ＰＣＲ可望成为监测鸡群ＭＤＶ早期感染的一种快速、有效的方法。     

应用反转录多聚酶链反应（RT－PCR）对鸡传染性法氏囊病毒的基因检测研究

参考Ｃｕｌ株核酸序列自行设计一对２０ｂｐ序列为引物，经反转录和ＰＣＲ扩增传染性法氏囊病毒（ＩＢＤＶ）核酸高度保守的Ｖｐ４编码区中１５０ｂｐ的片段，用于检测ＩＢＤＶ。对德国Ｃｕｌ株、美国标准强毒ＳＴＣ和变异株１０８４Ｅ、中国ｑ８０１以及７个国内野外分离株分别进行扩增，同时对新城疫病毒（ＮＤＶ）、马立克氏病毒（ＭＤＶ）、禽呼肠孤病毒（ＲＥＯＶ）、禽腺病毒（ＨＡＡ）、Ｖｅｒｏ细胞、ＳＰＦ鸡法氏囊组织进行扩增后，２％琼脂糖凝胶电泳分析，１１株ＩＢＤＶ都出现分子量大小与设计相符合的ＤＮＡ扩增带，４种其他病毒、囊组织和Ｖｅｒｏ细胞都未出现任何扩增带。建立了直接采用细胞毒或组织毒进行ＰＣＲ的快速简便的核酸提取方法，应用二级ＰＣＲ扩增出了与一级ＰＣＲ相符的更加清晰的扩增带。     

不同细胞培养基细胞培养动力学比较试验

应用宜兴赛尔生物化工厂产１９９、Ｆ－１０、１６４０和ＤＭＥＭ细胞培养基与美国Ｓｉｇｍａ公司产１９９、Ｆ－１０、１６４０和ＤＭＥＭ细胞培养基分别配制细胞培养液，培养ＳＰ２／０和Ｖｅｒｏ细胞系及原代鸡胚成纤维细胞（ＣＥＦ），做细胞培养动力学比较试验。比较这两种来源的细胞培养基对细胞生长的形态、分裂速度及鸡马立克氏病毒（Ｍａｒｅｋ＇ｓｄｉｓｅａｓｅｖｉｒｕｓ．ＭＤＶ）疫苗毒株ＨＶＴ－ＦＣ１２６和ＲｉｓｐｅｎｓＣＶＩ９８８在ＣＥＦ单层上增殖量的差异。研究结果表明，四种国产细胞培养基与对应的四种进口培养基对细胞生长及病毒增殖的影响无显著差异     

鸡传染性法氏囊病病毒野毒株VP2基因高可变区酶切位点分析

参照澳大利亚鸡传染性法氏囊病病毒（ Ｉ Ｂ Ｄ Ｖ）００２７３ 毒株基因组序列设计的 １ 对引物,位于 Ｖ Ｐ２ 高可变区两端,通过 Ｒ Ｔ Ｐ Ｃ Ｒ,扩增了 ５ 个 Ｉ Ｂ Ｄ Ｖ 山东分离株 Ｖ Ｐ２ 基因的 ６０７～１ ０８０ 位核苷酸片段（ａａ２０３～３０６）。 Ｐ Ｃ Ｒ 产物经纯化后,分别用 Ｄｒａ Ⅰ、 Ｓａｃ Ⅰ、 Ｓｓｐ Ⅰ、 Ｐｓｔ Ⅰ和 Ｓａｕ３ Ａ Ｉ共 ５ 种限制性内切酶（ Ｒ Ｅ）进行消化处理,结果 ５ 个分离株均为 Ｄｒａ Ⅰ（－ ）、 Ｓａｃ Ⅰ（－ ）和 Ｓａｕ ３ Ａ Ｉ（＋ ）, Ｌ Ｃ２ 和 Ｔ Ａ 株为 Ｓｓｐ Ⅰ（＋ ）, Ｌ Ｃ１ 和 Ｊ Ｎ 株为 Ｓｓｐ Ⅰ（－ ）, Ｌ Ｃ１ 和 Ｌ Ｃ２ 株为 Ｐｓｔ Ⅰ（＋ ）, Ｊ Ｎ、 Ｌ Ｌ 和 Ｔ Ａ 株为 Ｐｓｔ Ⅰ（－ ）;５ 个分离株的酶切图谱与美国变异株迥异,而 Ｔ Ａ 株与日本超强毒株 ９０１１ 相类似。５ 个分离株与现用疫苗株对比,至少在 Ｖ Ｐ２ 可变区内存在着一定的差异,这可能是 Ｉ Ｂ Ｄ Ｖ 接种免疫鸡群仍然暴发 Ｉ Ｂ Ｄ 的原因之一。     

鸡马立克氏病活疫苗免疫效力比较试验

用ＨＶＴ冻干苗、ＨＶＴ细胞结合苗、ＣＶＩ９８８细胞结合苗、ＳＢ１＋ＦＣ１２６双价活疫苗、３０１Ｂ／１＋ＦＣ１２６双价活疫苗和Ｚ４＋ＦＣ１２６双价活疫苗等６种鸡马立克氏病（ＭＤ）疫苗免疫ＳＰＦ白来航鸡或普通伊莎鸡，用鸡马立克氏病病毒（ＭＤＶ）强毒ＧＡ株、京－１血毒以及鸡马立克氏病超强毒ｖｖＭＤＶ－Ｍｄ５毒株分别攻击进行免疫效力比较试验。试验表明，ＭＤ单价苗的免疫效力强弱顺序依次是ＣＶＩ９８８、ＨＶＴ细胞结合苗和ＨＶＴ冻干苗，这３种ＭＤ单价苗均能给免疫鸡群提供有效的免疫保护力。ＳＢ１＋ＦＣ１２６、Ｚ４＋ＦＣ１２６和３０１Ｂ／１＋ＦＣ１２６等３种ＭＤ双价苗免疫效力显著高于ＭＤ单价苗，均能给免疫鸡群提供较强的免疫保护力，并能有效地抵抗ｖｖＭＤＶ－Ｍｄ５毒株的致瘤作用。Ｚ４＋ＦＣ１２６和３０１Ｂ／１＋ＦＣ１２６ＭＤ双价苗免疫效力无显著差异     

犬瘟热疫苗弱毒的复壮与免疫试验

将一株犬瘟热疫苗株病毒通过Ｖｅｒｏ细胞２０代（ＣＤＶ／Ｒ－２０）后又通过敏感犬的腹腔巨噬细胞，获得一株免疫原性更高的弱毒株（ＣＤＶ／Ｒ－２０／８）。接种同样剂量１０４ＴＣＩＤ５０的ＣＤＶ／Ｒ－２０／８和ＣＤＶ／Ｒ－２０的犬，产生出血清中和（ＳＮ）抗体价的几何平均数分别为１：５４和１：２６。前者为后者的２倍多。接种１０５ＴＣＩＤ５０的ＣＤＶ／Ｒ－２０／８能完全保护犬（１０／１０）抵抗ＣＤＶ强毒的攻击，接种１０４ＴＣＩＤ５０的保护９／１０犬，而对照犬５只全部发病，其中４只死亡。犬体内ＳＮ价可持续一年之久。冻干培养物在４和－３０℃中可分别保存９个月和１２个月而效力不减。     

多聚酶链反应区分血清Ⅰ型MDV强弱毒株

选用血清Ⅰ型马立克氏病病毒（ＭＤＶ＿１）基因组中位于１３２ｂｐ正向重复序列两侧的２段寡聚核苷酸为多聚酶链反应（ＰＣＲ）的引物，分别对Ⅰ型ＭＤＶ强毒株（京－１株）和弱毒株（Ｍｄ１１／７５Ｃ株）的核酸进行基因扩增。结果显示：该弱毒株核酸基因中含６个或更多个拷贝数的１３２ｂｐ正向重复序列，而强毒株核酸基因中仅含２个，相同引物对Ⅱ型、Ⅲ型ＭＤＶ（ＳＢ－１株，Ｆｃ１２６株）和禽网状内皮组织增生病病毒（ＲＥＶ）核酸作ＰＣＲ扩增，未检出任何核酸片段。     

双癸甲溴铵洗消剂对常见病毒消毒试验观察

１　材料与方法１１　动物　３～４日龄ＳｐｒａｇｕｅＤａｗｌｅｙ乳鼠,公母各半。１２　双链季铵盐洗消剂　由徐州法尔达日用化工公司赠送,有效成分双癸甲溴铵含量为１０％。１３　ＨＢｓＡｇＫｉｔ　用于常规ＥＩＡ检测ＨＢｓＡｇ,从上海科华生物技术公司购买。１４　病毒　口蹄疫０型乳鼠组织毒（ＦＭＤＶ）,滴度为１０－７ＬＤ５０／ｍｌ;猪水泡病乳鼠组织毒（ＳＶＤＶ）,滴度为１０－８ＬＤ５０／ｍｌ;鸡新城疫Ⅰ系病毒（ＮＣＶⅠ）,ＥＩＤ５０＞１０８３／ｍｌ。上述病毒均由南京农业大学提供。１５　中和剂…     

不同细胞系上牛病毒性腹泻病毒受体的鉴定

抗独特型抗体（ａ－ｉｄｓ）已被成功用于鉴定不同细胞系上牛病毒性腹泻病毒受体，ａ－ｉｄｓ能特异结合培养细胞并鉴定出一种分子量为５０ｋＤａ的细胞膜蛋白，这可能就是ＢＶＤＶ的特异受体，在本实验中，流式细胞术中分析表明ａ－ｉｄｓ能特异地与ＭＤＢＫ，ＥＢＫ，ＢＴ，ＲＫ１５，ＭＡ１０４和Ｖｅｒｏ等不同的细胞结合。病毒吸附和复制试验表明，除猴肾细胞ＭＡ１０４和Ｖｅｒｏ外，ＢＶＤＶ都能吸会并复制，噬斑减少试验结果     

检测犬冠状病毒中和抗体的方法与应用

在２４孔组织培养板上应用从美国引进的犬冠状病毒（ＣＣＶ）参考株ＮＬ１８与猫肾传代细胞（ＣＲＦＫ）,采用固定病毒（１００ＴＣＩＤ５０）稀释血清法建立了ＣＣＶ中和试验。运用该方法测定了１４２条群养犬和３５条散养犬的中和抗体水平,以１∶４作为阳性血清的判定标准,群养犬与散养犬的血清阳性率分别为１００％和８２９％;测定了母犬的血清与乳汁、所产仔犬及仔犬脐带血的ＣＣＶ抗体效价,证实母犬可以通过胎盘及乳汁将抗体转移给仔犬,吮食乳汁是仔犬获得母源抗体的主要途径。本试验从抗体水平上证实我国的犬已发生ＣＣＶ感染。     

禽传染性支气管炎病毒免疫原基因组的RT－PCR研究

本文报道了用聚合酶链反应（ＰＣＲ）获取ＩＢｖＭ＿（４１）株和广东肾变株Ｄ＿（４１）免疫原（Ｓｌ）基因的研究情况，所用引物为ＩＢＶＢｅａｕｄｅｔｔｅ株Ｓ１基因两侧的对应序列，跨幅为１．７ｋｂ；ＤＮＡ模板为ＩＢＶＭ＿（４１）和Ｄ＿（４１）株经病毒ＲＮＡ提取后反转录而得；结果表明，２株病毒所获的ＰＣＲ产物与预期一致。