蕺菜ISSR-PCR反应体系的建立及条件优化

[目的]针对蕺莱ISSR的反应特点,建立稳定可靠的ISSR分子指纹标记反应体系,为进一步研究蕺菜的居群遗传多样性奠定基础。[方法]通过筛选引物并设定影响蕺菜ISSR反应各因素的浓度,检测ISSR不同反应体系的扩增效果;通过分析非特异性条带的产生原因并进行条件优化,建立蕺菜ISSR稳定可靠的反应体系。[结果]建立了可用于蕺菜ISSR—PCR分析的最适宜反应体系。砌酶质量、退火温度、Mg^2＋浓度、dNTP浓度均对ISSR反应结果具有较大影响。[结论]建立的蕺菜ISSR反应体系具有省时、经济、简便、扩增条带清晰而稳定以及重复性好等特点,可以较好地应用于蕺菜的居群鉴别及居群分子生态的研究。     

半夏ISSR-PCR反应体系的建立及条件优化研究

建立并优化了半夏ISSR-PCR反应体系,为应用该技术进行半夏遗传多样性研究、种质资源鉴定、亲缘关系分析等提供试验依据。利用正交试验设计,从Mg2 、dNTP、引物和DNA聚合酶4种因素3个水平,筛选并建立半夏的ISSR-PCR反应最佳体系,并比较不同浓度甲酰胺、甘油和模板DNA的浓度对PCR扩增的影响。经过梯度PCR,确定适宜的退火温度。研究结果表明,利用正交试验可以快速建立ISSR-PCR反应体系,经过24份半夏种质检验证明该体系稳定可靠,可以用于半夏遗传分析。     

桑树ISSR-PCR反应体系建立及优化

采用正交试验设计L₁₆(4⁵)对桑树ISSR-PCR反应体系中的模板DNA、引物、Mg²⁺、dNTPs和rTaq酶5个因素及反应程序中变性时间、退火时间、延伸时间和循环数进行优化分析。结果表明,各因素水平变化对反应体系的影响大小依次为DNA模板>rTaq酶>Mg²⁺>引物>dNTPs。最终确立了最佳反应体系,即在10μL反应体系中,含25 ng/μL DNA模板1μL、10×PCR buffer 1μL、20μmol/L引物0.2μL、2.5 mmol/L Mg²⁺ 0.8μL、2.5 mmol/L dNTPs 1μL、5 U/μL rTaq 0.1μL。优化得到的反应程序为94℃预变性5 min;94℃变性40 s,合适的退火温度退火45 s,72℃延伸90 s,40个循环;72℃延伸10 min,16℃保存。通过梯度PCR,确定引物ID37的退火温度为49.5℃。稳定性检测表明该体系能用于桑树ISSR分析。     

适用于川芎的ISSR-PCR反应体系的建立及优化

[目的]建立和优化适合川芎的ISSR-PCR反应体系。[方法]以川芎叶片为材料,利用改良CTAB法提取了叶片基因组DNA,利用单因素试验分析了DNA模板、Mg2＋、dNTP、引物和TaqDNA聚合酶的浓度对ISSR-PCR反应的影响,对适合川芎的ISSR-PCR反应条件进行了优化。[结果]适合川芎的ISSR-PCR反应体系为25.0μl,其中含2.5μl 10×TaqDNA聚合酶缓冲液、2.1 mmol/LMgC l2、300μmol/L dNTP、0.4μmol/L引物、1.0 UTaqDNA聚合酶和20～40 ng模板DNA。[结论]为进一步对全国17个不同分布区的川芎资源进行遗传多样性研究奠定了基础。     

木槿ISSR-PCR反应体系的建立及优化

建立木槿ISSR-PCR反应体系,为木槿种质资源的创新与鉴定提供理论基础。采用正交试验法,对影响PCR结果的Taq酶用量、Mg~(2+)浓度、dNTPs浓度、模板DNA用量及引物浓度5个因素进行分析,采用单因素试验对退火温度进行筛选,并利用最佳体系对24个木槿品种进行扩增验证。结果表明,最优反应体系(25μL)中,含10×buffer(Mg~(2+) free) 2.5μL、Taq酶0.75 U、Mg~(2+) 2.0 mmol/L、dNTPs 0.10 mmol/L、模板DNA 100 ng、引物0.5μmol/L。PCR反应程序为94℃预变性2 min;94℃变性30 s,50℃退火30 s,72℃延伸1 min,34个循环;72℃延伸6 min,4℃保温。建立的体系对24个木槿品种能够扩增出清晰稳定、无拖带、多态性高的条带。     

茶树ISSR-PCR反应体系优化研究

通过优化影响茶树ISSR PCR的主要参数,确立适合于茶树的ISSR反应体系和扩增条件。结果表明,在20μl反应体系中模板DNA的用量、T aq酶用量、引物浓度、M g2 浓度、dNT p浓度分别为:模板DNA为40 ng;T aq酶为0.5 U;引物为0.25μm o.lL-1;M gC l2为1.5 mm o.lL-1;dNT p为0.2 mm o.lL-1。适宜退火温度比Tm值高2~3℃。     

桂郁金SSR-PCR反应体系的建立及优化

目的:对桂郁金SSR-PCR反应体系进行建立与优化,使其适合分析桂郁金遗传多样性等研究内容。方法:通过正交设计法对PCR反应体系的引物,模板,2×Taq PCR MasterMix(包括Tap DNA聚合酶,dNTPs,缓冲液等)以及扩增程序进行建立和优化。结果:桂郁金SSR-PCR反应的最佳体系是在15μL的反应体系中,DNA模板2.5μL (25 ng·μL~(-1)),引物1.0μL(1.0μmol·L~(-1)),2×Taq PCR MasterMix6μL,其中Tap DNA聚合酶0.05 U·μL~(-1),Mg~(2+)3.0 mmol·L~(-1),dNTPs0.3 mmol·L~(-1),加ddH_2O至15μL。PCR反应程序的最佳参数设定为变性30 s,退火30 s,延伸45 s,循环35次。结论:建立了桂郁金SSR-PCR反应体系,并通过10份桂郁金材料进行验证,结果显示该体系稳定可靠,可以为桂郁金引物开发,良种选育繁育等相关研究提供参考。     

福建含笑ISSR-PCR反应体系的建立与优化

以福建含笑叶片提取的基因组DNA为材料,对影响ISSR-PCR扩增效果的一些因素,如dNTPs浓度、Mg2+浓度、TaqDNA聚合酶用量、引物用量、模板DNA用量以及退火温度等指标进行筛选和优化,确立了可用于福建含笑ISSR-PCR分析最适宜的PCR反应条件:20μL PCR反应体积中含0.4 mmol.L-1dNTPs,2.5 mmol.L-1Mg2+,1.5 UTaqDNA聚合酶,0.6μmol.μL-1引物,30 ng模板DNA。PCR扩增程序:94℃预变性2 min,94℃变性30 s,47.3℃退火30 s,72℃延伸1 min,45个循环,72℃延伸7 min,4℃保存。应用ISSR体系对5份福建含笑种质进行了扩增,证实了该体系的适用性和稳定性。     

菊芋ISSR-PCR反应体系的建立与优化

利用正交试验设计的方法,从Mg2+浓度、dNTPs浓度、引物浓度和Taq酶浓度4因素对菊芋ISSR-PCR反应体系进行优化分析,并在此基础上对模板DNA浓度及退火温度进行梯度检测。结果表明:菊芋20μl最佳反应体系包括10×PCR buffer,200μmol/L dNTP,0.5μmol/L引物,1.5 mmol/L Mg2+,1.0 U Taq DNA聚合酶和50 ng模板DNA。这一优化系统的建立,将为菊芋种质资源鉴定及遗传多样性的研究奠定基础。     

青海云杉ISSR-PCR反应体系的建立与优化

1材料与方法1．1材料供试材料为祁连山区青海云杉天然分布区内的优良单株,基本能反映出祁连山青海云杉分布区的特点。1．2试剂所用TaqDNA聚合酶、dNTPs等均购于兰州佰澳生物公司;ISSR选择引物来自University of British Columbia Biotechnology Lab（UBCBL）primer set UBC9,由北京赛百盛公司合成。     

单雌蓖麻ISSR-PCR反应体系的建立和优化

以单雌蓖麻提取的基因组DNA为材料,采用单因子试验方法,分别研究了Mg2+浓度、dNTP浓度、引物浓度、Taq DNA聚合酶以及模板DNA用量5种因素对ISSR-PCR反应的影响;建立了适合单雌蓖麻IS-SR-PCR扩增的反应体系,即在20μL反应体系中,10×PCR buffer 2.5μL(Mg2+free),模板DNA 20 ng,2.0mmol/L MgCl2,引物浓度1.0μmol/L,dNTP 0.4 mmol/L,Taq DNA聚合酶1.0 U。     

龙荔基因组DNA的提取及ISSR-PCR体系的建立与优化

应用改良的CTAB法提取龙荔基因组DNA,探讨龙荔ISSR-PCR扩增反应体系的建立和优化。结果表明,经过改良的CTAB法提取龙荔基因组DNA效果良好,所提取的DNA纯度较高,符合ISSR-PCR反应的要求;龙荔ISSR-PCR最佳反应体系（反应总体积20μl）：1×Buffer缓冲液（含适量Mg^2＋）,1 UTaqDNA聚合酶,0.20 mmol/L dNTP,0.25μmol/L引物,DNA模板70-80 ng/μl,退火温度53-54℃。     

藤三七ISSR-PCR反应体系的建立与优化

[目的]建立和优化藤三七稳定ISSR-PCR反应体系和扩增程序。[方法]采用5因素4水平的正交试验和单因子梯度优化相结合的方法。[结果]适用于藤三七的25μl ISSR-PCR反应体系中各因素的最佳浓度分别为:10×buffer 2.5μl,dNTPs 0.15 mmol/L,Mg2+2.0mmol/L,Taq酶1.0 U,引物0.5μmol/L,DNA 100 ng。[结论]对于藤三七ISSR-PCR试验,一次正交试验完全可以建立满足要求的ISSR-PCR体系。     

扁玉螺ISSR-PCR反应体系的建立及其优化

以扁玉螺基因组DNA为材料,分析了Mg2 ,dNTP、Taq DNA聚合酶、引物以及模板DNA浓度对ISSR-PCR扩增效果的影响,建立了一套适合扁玉螺的ISSR-PCR反应体系.该反应体系包括:2.0mmol·L-1的Mg2 ,0.25 mmol·L-1的dNTP,0.8 U的Taq DNA聚合酶,0.2 μmol·L-1的ISSR引物和40 ng模板DNA.利用优化后的反应体系,从30条ISSR引物中筛选出13条扩增效果较好的引物,为进一步利用ISSR标记研究扁玉螺的遗传多样性奠定了基础.     

五节芒ISSR-PCR反应体系的优化

［目的］保护五节芒的种质资源并为其开发利用奠定基础。[方法]以五节芒DNA为材料,分析DNA浓度、Mg^2＋浓度、dNTP浓度、Taq DNA聚合酶的含量以及退火温度对ISSR-PCR扩增结果的影响。并通过单因子试验对ISSR-PCR反应体系进行优化。［结果］建立了五节芒ISSR-PCR的最佳体系：25 μl反应体系中10×PCR Buffer 2.5 μl、0.2 mmol/L 4×dNTP、1.5 mmol/L Mg^2＋、0.75 U Taq DNA聚合酶。PCR反应程序为94 ℃预变性5 min;94 ℃变性30s;51-53 ℃退火30 s,72 ℃延伸50 s,40个循环;72 ℃再延伸7 min。利用优化反应体系从100个ISSR通用引物中筛选出了11个稳定性高、重复性好的引物。［结论］这一优化体系的建立为今后利用ISSR标记技术研究五节芒遗传多样性奠定了基础。     

黄皮ISSR－PCR反应体系的优化

为应用ISSR分子标记对黄皮种质资源、分子标记辅助选择育种及其遗传多样性研究,通过单因素和正交试验对ISSR-PCR反应体系进行优化.结果表明,采用改良SDS法提取的DNA条带完整、无RNA污染,适于ISSR-PCR扩增;黄皮ISSR分析最适的扩增体系是:20 μl的反应体系中含30ng的模板DNA、1.5 U TaqDNA聚合酶、0.4μmol/L引物、0.3 mmol/L dNTPs以及引物(gA)8C的最佳退火温度为520.4℃.     

甘西鼠尾草ISSR-PCR反应体系的建立与优化

采用单因素试验和4因素3水平的正交试验相结合的方法,建立和优化甘西鼠尾草稳定的ISSR-PCR反应体系。结果表明,甘西鼠尾草20 ul ISSR-PCR体系中各因素的最佳浓度:10×Buffer(Mg2+)2μl,d NTPs 0.4 mmol/L,Tag酶1.0 U,引物0.3μmol/L,DNA 30 ng。     

对节白蜡ISSR-PCR反应体系的建立与优化

以对节白蜡(Fraxinus hupehensis Chiú,Shang et Su)基因组DNA为材料,采用正交试验和单因子试验对其ISSR-PCR反应体系进行了构建与优化。结果表明,在15μL反应体系中含DNA模版40 ng、引物终浓度0.7μmol/L、7.5μL 2×Taq PCR Plus Master Mix的扩增效果最好。该反应体系筛选出了14条稳定性强、多态性高、扩增效果较好的ISSR引物,并通过梯度PCR试验比较引物在不同退火温度下的扩增效果,从而确定引物最佳退火温度。