参薯金属硫蛋白基因DaMT2a的克隆与表达分析

金属硫蛋白属于一类富含半胱氨酸,能够与重金属离子结合的低分子量蛋白质,在植物抗逆过程中起着重要作用。本研究从参薯中克隆了一个金属硫蛋白基因,命名为DaMT2a (与金属硫蛋白MT2a同源),序列分析显示克隆获得的金属硫蛋白基因的c DNA长度为540 bp,包含了3个外显子和2个内含子,编码79个氨基酸,具有金属硫蛋白基因家族的保守结构域。进化树分析表明DaMT2a属于金属硫蛋白Type2类成员。利用实时荧光定量PCR技术研究了其在正常组织及胁迫条件下的表达特性。结果表明DaMT2a主要在参薯的茎和雄花中大量表达,机械伤害可显著上调DaMT2a基因表达,高温处理则明显下调DaMT2a基因表达,乙烯利和脱落酸处理上调DaMT2a基因的表达。本研究为参薯抗逆相关金属硫蛋白基因的筛选和功能鉴定提供了参考依据。     

Cu2+对杜仲愈伤组织诱导及增殖的影响研究

以杜仲嫩叶为外植体,诱导愈伤组织并进行增殖试验.在培养基中添加不同浓度的Cu2,研究Cu2对杜仲愈伤组织诱导及增殖的影响.结果表明:诱导培养基中附加1.0 mg/L的Cu2+时,有利于杜仲愈伤组织形成,诱导率最高.在增殖培养基中添加0.7 mg/L的Cu2+时,可明显改善愈伤组织的生长状态,增加愈伤组织增殖生长量.杜仲愈伤组织诱导率及增殖生长量随着Cu2+浓度的升高而逐渐升高,但当Cu2+浓度超过1.0 mg/L时,诱导率及生长量下降.     

基于基因组鉴定小桐子Dof转录因子家族及其表达分析

Dof蛋白是植物特有的C2-C2型锌指蛋白类转录因子,在植物碳氮代谢、次生物质合成、种子萌发及抗逆性等方面发挥重要作用。为全面解析小桐子Dof基因的特征,本研究基于小桐子基因组数据,对Dof基因家族进行了鉴定,并对其系统进化、基因结构、保守结构域及差异表达特性等进行了分析。结果表明,在小桐子基因组中共鉴定到24个Dof基因,GSDS基因结构分析显示都包含1(9个)或2(15个)个外显子,聚类分析结果将24个小桐子Dof蛋白分属于4个亚族及7个亚组,其中,有16个(66.7%)Dof蛋白的等电点偏碱性。荧光定量表达分析显示,JcDof1.4L与JcDof5.4L分别在茎与根中高表达,且两者都属于低温诱导表达基因,分别在低温胁迫3 h与24 h达到最大表达量,较对照分别提高4.06倍、8.96倍(p0.01)。本研究结果为进一步开展小桐子Dof基因的克隆与功能鉴定提供了依据。     

金属硫蛋白的研究进展

金属硫蛋白是一种低分子量,富含半胱氨酸可结合重金属的蛋白质,它广泛存在于人体、动物、植物以及微生物体内,且理化性质基本一致。它可被不良刺激、金属、激素等诱导合成。近年来随着越来越多的金属硫蛋白基因被克隆及金属硫蛋白分离纯化技术的改进,对金属硫蛋白的研究日益深入,很多实验表明,金属硫蛋白参与体内微量元素的储存、转运和代谢,拮抗电离辐射,清除自由基以及对重金属的解毒作用,还与机体生长发育、延缓衰老及某些疾病有关。目前,动物金属硫蛋白由于发现较早,研究深入,而植物金属硫蛋白发现相对较晚,进展缓慢。本文对植物和动物金属硫蛋白的分类、特性、基因结构及调控、功能做了阐述,并对金属硫蛋白在医学、环境、食品、化妆品领域的应用前景做了介绍。     

海南龙血树金属硫蛋白基因DcMT3a和DcMT3b的鉴定和表达分析

植物金属硫蛋白通过清除活性氧参与了植物防御反应,是植物胁迫应答的关键蛋白。MT3蛋白是重要的植物金属硫蛋白之一。本研究在对海南龙血树转录组序列进行注释拼接的基础上,利用RT-PCR技术首次克隆了2个DcMT3基因,分别命名为DcMT3a和DcMT3b,GeneBank登录号分别为MF594216和MF594217。结果表明DcMT3a和DcMT3b基因分别编码65个和62个氨基酸,且均具有植物MT3蛋白的典型结构特征,即N端的4个保守性半胱氨酸(cysteine,C)和C端的6个保守性半胱氨酸。进化分析表明DcMT3a和DcMT3b与百合目植物芦笋、马蔺具有较高相似度。亚细胞定位分析发现2个DcMT3蛋白均定位于叶绿体,二级结构也都主要由α螺旋和无规则卷曲构成。表达分析表明DcMT3a和DcMT3b在海南龙血树各组织中具有不同程度的表达,其中果实中的表达量最高。此结果为深入研究植物金属硫蛋白在海南龙血树发育及血竭形成过程中的作用奠定了基础。     

重金属Cu、Zn污染对小麦旗叶生理及产量的影响

为明确Cu 、Zn 污染对小麦生长发育影响,从而为小麦优质高效、安全生产提供理论指导,以分别添加铜盐和锌盐模拟污染土壤的盆栽试验,研究了晋麦96灌浆期旗叶的叶绿素含量、叶绿素荧光诱导动力学参数、保护酶活性和产量及产量构成。结果表明：开花后Cu 、Zn各处理间SPAD值均呈先升后降的趋势,低浓度Cu 、Zn处理有利于提高叶绿素含量,延缓叶片衰老进程。Cu、Zn以100mg/ kg处理在灌浆后期光化学活性较强,受伤程度较小,高于100mg/ kg不利于维持小麦叶片细胞膜稳定性,适宜的Cu、Zn含量可以延缓小麦旗叶细胞的脂膜过氧化作用和衰老进程。从拔节期到灌浆期各处理小麦旗叶CAT含量均呈先升后降的趋势,Cu、Zn均以100mg/ kg处理CAT活性最高;Cu 、Zn处理对株高影响较小,且均以100mg/ kg处理产量最高分别达12.86 g、12.17g。     

SH-110菌海藻糖合成酶基因克隆、表达及酶学性质研究

为找到理想的工业化生产海藻糖合成酶基因工程菌,以长白山温泉SH-110基因组DNA为模板,PCR扩增编码Tres基因片段,克隆至pET-30a(+)原核表达载体,转化E.coli BL21(DE3),实验中采用IPTG和乳糖同时进行对比诱导,对表达产物进行SDS-PAGE和酶学性质研究。成功克隆了2912 bp的Tres基因,实验中发现加入IPTG和乳糖后,融合蛋白在胞内都得到了表达,而且添加乳糖诱导的蛋白表达量偏高。表达重组酶Tres相对分子量约为110 kDa,最适作用温度60℃,最适pH7.0。金属离子Ca2+、K+、Zn2+对重组酶有明显激活作用,Ba2+、Cu2+、Mn2+有明显抑制酶活作用。重组酶的动力学常数Km为8.823 mmol/L和Vmax为235.29 mmol/L。已成功在大肠杆菌表达重组Tres,为进一步研究利用基因工程菌生产大量海藻糖合成酶,进行大规模生产海藻糖提供理论依据。     

木薯金属硫蛋白基因的克隆和表达分析

金属硫蛋白(metallothionein,MT)分子量小,半胱氨酸含量高,具有消除离子自由基,减弱重金属毒性和减少体内活性氧积累等功能。为探究木薯金属硫蛋白基因(MeMT)的原核表达能力和对活性氧的耐受性,本研究通过木薯cDNA克隆获取MeMT并将其连接至pET-28a,在BL21(DE3)菌株中成功诱导其表达。H2O2耐受性分析发现,与空载菌株相比,表达MeMT蛋白的DE3菌株对H2O2的耐受水平较高。RT-qPCR技术检测显示,在H2O2胁迫下,3 h时木薯叶片中MeMT的表达水平明显升高,但6 h时恢复甚至略低于对照组,证明MeMT在木薯中参与ROS应答过程。该结果对研究木薯抗逆性和产量的提高具有重要意义。     

海南龙血树金属硫蛋白基因DcMT2的克隆和表达分析

金属硫蛋白是植物金属离子代谢及胁迫应答的关键蛋白,而且通过清除多余的活性氧调控着植物抗性的形成过程。MT2蛋白是重要的植物金属硫蛋白之一。本研究利用海南龙血树转录组数据,在注释拼接的基础上首次克隆了海南龙血树金属硫蛋白MT2基因(命名为DcMT2,Gene Bank登录号为MF594215),DcMT2基因序列全长为237 bp,编码79个氨基酸。序列分析发现DcMT2具有典型的植物金属硫蛋白MT2的结构特征,包含2个富含半胱氨酸的保守基序。DcMT2蛋白与百合目植物芦笋、水仙和马蔺具有较高的相似度,且在系统进化上划为同一分支。生物信息学分析显示该编码蛋白包含6个磷酸化位点,为非分泌型蛋白,主要在细胞外发挥作用,相对分子量为7.81 kD,理论等电点为4.86;二级结构主要由α螺旋(20.25%)和无规则卷曲(56.96%)构成。实时荧光定量PCR结果表明,DcMT2在海南龙血树的各组织中均有表达,在果实中的表达量最高,而根、茎、叶中的表达量较低。此结果为研究金属硫蛋白DcMT2在海南龙血树发育和血竭形成过程中的作用奠定了基础。     

应用RNA重测序分析低硫条件下大豆基因表达谱

大豆是重要的粮油兼用作物,其硫利用的研究不足。本研究评价了云梦六月花叶和沁阳大豆对低硫的耐性,以这2个品种为材料,利用RNA重测序技术分析了对照(+S)和缺硫(–S)水平下根和叶中的表达谱。结果表明,云梦六月花叶对低硫表现为耐性,沁阳大豆对低硫表现为敏感。表达谱分析在云梦六月花叶和沁阳大豆的叶中分别鉴定到9064个和9795个低硫响应的差异表达基因,根中分别鉴定到3185个和5006个差异表达基因。KEGG富集分析发现,2个材料叶中有9个共有途径,仅植物MAPK信号途径富集更多的上调表达基因。2个材料根中有18个共有途径,其中9个途径在2个材料的中对低硫的响应一致, 4个途径包含更多的上调表达基因, 5个途径包含更多的下调表达基因。在其余9个途径中,云梦六月花叶包含更多的上调表达基因。大豆硫酸根转运蛋白基因对硫酸根的吸收和转运非常重要,在表达谱中鉴定到27个硫酸根转运蛋白基因,分属4个亚组,亚组1、2、4的基因多受低硫诱导,亚组3的基因对低硫的响应较为复杂。基于富集分析结果,本研究从植物MAPK信号途径中克隆了一个受低硫诱导的基因Gm EIL1,通过转化大豆毛状根证明该基因参与大豆硫利...     

CBM2蛋白的高密度自诱导

为提高外源蛋白表达量,以pET20b载体、BL21(DE3) E.coli宿主细胞,比较了乳糖和IPTG对CBM2（碳水化合物结合结构域）蛋白表达量的诱导效果。ZYM-5052自诱导培养基菌体OD₆₀₀是IPTG LB培养基菌体的4.4倍。SDS-PAGE显示200 μL ZYM-5052菌体细胞含有82.3 μg CBM2,占细胞总蛋白55.3%;等量IPTG LB菌体细胞含有16.6 μg CBM2,占细胞总蛋白25.7%。取不同培养时间等量等同OD₆₀₀的ZYM-5052菌体进行SDS-PAGE,结果显示单位细胞中蛋白量随着培养时间而增加。所以高密度自诱导不仅提高了细胞生长密度、而且提高了单位细胞中蛋白表达量。自诱导方案用于表达葡聚糖酶,与IPTG LB菌体相比,自诱导菌体OD₆₀₀是其2.3倍,酶活性是其4.5倍。该研究为提高外源蛋白表达量提供了较为简单、普适的高密度自诱导方案。     

转金属硫蛋白基因(MT1)烟草抗Cd2+胁迫的生理特性分析

将柽柳(Tamarixsp.)金属硫蛋白基因(MT1,GenBank登录号:AB298390)插入植物表达载体pBI121,取代花椰菜病毒35S启动子下游的gus基因,利用农杆菌(Agrobactrium tumefaciens)介导法将MT1导入烟草(Nicotiana tobacum)基因组。对具有卡那霉素抗性,且经PCR-Southern检测和Northern杂交表现阳性的转基因株系进行抗Cd2 分析表明,金属硫蛋白基因的过量表达提高了转基因植株的抗Cd2 能力,在含200μmol L-1和400μmol L-1Cd2 的MS培养基上,转基因植株的株高和鲜重均明显优于非转基因株系;在生理性状上表现为转基因植株MDA含量及POD活性明显低于非转基因株系,叶绿素含量和SOD活性比非转基因株系明显增加。     

核盘菌诱导下甘蓝型油菜防御相关基因表达差异分析

菌核病是油菜主要病害, 至今尚未在油菜及相关植物中找到抗性基因。本研究利用qRT-PCR法比较了抗病品种宁RS-1和感病品种APL01在接种核盘菌后0~48 h内11个防御相关基因的表达差异, 以揭示抗病品种宁RS-1的抗病机制。结果表明, 4个基因(PGIP、Cu/ZnSOD、OXO和GLP)在核盘菌诱导前后抗、感品种内表达量均较高, 且抗病品种的表达量显著高于感病品种, 尤其是PGIP基因, 抗病品种宁RS-1在24 h的表达量为诱导前的170.4倍, 而感病品种仅为诱导前的3.5倍, 该时期抗病品种PGIP的表达量为感病品种的1299.4倍;2个基因(LOX2和PDF1.2)在诱导前后抗、感品种内的表达量均较低, 但抗、感品种间表达量差异显著;5个基因(FeSOD、PAL、EDS1、PR1和EIN3)诱导前后抗、感品种内的表达量均较低, 且抗、感品种间的表达量差异不显著。推测抗病品种宁RS-1对菌核病的抗性可能是由于PGIP的上调表达, 抑制了核盘菌PG蛋白对侵染部位油菜组织细胞壁的降解, 从而抑制了油菜菌核病的发生与蔓延。     

硫氧还蛋白基因对大麦发芽特性的影响

对转硫氧还蛋白基因(trxs)的大麦种子进行了生化指标测定及发芽特性研究。结果显示, 转基因大麦籽粒中硫氧还蛋h的活性是非转基因种子的3.3倍;水溶蛋白和醇溶蛋白中巯基含量的比率比非转基因种子都高;发芽时转基因籽粒中α-淀粉酶和β-淀粉酶活力比非转基因种子高;转基因种子的发芽势也明显高于对照。说明将trxs基因导入大麦能增强种子中硫氧还蛋白h的活性,改变与种子发芽相关的一些重要生化特性,并促进种子发芽。     

水稻LRR-RLK基因LP7的克隆及表达分析

LRR-RLK是类受体蛋白激酶RLK家族中最大的亚家族,在调控植物非生物胁迫等方面具有重要作用。为解析水稻LRR-RLK成员LP7(LOC_Os05g24010)在耐低磷胁迫中的作用,从水稻品种日本晴中克隆了LP7全长序列,分析其编码蛋白的氨基酸序列,研究其组织表达模式、亚细胞定位及低磷胁迫下的表达变化。结果表明,LP7基因全长2 832 bp,编码943个氨基酸,LP7蛋白具有典型的LRR-RLK成员特征,LP7蛋白与玉米中的同源蛋白NP_001131018同源性比较高,同源性高达77%。组织表达模式分析表明,LP7基因在根、茎、叶等组织中均表达,在叶中表达量最高。亚细胞定位结果表明,LP7蛋白定位于细胞膜上。实时荧光定量PCR分析表明,LP7基因受低磷胁迫诱导表达,其表达量较正常培养条件下增加15倍。初步推测该基因可能在水稻响应低磷胁迫中具有重要作用。     

丹参Ca~(2+)/H~+反向转运蛋白(SmCAX)基因家族鉴定与表达分析

CAX (Ca~(2+)/H~+exchanger antiporter)是一类重要的跨膜转运蛋白,在调控植物Ca~(2+)平衡,参与转运重金属离子中具有重要作用。研究丹参CAX家族基因的结构特征及表达特征有助于解析其功能。为揭示丹参CAX家族的功能,本研究运用生物信息学方法,结合丹参基因组和转录组鉴定出7个CAX家族成员。分析其编码蛋白质的理化性质、结构特征及亚细胞定位,以及不同组织中基因表达水平。结果显示,丹参CAX基因家族共包含7个成员,编码228～731个氨基酸,均为疏水性跨膜蛋白,二级结构以α螺旋为主,三级结构全为单体。亚细胞定位预测显示SmCAX蛋白主要分布在质膜或内质网膜上,其它部位也有少量分布。表达模式分析结果显示,丹参CAX家族成员表达模式差异较大:SmCAX3和SmCAX6在各组织中表达丰富,表达模式相似;SmCAX2和SmCAX5在叶组织中高表达,有明显的组织特异性;而SmCAX1与SmCAX4在野生丹参与栽培丹参中表达模式相反。本研究为今后深入阐释丹参CAX基因家族的功能提供了理论基础,并为运用基因工程技术改良丹参品质提供参考。     

拟南芥硫氧还蛋白M1型基因(AtTRX m1)与环境逆境之间的关系

硫氧还蛋白家族是约12 kD的小分子蛋白质,含有高度保守的活性反应位点WCG/PPC,催化硫醇一二硫键相互交换,调节细胞内的氧化还原作用.在本研究中,通过RT-PCR法获得目的基因拟南芥硫氧还蛋白M1型基因(AtTRX m1,GenBank Accession No.At1g03680).通过Northern杂交分析拟南芥悬浮细胞系在100 mmol/L NaCl、10 mmol/L NaHCO3、50 μmol/L ABA、10 mmol/L H2O2等逆境处理下mRNA表达水平的变化和硫氧还蛋白M1型转基因植株对NaCl、NaHCO3盐及ABA逆境的抗性分析,表明硫氧还蛋白M1型基因与生物环境胁迫有一定的相关性,尤其是氧化胁迫,能够增强植物对逆境的耐受力.从而为进一步研究硫氧还蛋白基因家族与逆境之间的相关作用奠定了基础.     

用根癌农杆菌介导法转化大豆萌动子叶节细胞

利用根癌农杆菌转化萌动大豆成熟子叶节获得了高频率的转基因大豆。从萌发12～16 h的大豆种子切取半片种子作为目标组织,对其子叶节组织进行伤处理后,接种于含有pGB载体的LBA4404农杆菌溶液。pGB载体含有除草剂（phosphinothricin, PPT）抗性基因bar和绿色荧光蛋白基因sgfp。将接种的外植体分别在含有3或5 mg/L PPT的芽诱导培养基、3 mg/L PPT的芽伸长培养基及2～4 mg/L PPT的根诱导培养基上进行了筛选。利用萌发5 d的外植体进行PPT浓度筛选的结果表明,芽诱导、芽伸长及根诱导阶段的PPT浓度分别为5、3及3 mg/L时,转化效率达到最大值,为5.3%。PCR和Southern杂交结果证实了外源基因稳定地整合在大豆基因组中。Northern杂交和GFP分析结果表明被整合的外源基因在大豆细胞中得到了稳定的表达。成熟植株对体外喷洒100 mg/L PPT溶液产生抗性。转化效率达8.9%。     

白菜型冬油菜铜锌超氧化物歧化酶(Cu/Zn-SOD)基因的克隆及其在低温条件下的表达分析

超氧化物歧化酶(SOD)是一种逆境条件下清除细胞内活性氧的关键酶,而铜锌超氧化物歧化酶(Cu/Zn-SOD)是该酶系中最主要的活性氧清除剂,与植物的抗逆性关系密切。本研究根据已发表的十字花科植物Cu/Zn-SOD基因的编码区设计引物,采用RT-PCR克隆超强抗寒冬油菜陇油7号Cu/Zn-SOD的cDNA序列,该基因全长459 bp。生物信息学分析表明,该基因与甘蓝型油菜(Brassica napus) Cu/Zn-SOD基因同源性高达99%,编码1个亲水性稳定蛋白,无跨膜结构域和信号肽,具有胞质Cu/Zn-SOD超基因家族特有的序列特征和保守结构区域。半定量RT-PCR以及SOD酶活性分析表明,低温诱导条件下Cu/Zn-SOD基因差异表达,在白菜型冬油菜适应低温胁迫过程中发挥重要作用。超强抗寒冬油菜陇油6号品种低温诱导蛋白的SDS-PAGE分析以及蛋白串联质谱技术鉴定表明Cu/Zn-SOD是受低温诱导表达的抗逆基因。     

水稻OsURGT2基因的克隆、表达及功能预测分析

植物细胞中核苷酸糖转运蛋白(NST)将胞质溶胶中的核苷酸单糖转运至高尔基体或内质网内,这对于植物细胞壁非纤维素多糖合成时单糖的供应至关重要。本研究从水稻中克隆了一个含有NST蛋白结构域的基因,命名为OsURGT2。对OsURGT2蛋白的理化性质、结构特点、基因启动子中的顺式作用元件及表达模式等进行了预测及分析。结果表明,水稻OsURGT2基因的全长编码序列为1 008 bp,编码335个氨基酸。OsURGT2蛋白为疏水性蛋白,含有9个跨膜结构域和多个磷酸化位点,与一个GDP-甘露糖转运蛋白的三级结构较相似。OsURGT2基因对高、低温和盐胁迫处理有较强的表达响应、受多种植物激素(赤霉素,水杨酸,茉莉酸甲酯)处理诱导表达。结果说明,OsURGT2极有可能编码一个具有某种核苷酸糖转运活性的蛋白,并可能在水稻生长发育过程中应答逆境方面发挥重要作用。