小麦TaABC1L的克隆及表达特性分析

通过反向Northern筛查小麦旱选10号幼苗水分胁迫诱导表达的cDNA文库,选择一个在水分胁迫1、6和12 h均上调表达的cDNA克隆作为“种子”序列,利用电子延伸和RT-PCR方法,获得一个开放阅读框为1 434 bp,编码477个氨基酸的cDNA序列。由该序列推测编码的蛋白含有1个典型的ABC1保守域（123~243氨基酸）和1个AARF域（42~369氨基酸）,但是没有发现ABC1向线粒体转移的信号肽前体序列（PD017350）,因此,将该基因命名为TaABC1L。同源比对结果表明,TaABC1L只与水稻、拟南芥中4个尚未研究功能的基因编码的氨基酸序列高度同源。实时定量RT-PCR结果显示,TaABC1L对渗透、高盐、低温等逆境胁迫和ABA处理均表现出应答反应,但是在不同胁迫条件下表达高峰出现的时间和表达强度上存在差异。其中受NaCl胁迫1 h,基因的表达量已达到对照的30倍,之后其表达量迅速回落,但仍高于对照;受ABA诱导时,其表达量略有增加,在12 h的最高表达量也仅为对照的2倍。     

小麦TaSPP基因的克隆及表达分析

为明确磷酸蔗糖磷酸酶基因(SPP)的表达特征和生物学功能,进一步了解SPP参与蔗糖生物合成的调控机制。以小麦抗旱品种晋麦47的cDNA为模板克隆出3个位于第5同源群上的TaSPP同源基因,分别命名为TaSPP-5A、TaSPP-5B和TaSPP-5D。并利用生物信息学对小麦TaSPP的理化性质、基因结构、顺式作用元件、系统进化树和蛋白保守结构域等进行分析,通过qRT-PCR分析基因TaSPP的表达模式。结果表明,TaSPP-5A、TaSPP-5B、TaSPP-5D都包含8个外显子和7个内含子,TaSPP-5A和TaSPP-5D编码422个氨基酸,TaSPP-5B编码413个氨基酸。系统进化分析显示,小麦TaSPP基因与小麦的近缘物种在进化上处于同一分支,相似度较高。qRT-PCR表达分析结果显示,TaSPP基因在根、茎秆、旗叶、叶鞘、颖花、种子中均表达,其中在旗叶和茎秆中表达量较高;ABA、PEG-6000、NaCl和IAA胁迫均能诱导TaSPP基因的表达,表明小麦TaSPP基因可能在逆境胁迫过程中发挥重要作用。     

马铃薯非特异性脂质转移蛋白基因StLTPa1的克隆和表达

非特异性脂质转移蛋白(nsLTP)是植物中大量存在的小分子脂类结合蛋白, 具有多种生物学功能, 如抗菌防御、信号传导、胞壁松弛、蛋白酶抑制等。通过接种青枯菌(Ralstonia solanacearum), 从马铃薯栽培品种中薯3号中获得一个新的非特异性脂质转移蛋白cDNA克隆StLTPa1, 序列分析表明该基因含636 bp核苷酸, 编码91个氨基酸, 属于I类非特异性脂质转移蛋白。基于氨基酸序列构建的系统发生树揭示, 该基因与其他茄科nsLTP具有高度保守的序列相似性, 核酸和氨基酸水平分别具75%~85%和60%~92%的同源性。对该基因在互作早期基因表达时空性分析表明, StLTPa1基因不仅受病菌的诱导, 在不同抗、感病的马铃薯基因型中差异表达, 而且受一定浓度外源非生物激发子如水杨酸、茉莉酸和脱落酸的诱导并产生一定时间的持续效应, 其诱导表达模式也表现出一定的差异。原位杂交结果显示StLTPa1主要在马铃薯茎、叶维管束系统的韧皮部细胞中表达。这些结果说明StLTPa1基因受病菌和非生物激发子诱导, 在植物防御反应中发挥作用。     

烟草SKP1基因cDNA的克隆分析及原核表达

应用DDRT-PCR法获得可被壳寡糖诱导的枯斑三生烟SKP1基因cDNA的3’端序列,通过5’ RACE扩增该基因cDNA的5’ 端,进而扩增此基因cDNA的全长,通过同源性比较分析,与本塞姆氏烟草的SKP1基因同源性达81%,其cDNA全长653 bp(GenBank登录号：AY702087),其中编码区位于73~540 bp,编码一条155个氨基酸的多肽。经预测该多肽的分子量为17 527.78 Da,等电点为4.57,定位于细胞质,功能结构域分析结果显示在4~105位氨基酸有一明显的Skp1结构域,其E值为1.25e-52,因此推断该基因为枯斑三生烟的SKP1基因。将该基因编码区亚克隆到原核表达载体pET23b(+)上,转化大肠杆菌BL21(DE3),表达出与预测分子量一致的蛋白。为进一步研究该基因的功能奠定了基础。     

小G蛋白Rab2基因参与小麦抗叶锈病反应的研究

为了解叶锈菌侵染小麦后小G蛋白Rab2基因的表达情况,明确其与抗病性的关系,从分子水平上探讨小麦的抗叶锈病机制。以普通六倍体小麦近等基因系TcLr1和叶锈菌小种05-22-64①和05-8-63①为试验材料,构建小麦亲和与非亲和组合,利用实时定量PCR技术对小麦小G蛋白Rab2基因的表达情况进行检测。结果表明:在小麦叶锈菌侵染过程中,Rab2基因主要在侵染的前期表达迅速,随着时间的推移表达量有所下降。非亲和叶锈菌菌株可以诱导小G蛋白Rab2基因表达量的升高,而亲和叶锈菌菌株抑制小G蛋白Rab2基因的表达。由此表明,小G蛋白可能与寄主和病原物的亲和程度有着直接的关系。     

小麦G2-like转录因子家族基因鉴定与表达模式分析

Golden2-Like (G2-like)转录因子,是属于MYB类转录因子中GARP超家族的成员,在调节叶绿体发育中起重要作用。本研究利用生物信息学方法对小麦G2-like基因进行了全基因组鉴定,并对其理化性质、亚细胞定位、启动子顺式作用元件及对非生物胁迫和激素的响应模式进行了分析。从小麦中共鉴定出87个G2-like基因,不均匀的分布在小麦21条染色体上,系统发育分析将这些基因分为14个亚族。蛋白质二级结构预测表明,小麦G2-like基因的氨基酸序列均以α螺旋和随机卷曲为主要结构。启动子顺式作用元件分析表明其上游2 kb区域含有7种(P-box、SpI、LTR、ABRE、MBS、TGA-element和AE-box)与逆境胁迫诱导相关顺式作用元件。其中Ta3AG2-like19含有顺式调控元件结合位点最多,一共有18个结合位点。qRT-PCR验证发现,Ta3AG2-like19、Ta3AG2-like20、Ta4AG2-like29和Ta6AG2-like52在PEG和盐胁迫下以及GA、IAA和ABA激素诱导下表达量显著上调,这些基因可能介导了小麦对多种非生物逆境的响应。     

陆地棉小GTP结合蛋白基因GhRop4的克隆及其表达分析

【目的】对陆地棉小GTP结合蛋白基因(Small GTP-binding protein)GhRop4(AY965614.1)在多种逆境胁迫下的应答表达模式进行研究分析,为棉花抗逆相关基因克隆及棉花抗逆分子机制研究奠定基础。【方法】利用生物信息学方法分析了GhRop4基因的结构特征和进化树关系,并通过荧光定量PCR(Real-time quantitative polymerase chain reaction,qRT-PCR)的方法分析Gh Rop4基因的组织表达特异性和不同逆境诱导条件下的表达模式。【结果】以陆地棉c DNA为模板克隆得到GhRop4基因,其开放阅读框为588 bp,编码包含195个氨基酸残基的Ⅰ型Rop蛋白。氨基酸多重序列比对表明,GhRop4与其它植物Rop蛋白高度同源,符合Rop蛋白结构特点。qRT-PCR分析表明,GhRop4基因在棉花幼苗根、茎、叶、子叶和下胚轴中均有表达,且在子叶和茎中表达水平较高。GhRop4基因对高盐、干旱、低温和棉花黄萎病菌处理都有一定程度的响应。【结论】Gh Rop4基因在陆地棉的逆境胁迫适应过程中可能具有重要的作用。     

TaMyb2-Ⅱ基因在普通小麦(Triticum aestivum L.)及其近缘种中的单核苷酸多态性分析

以39份抗旱性不同的普通小麦、5份A基因组材料、4份拟斯卑尔脱山羊草（Aegilops speltoides）、6份粗山羊草（Aegilops tauschii）和2份四倍体小麦,分析TaMyb2基因的核苷酸序列长度多态性和单核苷酸多态性,及其与抗旱性的关系。结果发现,TaMyb2在A基因组材料中无目标片段扩增,在其他材料中检测到Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ 3种类型序列。经详细分析,TaMyb2-Ⅱ序列长1 606 bp,在供试材料77 088 bp的核苷酸序列中包括34个单核苷酸变异,其中26个SNP,8个InDel,二者出现的频率分别为1/2 965 bp和1/9 636 bp,编码区π值（0.00055）小于非编码区的π值（0.00185）, 说明编码区的遗传变异小于非编码区的遗传变异。从SNP水平上分析,发现普通小麦与其D基因组供体种粗山羊草及四倍体小麦的亲缘关系较近,与B基因组供体种拟斯卑尔脱山羊草的亲缘关系较远。48份材料的TaMyb2-Ⅱ序列共分为18个单倍型（haplotype）,其中haplotype 2、3、5、6、8、9均为旱地栽培的普通小麦品种,说明普通小麦TaMyb2-Ⅱ的这几个haplotype结构可能与抗旱性有关。     

棉花4个GL2同源基因的序列比较及表达分析

拟南芥GLABRA2(AtGL2)在决定拟南芥叶毛和根毛细胞的分化中起重要作用。通过同源序列查询从棉花的EST库中找到4个与AtGL2高度同源的全长编码序列(GhHOX1、GhHOX2、GhHOX3和GhHOX4)。序列分析表明4个棉花HOX基因与AtGL2基因Homeobox结构域相同氨基酸分别达到95%、71%、72%和63%。实时RT-PCR分析结果显示, GhHOX1、GhHOX3和GhHOX4均在伸长期的纤维中优势表达; 而GhHOX3在开花当天野生型胚珠中的表达量明显高于无绒无絮突变体。说明棉花GL2同源基因在棉花纤维的起始和伸长中具有重要的调控作用。     

小麦转录因子基因TaMYB70的分离和表达分析

为了探究小麦MYB转录因子基因TaMYB70的功能,采用同源克隆方法分离TaMYB70（MK024291）基因cDNA序列,运用生物信息学手段分析该基因序列特征,采用实时荧光定量反转录PCR（qRT-PCR）检测其在不同逆境胁迫下的表达模式。结果表明,分离得到的TaMYB70部分序列长度为1 272bp,包含一个长度为1 008bp的开放阅读框,编码335个氨基酸残基。TaMYB70蛋白含有2个螺旋-转角-螺旋结构的Myb-type HTH DNA结合结构域。TaMYB70氨基酸序列与粗山羊草、二穗短柄草等植物MYB44同源性较高,与拟南芥R2R3-MYB转录因子第22亚族成员属于同一分支。qRT-PCR分析表明,TaMYB70在脱落酸胁迫下表达量升高,在PEG和NaCl胁迫下表达量下降,该转录因子可能参与小麦逆境胁迫应答。     

小麦小G蛋白Tarab5B基因全长cDNA克隆及表达特性的初步分析

通过对白粉病菌诱导的小麦叶片cDNA文库的测序,获得1个与水稻Rab5B基因一致性达89%的序列.以该序列为信息探针,筛选小麦EST数据库并进行电子拼接.根据拼接结果设计引物,利用RT-PCR方法获得了1个小麦中尚未鉴定的全长cDNA克隆Tarab5B.Tarab5B基因编码的蛋白具有结合GTP/GDP的4个保守结构域以及Rab家族成员所特有的结构域.同源分析表明,该基因属于Rab5B亚族.麦类Rab5B蛋白的GDSGVGKS、DTAGQE、NKAD、ETSA和MGCSSS 5个结构域在进化上非常保守,而YYRGA结构域及其邻近的C端6个氨基酸残基在小麦材料间同源性很低.RT-PCR检测显示,抗、感两个材料Tarab5B基因在接种后24 h和未接种24 h的表达水平基本相同;在接种后1 h、4 h、7 h、12 h,抗、感两个材料间Tarab5B基因的表达水平有一定差异.     

小麦蛋白磷酸酶2A基因TaPP2AbB″-α启动子的克隆及表达分析

植物蛋白磷酸酶2A(protein phosphatase 2A,PP2A)由结构亚基A、调节亚基B和催化亚基C组成,在应答逆境胁迫途径中发挥着重要作用。小麦基因Ta PP2Ab B″-α是调节亚基亚家族B″的成员,过量表达该基因可以促进拟南芥的根系生长及侧根发育,在盐胁迫和渗透胁迫条件下的作用更显著。本研究从小麦(Triticum aestivum L.)抗旱品种"旱选10号"基因组中克隆了Ta PP2Ab B″-α基因的启动子PB″α,序列长度为1899 bp,含有TATA-box和CAAT-box,以及响应干旱和渗透胁迫的顺式作用元件EECCRCAH1(?1058 bp至?1052 bp)、GCCCORE(?1073 bp至?1068 bp)和MYCCONSE(?1179 bp至?1174 bp)。将启动子PB″α和5种5′端缺失启动子片段与报告基因GUS(β-glucuronidase)连接后转化拟南芥,组织化学染色结果显示PB″α在植株的叶片和根中均有表达。5′端缺失分析表明缺失片段PB″α-1545和PB″α-1389具有启动子活性,活性区域位于?1389 bp和?946 bp之间。GUS定量分析结果显示,在盐和渗透胁迫条件下,PB″α、PB″α-1545和PB″α-1389的活性显著上升。本研究表明PB″α具有较强的启动子基本活性,并且在盐胁迫及渗透胁迫条件下活性显著上升,该结果为合理选用启动子改良作物提供了依据。     

小麦类钙调素TaCML8-A基因的克隆和表达分析

为挖掘小麦抗逆基因,研究类钙调素基因在植物抗逆反应的分子机制,利用电子克隆结合RT-PCR的方法克隆小麦类钙调素基因TaCML8-A.生物信息学分析显示,该基因的CDS区全长为519 bp,编码172个氨基酸,包含PTZ00184和FRQ1超家族,含有4个EF-hand结构域,其中包含4个钙离子结合位点;编码蛋白质分子...     

参与ABA调控小麦种子胚休眠的dehydrin基因的分离与表达分析

dehydrin蛋白是一个通过双向电泳分离出的参与ABA调控种子休眠过程的ABA反应蛋白。本研究利用二级质谱技术（Q-TOF2）获得了dehydrin蛋白的部分肽段序列,以此设计特异引物在万县白麦子中分离了其全长cDNA序列。与来自于durum小麦中的同源蛋白在DNA水平以及氨基酸水平进行序列比对,发现在3’与5’端以及编码区域都存在碱基变异。进一步从mRNA水平分析了dehydrin基因的表达变化与种子休眠性状的表达之间的关系,结果表明,该基因在转录水平上的表达特性与翻译水平一致,说明该基因早在转录水平就受ABA调控从而参与休眠性状的表达。     

小麦TaPHYA基因亚家族的克隆及表达分析

光敏色素是一类与作物农艺性状密切相关的基因家族。本研究克隆了中国春小麦光敏色素TaPHYA1、TaPHYA2和TaPHYA3基因完整的编码序列,并对它们进行了生物信息学以及转录分析。在NCBI数据库中对其推测的氨基酸序列进行BLAST分析,发现TaPHYA1和TaPHYA3氨基酸序列中包含光敏色素基因完整的功能结构域。系统进化树分析表明,小麦TaPHYA1、TaPHYA2和TaPHYA3之间进化关系相近,且与单子叶植物玉米、水稻的PHYA聚为一个亚类。另外,TaPHYA的表达丰度具有组织特异性,在茎、叶、穗中表达量分别是根中的1.35、0.34和0.87倍;而在同光质条件下,其表达丰度也具有光质特异性,TaPHYA的总表达量在黑暗和远红光条件下最高,在蓝光条件下次之,而红光和白光条件下最低。该结果为深入研究小麦光敏色素A基因亚家族的功能奠定了基础。     

蒙古扁桃编码Ca~(2+)结合蛋白基因的系统性鉴定和表达分析

为进一步解析蒙古扁桃抗逆境的遗传机理,采用高通量转录组测序技术,结合生物信息学和基因表达分析,在蒙古扁桃体内鉴定到16个编码Ca~(2+)结合蛋白的全长转录本,包括4个Ca~(2+)ATPase(ECA/ACA),3个具有多个跨膜域的新型Ca~(2+)通道蛋白(ERD),5个Ca~(2+)/H+反向转运蛋白(CAX),2个Ca~(2+)依赖的蛋白激酶(CPK)和2个钙调素蛋白(CAM),它们的结构域同拟南芥同源蛋白基本相同。ERD、CAX、CPK和CAM各有1个基因在蒙古扁桃根和叶中有明显表达,其中的ERD、CPK和CAM类的基因表达在不同程度上受干旱和盐胁迫调节,说明有可能调节蒙古扁桃的抗逆能力。     

玉米干旱诱导表达基因ZmCKS2的克隆与表达分析

在本实验室前期研究的干旱胁迫相关的抑制差减文库(SSH)中,发现一个玉米干旱胁迫诱导表达的EST序列,与拟南芥AtCKS2和AtCKS1基因有较高的同源性。应用生物信息学手段和同源克隆的方法,分离得到该基因,命名为ZmCKS2。序列分析表明该基因开放阅读框区267bp,编码88个氨基酸。ZmCKS2蛋白含有真核生物中高度保守的CKS(cyclin-dependent kinase regulatory subunit)结构域。应用在线分析软件预测该基因上游2kb序列表明,该序列具有启动子的核心序列和增强子序列,同时还具有与干旱等多种逆境胁迫相关的调控序列。应用实时荧光定量PCR分析表明该基因在幼穗中表达量最高,且受干旱和MeJA诱导上调表达,受低温和外源ABA诱导下调表达。