转反义LeETR1基因番茄采后生理特性的研究

 转反义LeETR1乙烯受体基因番茄的采后生理性状与普通番茄不同。转基因番茄的呼吸作用受到抑制，呼吸高峰只有对照的52％，乙烯释放高峰的出现比对照果实推迟10 d。转基因番茄的叶绿素降解和番茄红素的合成受到显著抑制，果实不能形成正常的红色。在成熟过程中，转基因番茄的纤维素酶、多聚半乳糖醛酸酶活性显著低于对照，延缓了果肉的软化。推测LeETR1和番茄的成熟有着密切的关系。     

番茄乙烯受体基因反义表达对果实成熟的影响

 以乙烯受体基因LeETR1和LeETR2的转反义基因株系ale1和ale2为材料, 对果实成熟特性进行了研究。转基因番茄果实与对照相比, 呼吸速率下降, 但乙烯释放速率增加1～4倍, 呼吸高峰和乙烯跃变高峰出现的时间没有改变, 表明果实成熟起始时间没有改变。ale1果实成熟后期着色速度减慢, 红熟果色泽a值、番茄红素和类胡萝卜素含量都显著低于对照; 但果实多聚半乳糖醛酸酶活性上升和硬度下降速度都显著高于对照。这说明LeETR1基因与果实成熟品质特征的形成可能存在比较复杂的关系。     

一氧化氮对番茄果实采后成熟和Le-ETR4基因表达的影响

以破色期的‘卡罗’番茄果实为试材,研究了NO供体硝普钠（SNP）50 μmol · L-1处理30 min对番茄果实采后成熟的作用,并采用Northern杂交技术检测NO对番茄乙烯受体基因Le-ETR4表达的影响。结果表明,50 μmol · L-1 SNP处理降低了番茄果实的乙烯释放速率,抑制了ACC氧化酶（ACC oxidase,ACO）、纤维素酶（Cellulase）和多聚半乳糖醛酸酶（Polygalacturonase,PG）的活性,延缓了果实的色泽变化和软化,同时显著抑制了番茄乙烯受体基因Le-ETR4的表达。以上结果说明NO主要通过抑制番茄乙烯的生物合成和乙烯受体基因表达来控制成熟相关酶的活性,NO可以在生理水平和乙烯受体水平调控番茄果实的成熟。     

1-MCP处理对不同成熟度番茄果实Le-ETR4表达的影响

 以樱桃番茄(Lycopersicon esculentum ) 品种‘卡罗’果实为材料, 研究了1-MCP处理对不同成熟度果实采后20℃贮藏过程中乙烯受体Le2ETR4表达和乙烯释放水平的影响。结果表明: 1-MCP处理可以抑制跃变上升期(破色期) 番茄果实乙烯释放及Le2ETR4表达; 对跃变前期(绿熟) 和跃变高峰期(粉红期) 果实Le2ETR4表达也有抑制作用, 但对乙烯释放无明显影响; 对跃变下降期(红熟期) 果实Le2ETR4表达不仅无明显影响, 反而促进了乙烯释放。     

桃果实采后乙烯合成及乙烯受体ETR1同源基因表达模式的研究

研究了温度和乙烯吸收剂对“南京白凤”桃（Amygdalus persica L．）果实采后乙烯生成和乙烯受体ETR1同源基因表达的影响。结果表明，低温和乙烯吸收剂处理降低了果实乙烯释放量，延缓乙烯释放高峰期。定量PCR分析表明，ETR1的mRNA表达水平受温度和乙烯吸收剂调节，随着乙烯合成能力的增强，ETR1同源基因的表达水平增加，在桃果实乙烯信号传导过程中呈正向表达模式。     

乙烯与脂氧合酶在番茄果实香气合成中的作用

通过对番茄成熟突变体和野生型果实香气物质、乙烯释放量、氢过氧化物裂解酶(HPL)、脂氧合酶(LOX)活性及基因表达的测定,明确LOX与乙烯在番茄果实香气物质合成中的作用。以番茄成熟突变体rin、nor、cnr、nr(均为乙烯合成缺陷突变体)、hp-1(高色素突变体,乙烯生成正常)和野生型Ailsa Craig(AC)为试材,分别在果实破色期(0 d)、破色3 d(3 d)和破色7 d(7 d)取果实,测定香气物质、乙烯释放量、LeHPL基因表达、LOX活性和TomloxC基因表达。结果表明,随着果实的成熟,4种乙烯合成突变体果实中的香气物质种类和含量与野生型AC相比均减少,但突变体hp-1果实中香气物质与AC无显著差异;rin、nor、cnr突变体中不产生乙烯,nr中产生少量乙烯,hp-1和AC果实中能正常生成乙烯;除AC果实外,突变体rin、nor、cnr果实中LOX酶活性和TomloxC基因表达水平均较低,而在hp-1和nr破色7 d果实中酶活性和基因表达量均最高;Le HPL表达量在AC和hp-1果实中随果实成熟显著增加,在nor破色7 d显著高于破色期(0 d)和破色3 d的,而在cnr、rin和nr破色7 d均显著下降。在乙烯合成缺陷突变体果实中香气物质种类和含量较野生型减少,且不能合成乙烯或合成少量乙烯,同时LOX酶活性降低,TomloxC及LeHPL表达下降,表明番茄果实香气物质合成的LOX途径是依赖乙烯的过程。     

转基因番茄果实成熟与乙烯含量的关系

为探索番茄果实成熟与乙烯的关系,测定了转反义NR和ACC基因突变体番茄果实不同发育期乙烯释放量的变化,结果显示:(1)NR2、NR17和NR18号转反义NR基因果实各期的乙烯含量变化规律与普通果实相同。(2)转反义 NR基因番茄果实与转反义ACC基因番茄果实不同,前者果实能正常成熟、但成熟延迟,后者不能正常成熟。(3)在转反义NR基因果实发育各期中,粉红期乙烯释放量最高。(4)转反义NR基因果实成熟各期乙烯的释放量均明显低于普通果实。说明乙烯受体蛋白基因——NR基因的表达在被抑制后,也反过来抑制了番茄果实乙烯的释放。(5)转反义NR基因果实在常温下贮藏,贮藏期延长了43d。     

番茄接种TYLCV后相关基因的表达分析

以感TYLCV番茄品种“合作909大红番茄”和抗TYLCV番茄品种“华美204”为试材,采用荧光定量PCR技术,研究了TYLCV对感病、抗病番茄植株根、茎、叶片中水杨酸、茉莉酸和乙烯3条防御信号途径中关键因子的表达量的影响,以期了解番茄抗TYLCV的机制.结果 表明:接种后30 d,感TYLCV材料“合作909大红番茄”各器官的TYLCV含量均显著高于抗TYLCV番茄材料“华美204”,且根部含量最高,茎部次之,叶片含量最少.水杨酸途径相关基因PR1、NDR1、T(A2.1在叶片中“合作909大红番茄”的相对表达量显著低于“华美204”,但在茎部和根部中高于“华美204”.NDR1和TGA2.1在根部的相对表达量最高,茎部次之,叶片最低.茉莉酸途径相关基因LoxD、Pin2在叶片和茎中“合作909大红番茄”的相对表达量低于“华美204”,但在根部高于“华美204”,LoxD、Pin2在根部的相对表达量最高.乙烯途径相关基因ERF3、EIN2在叶片中“合作909大红番茄”的相对表达量低于“华美204”,但在茎部和根部中高于“华美204”,ERF3和EIN2在根部的相对表达量最高,茎部次之,叶片最低.说明水杨酸、茉莉酸、乙烯3条信号传导途径共同参与了番茄抗TYLCV的过程.     

乙烯利对番茄幼苗生理效应的初步研究

本文以无限生长型的番茄品种为试材，研究了乙烯利三种浓度（１５０ｐｐｍ、３００ｐｐｍ４５０ｐｐｍ）处理对番茄幼苗生长发育的生理效应。试验结果表明，乙烯利能有效地抑制幼苗徒长，增加茎粗，提高叶绿素含量和叶片中束缚水与可溶糖含量及根系活力，使幼苗更趋向于壮苗的形态。乙烯利处理明显提高了番茄早期产量，总产量也有所提高。综合本试验结果，３００ｐｐｍ浓度处理提高番茄幼苗素质及产量的效果明显优于其它二处理。     

葡萄VvACO1的表达及在拟南芥和番茄中的遗传转化

采用RT-PCR方法从葡萄（Vitis vinifera）叶片中克隆到1个ACC氧化酶（ACC Oxidase,ACO）基因,命名为VvACO1。序列分析表明,VvACO1的开放阅读框长度为957 bp,编码318个氨基酸,具有亮氨酸拉链、Fe²⁺结合基序和抗坏血酸结合位点等ACO蛋白的典型结构域;与烟草和番茄的ACO蛋白的相似度分别为87%和84%。组织特异性及乙烯诱导表达结果表明,VvACO1在葡萄叶片、卷须、幼茎、果实、花序、须根以及腋芽等组织中差异表达,并受到乙烯利的诱导上调表达。过表达VvACO1的番茄开花期及果实成熟期提前,过表达VvACO1的拟南芥叶片光合效率和叶绿素a的荧光强度明显下降。     

番茄LemiR390及其预测靶基因LeTAS3的鉴定与表达分析

以番茄（Lycopersicon esculentum）紫色花青素积累品系Aft基因型‘LA1996’为试验材料,以番茄总RNA反转录的cDNA文库为模板,根据mirbase数据库中MIR390基因和番茄unigene数据库预测到的靶基因序列,克隆番茄LemiR390前体基因及其预测靶基因LeTAS3;采用定量PCR技术检测LemiR390及其预测靶基因LeTAS3在番茄果实不同发育阶段的表达情况,利用RLM 5′RACE技术验证LemiR390对靶基因mRNA的剪切作用。结果表明,克隆到两个LemiR390的前体,分别与MIR390a和MIR390b一致,含有完整的茎环结构。LemiR390与其靶基因LeTAS3在番茄果实不同发育时期表达量不同,果实发育前期特别是花后1 ~ 2周幼果期表达量高,发育后期均下降为微量表达,并且在幼果期LemiR390与LeTAS3表达呈负调控关系。LemiR390能够靶作用于LeTAS3的转录本调控其降解,其剪切位点为LemiR390序列5′端的第10位碱基。     

番茄LemiR828的克隆表达及其靶基因的鉴定

以番茄（Lycopersicum esculentum）LA1996（Aft基因型,紫色花青素积累品系）cDNA为模板,对LemiR828前体基因和预测到的靶基因LeTAS4（Trans-Acting SiRNA Gene 4）进行克隆,采用RT-PCR技术检测其在番茄果实发育中的差异表达,并用RLM 5′RACE技术验证LemiR828对预测靶基因LeTAS4 mRNA的剪切作用及靶作用位点。结果表明,LemiR828的前体序列含有完整的茎环结构;在果实发育成熟的过程中,LemiR828及LeTAS4在番茄中的表达量存在差异。在绿色果阶段的表达量较低且LemiR828对LeTAS4的负调控关系不明显;而在成熟果阶段,LemiR828及LeTAS4的表达量均升高,且存在明显的负调控关系。LemiR828能够靶作用于LeTAS4的转录本上调控其降解,其剪切位点为LemiR828序列5′端的第10位碱基。因此,在LA1996番茄果实发育过程中,LemiR828和LeTAS4参与果实发育的调控,并且LemiR828负调控其靶基因LeTAS4的表达。     

CCK-8 up-regulats signal pathway of LPS-induced HO-1 expression in rat lungs

AIM: To study the signal pathway involved in up-regulation of LPS-induced HO-1 expression by CCK-8. METHODS: Forty-two SD rats were divided into 7 groups (six rats each) randomly as follows: control group, LPS group, LPS+SP600125 (JNK-specific inhibitor) group, CCK-8+LPS group, CCK-8+LPS+SP600125 group, CCK-8 group and CCK-8 +SP600125 group. Lungs from the rats in these 7 groups were excised 6 h after the agents were administered. HO-1 mRNA expression was examined by RT-PCR. The protein expression of HO-1 was detected by Western blotting and immunofluorescence flow cytometry (FCM). RESULTS: There were significant positive expression of HO-1 mRNA in LPS group compared to control group. CCK-8 enhanced LPS-induced HO-1 mRNA expression and CCK-8 alone induced HO-1 mRNA expression as well. The mRNA expressions of HO-1 in LPS group, CCK-8+LPS group and CCK-8 group were 3.01 (P<0.01), 5.88 (P<0.01) and 3.45 (P<0.01) times as many as that in control group, respectively. SP600125 inhibited the mRNA expression of HO-1 induced by CCK-8 and (or) LPS. The change of HO-1 protein expression was in accordance with that of HO-1 mRNA expression by Western blotting and immunofluorescence FCM. CONCLUSION: These results suggest that JNK/c-Jun signal pathway plays an important role in the up-regulation of LPS-induced HO-1 expression by CCK-8.     

葡萄果实始熟前后ABA积累关键酶基因VvNCED1和VvBG1转录水平的研究

以始熟期花后7 ~ 11周的‘玫瑰香’葡萄果肉为试材,利用荧光定量PCR分析了VvNCED1和VvBG1基因在5个时期的表达量。结果表明,VvNCED1基因在花后7 ~ 8周表达量很高,随后快速降低至最低值;随着果实着色,表达量略有升高。VvBG1基因在果实始熟前表达量较低,随着果实始熟启动和果实着色,表达量基本呈持续升高的趋势。结合果实ABA含量在始熟期前后一直升高的结果分析,认为果实始熟前ABA积累归因于VvNCED1基因的高水平表达,始熟后ABA积累主要归因于VvBG１基因的高水平表达。     

番茄果实特异性LYC-B 干扰载体的构建及在不同颜色果实中的表达特异性验证

为了研究番茄LYC-B 干扰对类胡萝卜素合成主要酶和主要代谢产物的影响，构建了果实特异性的番茄红素β- 环
化酶LYC-B 干扰载体，并验证了其在不同颜色番茄果实中的有效性。依据X13437.1 扩增番茄果实特异启动子E8，构建了果
实特异性载体E8-pBI121，其在粉色、红色、绿色和紫色的番茄果实中均能表达。依据X86452.1 扩增番茄LYC-B 从61～861
bp 间长度为801 bp 的片段LYC-B1 和从 480～781 bp 间长度为302 bp 的片段 LYC-B2，构建了以CaMV 35S 为启动子的LYC-B
干扰表达载体pBI121-B1B2，以E8 替换CaMV 35S，构建了果实特异性干扰载体E8-pBI121-B1B2。采用农杆菌注射法分别
侵染番茄叶片和果实，GUS 染色显示，pBI121-B1B2 在叶片、果实和种子中均表达，E8-pBI121-B1B2 只在果实和种子中表达。     

拟南芥At-pri-miR828 基因的克隆及其对番茄的遗传转化

 MicroRNA828（miRNA828）是一种新近发现的生物学功能还未全面研究的miRNA。为从 不同角度阐明miRNA828 的生物学功能,从拟南芥中克隆到At-pri-miR828 基因并构建了该基因过量表达 的植物表达载体pC2300-pOT2-At-pri-miR828,通过农杆菌介导的叶盘法将pC2300-pOT2-At-pri-miR828 导入异源植物番茄品种‘Ailsa Craig’中。PCR 鉴定结果显示,外源基因At-pri-miR828 已成功整合到转 基因番茄基因组中,共获得9 个转基因株系,67 株转基因植株。定量PCR 检测结果显示,与野生型番茄 植株相比,转基因植株中miR828 的表达量显著增加,而生物信息学所预测的miR828 靶基因Sly-myb-like1 的表达水平则相应降低。花青素含量测定结果显示,miR828 过量表达的转基因番茄植株花青素含量明显 低于野生型植株,表明miR828 参与了番茄花青素的生物合成调控。     

Role of BMP-7/Smads pathway in regulation of EndoMT in rats with HHPH

AIM: To investigate the role of bone morphogenetic protein 7 (BMP-7)/Smads pathway in the re-gulation of endothelial-mesenchymal transition (EndoMT) in rats with hypoxia-hypercapnia pulmonary hypertension (HHPH). METHODS: The rat pulmonary artery endothelial cells (RPAECs) were divided into normoxic control (Con) group, hypoxia-hypercapnia (HH) group, BMP receptor agonist rhBMP-7 group, BMP receptor inhibitor DMH-1 group and solvent DMSO group. After given the corresponding drugs in each group, the cells in Con group were cultured in a normal-oxygen incubator, and the cells in the remaining 4 groups were cultured in a low-oxygen and high-carbon-dioxide incubator. The expression levels of CD31 and α-smooth muscle actin (α-SMA) were observed by immunofluorescence staining. The mRNA and protein expression levels of α-SMA, CD31 and Smad1/5/8 were detected by RT-PCR and Western blot, respectively. The cell viability was measured by CCK-8 assay. The cell migration ability was detected by Transwell chamber assay. RESULTS: Compared with Con group, the expression of α-SMA at mRNA and protein levels in HH group was increased, the expression levels of CD31 mRNA and protein, Smad1/5/8 mRNA and p-Smad1/5/8 protein were decreased, the cell viability was decreased and the number of migratory cells was increased (P<0.05). Compared with HH group, the expression of α-SMA at mRNA and protein levels in rhBMP-7 group was decreased, the expression levels of CD31 mRNA and protein, Smad1/5/8 mRNA and p-Smad1/5/8 protein were increased, the cell viability was increased and the number of migratory cells was reduced (P<0.05). Compared with rhBMP-7 group, the expression of α-SMA at mRNA and protein in DMH-1 group was increased, the expression levels of CD31 mRNA and protein, Smad1/5/8 mRNA and p-Smad1/5/8 protein were decreased, the cell viability was decreased and the number of migratory cells was increased (P<0.05). CONCLUSION: Hypoxia-hypercapnia conditions promote EndoMT in RPAECs, which promotes the development of hypoxia-hypercapnia pulmonary hypertension, and the underling mechanism may be related to the inhibition of BMP-7/Smads pathway.