首页 | 本学科首页   官方微博 | 高级检索  
相似文献
 共查询到20条相似文献,搜索用时 15 毫秒
1.
减蛋综合征病毒基因组HindⅢ酶切片段的克隆及酶谱分析   总被引:9,自引:0,他引:9  
以PUC19质粒为载体,采用鸟枪法克隆减蛋综合征病毒(EDSV)基因组的HindⅢ酶切片段,用Digoxigenin-dUTP标记的EDSVHingⅢ片段探针打点杂交,证实13个克隆插入了EDSVDNA的HindⅢ片段。酶切分析结果表明,克隆到了A、B、F、GH、I、J7个不同大小的片段,选取上述插入片段的、具有代表性的7个相应质粒PUHA、PUHB、PUHF、PUHG、PUHH、PUHI、PUH  相似文献   

2.
牛传染性鼻气管炎病毒tk基因的克隆   总被引:2,自引:0,他引:2  
王柳  于力 《中国兽医学报》1995,15(2):116-120
根据牛传染性鼻气管炎病毒LA株的物理图谱及Coper株和LA标tk基因在基因组中的定位,将LA株DNA HindⅢA片段中的SalI-SalI亚片段、BglⅢ-SalI双酶切亚片段分别克隆到载体质粒pBluescriptSK中,筛选出3个重组质粒p^tk-1,Ptk-2和Ptk-3,其外源片段大小分别为2.7kb,1.1kb和1.6kb。经酶切分析及同源核酸探针杂交试验表明,2.7kb SalI-  相似文献   

3.
减蛋综合征病毒全基因组DNA文库的构建及物理图谱分析   总被引:1,自引:0,他引:1  
E D S V A A2 株纯化 D N A 经 Hind Ⅲ、 PstⅠ和 Sph Ⅰ水解后, 分别提取 D N A 片段并克隆至p Bluescript K S( + ) 和p G E M3 Zf ( + ) 载体, 构建了 E D S V 全基因文库。根据 E D S V D N A 片段和基因组 D N A 电泳迁移率计算, E D S V 基因组大小为329kb , 通过克隆片段酶谱鉴定, 杂交建立了 E D S V 限制性内切酶 Hind Ⅲ、 Pst Ⅰ和 Sph Ⅰ的物理图谱。  相似文献   

4.
用SDS-蛋白酶K消化EDSV抗原-抗体复合物、酚-氯仿抽提DNA,得到了完整的EDSV基因组DNA(约33kb),用限制性内切酶EcoRI+BamHI双酶切,得到7个片段,分别回收各片段,与双酶切线性化的PUC19载体质粒连接,转化E.coliDH5α,成功地克隆了其中的5个片段。  相似文献   

5.
用内切酶SacⅠ和HindⅢ双酶切大肠杆菌质粒pEWD299,回收505bp的LTB基因片段,再将载体pUC18用SacⅠ和HindⅢ双酶切,最后将pUC18DNA与505bp的LTBDNA进行连接,转化至受体菌DH5α中,经SacⅠ/HindⅢ、EcoRⅠ/HindⅢ酶切反应鉴定重组子,得到了理想重组子质粒pXLT1。再将pXLT1进行EcoRⅠ酶切、大肠杆菌聚合酶ⅠKlenow大片段补平、HindⅢ酶切处理,然后与用HicⅡ和HindⅢ酶切的pUC18连接,转化至受体菌DH5α中,经XbaⅠ/HindⅢ酶切反应鉴定重组子,得到了理想重组子质粒pXLT1-1。将质粒pXLT1-1进行核苷酸序列分析,确定了插入的LTB基因与载体的连接向位及其全部核苷酸序列  相似文献   

6.
减蛋综合征病毒末端片段的克隆及细胞内DNA重组   总被引:6,自引:0,他引:6  
采用9~10日龄非免疫鸭胚增殖的减蛋综合征病毒(EDSV)AA-2毒株,经差速离心法浓缩纯化后,提取病毒基因组DNA。采用碱变性法除去病毒基因组共价结合的末端蛋白(TP)。用限制性内切酶HindⅢ水解纯化的EDSV基因组DNA。经低熔点琼脂糖凝胶电泳后,回收C、D、E片段。克隆到pUC19载体的HindⅢ和SmaⅠ双酶切位点及HindⅢ位点上,经蓝白斑筛选和单、双酶切鉴定,获得了pUHC、pUHD、pUHE重组质粒,其中pUHC含有末端片段。将EDSVSalⅠ水解产生并回收的大片段与pUHC在95℃水浴中变性,65℃复性后,用钙离子介导法,共转染50%~70%的单层鸭胚成纤维细胞,转染后36h开始产生细胞病变(CPE)。48h后将病变细胞反复冻融,经尿囊腔接种9~10日龄鸭胚,回收的尿囊液能凝集鸡红细胞,这种血凝性能被EDSV高免血清抑制,电镜下观察到腺病毒样颗粒。  相似文献   

7.
新城疫病毒F48E9株HN基因的克隆与酶切分析   总被引:9,自引:0,他引:9  
为深入探讨新城疫病毒(NDV)的结构与功能的关系,扩增和克隆了F48E9株NDV的HN基因。首先以提取的F48E9株NDV基因组RNA为模板逆转录合成第一链cDNA,然后用HN基因特异性引物作PCR扩增HNcDNA,结果得到1条分子量约1.8kb的DNA带,与NDVHN基因的大小一致。Southernblot杂交进一步证实其为HN特异性cDNA。随后采用平端连接法将其克隆到pSV·Sportl质粒中,应用限制性内切酶EcoRI、ScaⅠ、MluⅠ、ApaⅠ、PstⅠ、和SmaⅠ对NDVF48E9株HNcDNA重组质粒作单酶或双酶切,结果表明,NDVF48E9株HN基因较HitchnerB1株的HN基因缺少1个MluⅠ位点(705bp左右),多1个PstⅠ位点(802bp左右)。  相似文献   

8.
伪狂犬病病毒HS株tk基因的PCR扩增与克隆   总被引:5,自引:0,他引:5  
参照伪狂犬病病毒(Pseudorabiesvirus,PRV)NIA-3株tk基因序列,设计并合成1对长22mer的引物,引物间距1.5kb,其内包含完整的PRVtk基因。以BHK21细胞繁殖的PRV湖北地方强毒株(HS-9304)基因组为模板进行PCR扩增。琼脂糖凝胶电泳检测显示扩增主带清晰,长约1.5kb,符合设计要求。扩增片段克隆至由pUC18质粒改制而成的T载体中,限制性内切酶BamHI、SmaⅠ、XhoⅠ、HindⅢ酶切分析证实,扩增片段的酶切位点与tk基因一致,说明扩增和克隆片段包含PRVtk基因。  相似文献   

9.
新城疫病毒F48E8株融合蛋白基因的克隆   总被引:2,自引:0,他引:2  
以提纯的我国标准UDVF48E8强毒株基因组RNA为模板、化学合成的融合蛋白(F)基因特异寡核苷酸为引物,反转录合成F基因cDNA,并采用同聚物加尾的方法克隆到细菌质粒pGEM3Zf(-)。经AIX平板筛选和酶切分析,并用F基因片段核酸探针作dot-blot检测,共获得插入片段长度在0.6 ̄2.8kb之间的阳性克隆34个,其中插入片段大于1.5kb的阳性克隆8个。用多种限制性内切酶对阳性克隆pF7  相似文献   

10.
从2型犬腺病毒的MDCK细胞培养物中提取线状双链病毒基因组DNA,利用限制性内切酶PstI、BglⅠ和HindⅢ分别进行酶切,在1%琼脂糖凝胶上电泳,随后Southern印迹到尼龙膜上,利用Digoxin标记的2型犬腺病毒E3区PCR产物与膜上DNA杂交,结果发现,E3区探针分别与病毒DNA的PstIB片段、BglIAl片段和HindⅢA2、B2片段呈现阳性杂交反应,该结果为E3区的克隆及犬腺病毒  相似文献   

11.
产蛋下降综合征(EDS-76)病毒DNA酶切图谱分析   总被引:4,自引:0,他引:4  
选用EcoRI、PstⅠ、PvuⅡ、HindⅢ、BglⅠ和BglⅡ6种限制性内切酶,对国内4株EDS-76病毒鸡源分离株和国外标准株AV-127及1株鹅源腺病毒的DNA进行酶切图谱的比较,结果发现4种鸡源分离株与AV-127株用上述6种酶切的片段数分别为4、8、10、10、6和7条。各酶切图形、片段大小亦十分相似,表明均为EDS-76病毒。EcoRI-HindⅢ和PstI-EcoRI的双酶切也得到同样结果。鹅源分离株的酶切片段数分别为6、7、9、7、4和10条,酶切图形和片段大小均与AV-127有很大不同,表明该分离株可能为1株血清型相同而基因组不同的EDS-76鹅腺病毒。  相似文献   

12.
鸡减蛋综合征病毒六邻体蛋白基因的序列分析   总被引:13,自引:2,他引:13  
从中国发病鸡群中分离的鸡减蛋综合征病毒(EDSV),经非免疫鸭胚增殖后,用差速离心法纯化和蛋白酶K法抽提,获得全长约为34kb的EDSV全基因组。用限制性内切酶HindⅢ酶解EDSV全基因,以pBluescriptⅡ为载体,构建了EDSV的HindⅢ酶解片段的文库,并对其中的D片段(长为3.6kb)进行了序列测定及同源分析,结果提示该片段中唯一一个完整的开放读码框架(ORF)(430~3162位)编码EDSV的六邻体蛋白,其特定氨基酸残基的排列组合和功能区的分布等与其他几个具有代表性的腺病毒的六邻体蛋白相似,它们之间的核苷酸序列同源性在49.6%~72.9%,氨基酸序列同源性在46.3%~83.9%。本研究为进一步阐明EDSV基因组的结构特点,基因结构与功能的关系及进化分类等奠定了基础  相似文献   

13.
产蛋下降综合征(EDS-76)病毒DNA探针的制备及应用研究   总被引:2,自引:0,他引:2  
用纯化的产蛋下降综合征(EDS-76)病毒(H91毒株)悬液提取的核酸,经琼脂糖凝胶电泳只出现1条分子量较大、背景清晰的核酸带。用BamHI酶消化产生4个片段,大小分别为17kb、10kb、4.0kb和2.0kb。将其中的2.0kb片段克隆进pUC18DNA载体中,重组质粒DNA用digoxigenin标记作为DNA探针,在dotblot中该探针不与鹅胚尿囊液核酸抽提物、马立克氏病病毒(MDV)DNA、鸡传染性贫血病毒(CAV)DNA、SPF鸡基因组DNA等核酸反应,只与3株EDS病毒(EDS标准毒株AV-127、EDSH91毒株和从健康鹅体中分离的EDSY81毒株)DNA呈阳性反应。人工感染产蛋母鸡和雏鸡后24h即可用该探针从泄殖腔棉拭子样品中检测出EDS病毒DNA,在感染后35h仍能从部分感染鸡样品中检出。对部分探针检测阳性鸡的泄殖腔棉拭子样品用SPF鸡胚分离病毒,并用HA和HI试验检测分离病毒的特异性;在感染过程中,同时检测了血清中HI抗体的消长情况。结果表明,人工感染鸡排毒至少可以维持2个月左右,而且血清中HI抗体即使很高,也不能阻止感染鸡的排毒。  相似文献   

14.
将含产气荚膜梭菌α毒素基因的质粒pKMA100用限制性核酸内切酶BamHI和HindⅢ双酶切,经1.5%琼脂糖凝胶电泳分离、透析袋电洗脱法回收0.95kbα毒素基因片段,再将载体pET-28b(+)用BamHI和HindⅢ双酶切,然后将处理好的pET-28b(+)与0.95kb的α毒素基因片段通过T4DNA连接酶进行粘性末端连接,转化至受体菌BL21(DE3)中。经BamHI和HindⅢ双酶切分析和核苷酸序列分析,证明重组质粒pXETA1含有产气荚膜梭菌α毒素基因。确定了α毒素基因的全部核苷酸序列,并证明其具有正确的阅读框架。  相似文献   

15.
本实验对鸡痘病毒282E4株基因组PstⅠHindⅢ或BamHⅠ片段进行了克隆、鉴定,并对部分克隆进行酶切分析,在此基础上对其中6个克隆插入P11P7.5-LacZ报告基因盒,构建了含报告基因的重组质粒。用其中的三个重组质粒以磷酸钙法共转染鸡胚成纤维细胞(CEF),其中有2个产生了蓝色空斑.经三次空斑纯化能稳定产生子代病毒.证明所使用pFB176和pFH133为病毒复制非必需片段,分别是2.9kbBamHⅠ片段和4.7kb的HindⅢ片段,并绘出了它们的物理图谱.  相似文献   

16.
鸡传染性喉气管炎病毒中国王岗株gX基因的克隆及鉴定   总被引:4,自引:1,他引:3  
以pUC19质粒为载体克隆鸡传染性喉气管炎病毒(ILTV)中国王岗株的DNA,构建了鸡传染性喉气管炎病毒DNA的KpnⅠDNA文库。参考ILTV-SA2株gX基因的核酸序列,设计并合成了分别为12bp和13bp的1对引物。以ILTV中国王岗株DNA为模板,用PCR方法特异性地扩增出0.84kb的ILTV-gX基因片段。以地高辛标记该0.84kb的片段为探针,经Southern杂交从ILTV中国王岗株KpnⅠDNA文库中筛选出3个含5.2kb外源ILTVDNA片段的gX基因阳性重组子。经酶切分析、Southern杂交、PCR检测和该片段部分酶谱分析表明,ILTV中国王岗株DNA5.2kb的KpnⅠ片段无论是片段大小还是酶切图谱均与ILTV-SA2株完全相同,而且Southern杂交和PCR检测均为gX阳性,证明其中含有完整的gX基因  相似文献   

17.
从包含伪狂犬病病毒(PRV)闽A株BamHI-7片段的重组质粒pPR128中分离出含有完整糖蛋白gp50基因的2.1kbDNA片段,用KpnI和StuI酶切后,将其酶切片段分别克隆到pUC19载体中,构建了2.1kb片段完整测序用质粒。对其序列进行分析,发现与文献报道结果一致,证明分离的gp50基因是正确的。将包含gp50基因的2.1kb和1.6kbDNA片段分别插入带有痘苗病毒天坛株TK基因区段的pGJP-5质粒P7.5启动子的下游,构建了pGBT50-36和pGBT50-S22个嵌合载体。将嵌合载体通过磷酸钙共沉淀法转染预先感染TK+痘苗病毒天坛株的人TK-143细胞或CV-1细胞,进行体内同源重组。经蚀斑纯化,在BdUR选择压力下,通过光敏生物素标记的探针杂交,获得带有PRVgp50基因的重组痘苗病毒。用ELISA检测,重组痘苗病毒有特异性PRVgp50抗原存在。  相似文献   

18.
采用RT-PCR方法,以IBV S1全基因特异性引物分别从我国华东,华北,华中,华南,西北及东北等地的IBV流行株基因组中扩增出预期的1.7kb左右的DNA片段。PCR产物的HaeⅢ酶切分析及其与英国IBV S1全基因核酸探针的分子杂交证实所获6个IBV流行株的PCR产物为IBV S1基因。将此6个毒株的S1基因PCR产物分别进行5‘和3’端的BamHI和HindⅢ酶切识别位点的分子修饰之后插入到  相似文献   

19.
嗜水气单胞菌HEC毒素基因的克隆及酶谱分析   总被引:4,自引:0,他引:4  
嗜水气单胞菌HEC毒素是该菌重要的致病因子和保护性抗原。为了解其分子生物学特性,用SDS-蛋白酶K法提取了嗜水气单胞菌J-1株的染色体,经EcoRI酶切、琼脂糖凝胶电泳后作Southernblotting,用DIG标记的HEC毒素探针检测,其5.0kb的酶切片段呈阳性。回收该片段,与pUC19相连,转化大肠杆菌JM109。提取X-gal平板上白色菌落的质粒,经大小比较、EcoRI酶切分析及DIG标记HEC毒素核酸探针斑点杂交鉴定,获得pHEC11等含5.0kb目的DNA片段的重组质粒。pHEC11质粒经酶切、电泳,证实目的DNA片段中含有BamHI、SmaⅠ、PstⅠ及PvuⅡ等酶切位点,并绘制了其物理图谱。同时还构建了若干亚克隆,为研制嗜水气单胞菌基因工程苗提供了目的基因片段。  相似文献   

20.
以质粒pUC18和pGEM3Zf(+)为载体,克隆了伪狂犬病病毒S株基因组DNA的PstⅠ酶切4.3kb片段,该片段含有完整的prv43基因和gⅢ糖蛋白基因。经酶切分析和对转化菌融合蛋白的免疫反应性及免疫原性分析,鉴定了重组质粒pUC4.3和pGe4.3,从而证实其插入片段含有完整的gⅢ糖蛋白基因。  相似文献   

设为首页 | 免责声明 | 关于勤云 | 加入收藏

Copyright©北京勤云科技发展有限公司  京ICP备09084417号