荧光定量PCR方法检测IBV病毒在CEK多细胞中的动态变化

为揭示鸡传染性支气管炎病毒（IBV）在鸡胚肾细胞（CEK）中复制增殖的动态变化规律,通过实时荧光定量PCR（FQ-PCR）检测IBV病毒感染CEK3、6、12、24、36、48、72h后病毒增殖量的动态变化。结果显示,随着时间增加,IBV病毒增殖出现规律性变化,3～12h时IBV增殖不明显,36h时IBV开始大量复制,48h时达到高峰,但72h后有所下降。试验表明IBV在细胞内复制增殖的最佳时间在接毒后48h,其复制增殖情况与细胞状态负相关。     

IBV荧光定量PCR检测方法的建立及对感染鸡体内病毒的检测

IBV（infectious bronchitis virus）属于冠状病毒γ群,可以引起鸡的呼吸道疾病,造成严重的损失,现在对IBV诊断方法的研究进行得十分广泛,建立了多种方法。本研究建立了IBV的Real-Time PCR检测方法,最低检测灵敏度为10 copies/μL,可以有效地区别其他禽源病毒,板内差异为0.1%～0.7%,板间差异为0.7%～1.6%,证明该方法具有较高的灵敏性、特异性和稳定性,并对分离到的野毒株ck/HHLJ/HH13进行了病毒感染试验的检测,在鸡体内的气管肺脏肾脏中都具有较高的浓度,其中气管和肾脏中病毒的滴度一直维持很高的水平,至感染后21 d才逐渐消失,病理组织学可见肾脏和气管病变最严重,证实了所分离到的野毒株ck/HHLJ/HH13是具有很强毒力的肾型IBV毒株。     

实时荧光定量PCR方法检测猪繁殖与呼吸综合征病毒和猪瘟病毒

根据GenBank发表的猪瘟病毒(CSFV)和猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)的保守区域的序列分别设计了2对特异性引物。建立了一种快速检测CSFV和PRRSV的SYBR GreenⅠ实时荧光定量PCR方法,并用该方法检测采集的临床疑似病料。结果表明,建立的CSFV、PRRSV-SYBR GreenⅠPCR有较好的特异性,敏感性和重复性,可以用于CSFV和PRRSV的检测。     

两种荧光定量PCR方法检测猪瘟病毒的比较及应用

根据猪瘟病毒（Classical swine fever virus,CSFV）5端非编码区保守区域,设计猪瘟病毒特异性的引物和探针,建立了基于SYBR Green和TaqMan探针的两种荧光定量PCR检测方法。灵敏性和特异性试验结果表明,两种方法能够特异性地检测出不同型的猪瘟病毒,而对同属的牛病毒性腹泻病病毒以及其它一些主要猪病病原检测结果均为阴性。两种方法对猪瘟病毒C株的检测下限均为101TCID50,均高于常规的套式PCR。用携带该基因片段的重组质粒为模板进行检测,SYBR Green方法的检测下限为3×100copies,比TaqMan探针方法更加灵敏（3×101copies）。应用建立的SYBR Green方法对2009年采集于浙江地区不同猪场的20份病猪样品进行CSFV检测,有8份样品为阳性,与套式PCR方法检测结果一致。进一步应用SYBR Green方法对不同感染阶段细胞内病毒RNA复制水平进行检测,与病毒滴度的结果基本一致。因此,本研究建立的SYBRGreen荧光定量PCR检测方法能够应用于组织和培养细胞中猪瘟病毒的检测。     

猪瘟病毒荧光定量PCR检测方法的建立

通过RT-PCR方法克隆了猪瘟病毒(CSFV) 5′端非编码区(UTR)的一段靶序列,构建重组质粒作为标准阳性模板.同时根据GenBank中的靶序列设计了用于FQ-PCR的一对引物和一条TaqMan探针.通过条件优化,以定量的10倍系列稀释的质粒为标准品进行荧光定量PCR扩增并制作标准曲线,建立了CSFV检测的荧光定量PCR方法.结果表明,该方法检测灵敏度可达1.0×100拷贝/μL,线性范围为 109～100,达10个数量级;对起始浓度为1.0×109、1.0×108、1.0×107拷贝/μL的标准品的最终实际测得值(Ct)分别为19.73、22.95和26.24;变异系数分别为0.61%、1.77%和1.18%,均小于5%,说明此方法具有良好的准确性和重现性.对阳性组织病料的检测表明,该方法的检测灵敏度高出常规PCR,与套式PCR具有相近的灵敏度.     

实时荧光定量PCR检测猪细小病毒

根据已报道的猪细小病毒基因组序列,设计并合成了引物和探针,从猪细小病毒(PPV)感染的细胞中提取DNA,经PCR扩增,产物纯化后与pGEM-T-easy连接,转化大肠杆菌JM109,筛选后得到重组标准品质粒,对重组标准品质粒进行PCR和测序鉴定,表明目的片段已经成功克隆.将104～108拷贝反应的重组标准品质粒进行荧光定量PCR,系统自动分析软件显示Ct值与标准品浓度的对数之间存在良好的线性关系.动力学曲线分析表明,在该反应体系和反应条件下,标准曲线的灵敏度为102拷贝.本方法的建立为猪细小病毒感染的早期诊断奠定了基础.     

口蹄疫病毒TaqMan荧光定量PCR检测方法的建立

为建立检测口蹄疫病毒(FMDV)的方法,本研究根据GenBank中FMDV的2B基因序列,设计合成一对引物和一条TaqMan探针,将2B基因克隆到pBlueScriptSK(-)载体中,利用T7体外转录试剂盒制备标准品,通过优化反应条件,建立了TaqMan荧光定量PCR检测方法.结果表明,该检测方法的敏感性达到102拷贝/μL;与其它主要相关病毒均不发生交叉反应,批内和批间试验重复性的变异系数(CV)均小于3％.本研究建立的FMDV TaqMan荧光定量PCR方法对FMDV的快速检测具有重要意义.     

检测鼠或鼠源细胞中坦布苏病毒荧光定量PCR方法的建立

利用DNAStar对GenBank上发布的坦布苏病毒(TMUV)的E基因进行序列分析,根据分析结果选择其保守区域设计1对特异性引物。按照相同的方法,设计另1对鼠源内参基因β-actin的引物。通过PCR扩增获得E和β-actin的部分片段,分别与pMD18-T载体连接,构建重组质粒,经鉴定、纯化后作为阳性标准品,分别用于实时荧光定量PCR中E基因及内参基因β-actin标准曲线的构建。通过对反应条件进行优化,建立了以β-actin为内参基因的检测鼠或鼠源细胞中TMUV的SYBR GreenⅠ实时荧光定量PCR方法。该方法对TMUV的最低检出量为10个拷贝,比普通PCR高1 000倍;批内和批间重复性试验的变异系数均小于0.45%;特异性试验的结果表明,该方法只能检测到TMUV的扩增曲线。对50份样品进行检测,该方法的检出率为100.00%(普通PCR为87.50%),并对组织中病毒载量进行了相对定量,进一步说明了该方法的敏感性高,可用于试验样品的检测,为研究该病毒对哺乳动物的致病特性提供特异性的检测方法。     

非洲猪瘟病毒TaqMan探针法荧光定量PCR检测方法建立

为建立一种快速、准确的非洲猪瘟病毒(ASFV)分子检测方法,以2018年8月分离的SY18毒株P72基因序列(GenBank登录号:MH713612.1)为参考毒株,人工合成质粒标准品,命名为pcDNA3-P72,基于该毒株P72基因序列,在1627~1876 bp处设计一对特异性引物和TaqMan探针,优化反应体系及条件,本研究成功建立了基于P72基因的TaqMan探针qPCR方法,并与OIE的特异性引物和TaqMan探针进行灵敏度、稳定性和特异性比较.结果显示:本研究建立的qPCR检测方法,标准曲线线性关系良好,R^2值可达到0.9932,灵敏性最低能检测到10 copies/μL,与OIE引物扩增灵敏度相当,比普通PCR方法高100倍.该方法重复性良好,批内和批间变异系数均小于1%.这一方法为我国非洲猪瘟疫情的快速确诊提供了必要的分子诊断工具.     

猪瘟病毒荧光定量PCR检测方法研究进展

实时荧光定量PCR技术是结合PCR技术、光谱技术和计算机技术发展起来的一种新型分子生物学定量检测技术,其融合了PCR技术的高灵敏性、DNA杂交的高特异性和光谱技术的高精确定量的特点,它不仅实现了对核酸模板的定量,而且具有特异性强、灵敏度高、重复性好、准确性高、自动化程度高、速度快、全封闭反应、无污染等优点,在猪瘟疫苗的定量检测、猪瘟的诊断以及猪瘟病毒强、弱毒株鉴别诊断中得到了广泛应用,显示出了良好的应用前景。论文就荧光定量PCR技术及其在猪瘟诊断上的应用做一简要综述,为我国猪瘟的综合防控提供参考。     

不同毒株鸡传染性支气管炎病毒与鸡新城疫病毒接种鸡胚联合培养相互作用研究

本实验目的在于探讨不同毒株鸡传染性支气管炎病毒和鸡新城疫病毒混合接种同一鸡胚尿囊腔培养时二者之间的相互作用。分别将按２００倍、５００倍、１０００倍不同浓度稀释的鸡传染性支气管炎病毒Ｆ３株、肾型Ｊ株、Ｈ１２０２８／８６株,Ｈ５２和Ｈ１２０株和１００倍稀释的Ｌａｓｏｔａ鸡新城疫病毒联合接种到１０日龄鸡胚尿囊腔,同时设单独培养作对照,９６小时后收取尿囊液,用对流免疫电泳法检测鸡传染性支气管炎病毒效价,用血球凝集试验检测尿囊液鸡新城疫病毒效价。结果表明,鸡新城疫病毒对鸡传染性支气管炎病毒增殖无明显促进作用,但无抑制现象;鸡传染性支气管炎病毒浓度过大时,对鸡新城疫病毒有一定抑制作用,在适当浓度时二者之间无干扰作用。以ＮＤＶ１００倍ＩＢＶ１０００倍稀释混合作用后联合接种培养对二者效价均无明显干扰,ＮＤＶ血凝效价可达１１ｌｏｇ２,ＩＢＶ对流免疫电泳沉淀效价可达９ｌｏｇ２,效果最佳。联合培养省时、省力、节约鸡胚损耗。     

黄芩抑制鸡传染性支气管炎病毒增殖的作用机制研究

为研究黄芩乙醇提取物对鸡传染性支气管炎病毒(IBV)的体外抑制作用及对IBV感染细胞内抗病毒基因表达的影响,进行以下试验:①以人肺癌H1299细胞为供试细胞,在IBV感染过程中在细胞培养体系中加入一定量的黄芩乙醇提取物,24 h后检测病毒增殖量;②将黄芩乙醇提取物稀释成4个不同浓度,观察不同浓度的提取物对IBV的抑制作用;③用RT-PCR检测黄芩乙醇提取物对IBV感染细胞内抗病毒基因OASL、IFI27、STAT1表达的影响。结果显示:黄芩乙醇提取物对IBV具有明显的抑制作用,且药物浓度越高抑制作用越明显;此外,黄芩乙醇提取物可增加IBV感染细胞内抗病毒基因的表达量。     

鸡腺胃型传染性支气管炎病毒（QX IBV）的分离和鉴定

１９９６年９月份以来,青岛地区鸡群发生一种新病,通过鸡胚育５代－６代,电镜观察,动物回归和免疫保护试验,用气管环组织培养进行理化特性测定,毒价测定,中和试验,证明目前流行的以腺胃肿大为主要特征的传染病的病原是冠状病毒,因为引起腺胃的特征性的病理变化,将此病暂定名为腺胃型传染性支管炎,将青岛分离株定主要特定的ＯＸ株。     

鸡传染性支气管炎病毒N蛋白研究进展

鸡传染性支气管炎病毒(IBV)是严重危害养鸡业的重要病原之一.近年来国内外学者在分子生物学领域方面的研究不断深入,在病毒基因组的结构与功能及其N蛋白的研究方面取得了重要进展.对N蛋白如何特异性地识别病毒基因组RNA、参与病毒RNA的复制和包装、诱导IBV体液和细胞免疫应答的机制、IBV新型基因工程疫苗研制以及IBV的抗体水平监测等方面的研究,为IBV基因工程疫苗设计及其免疫防控提供了科学依据.     

RT—PCR一步法检测鸡传染性支气管炎病毒的研究

根据已发表的ＩＢＶＳ基因核苷酸序列,自行设计合成了一对跨幅约０．９ｋｂ的引物。该区段包括了Ｓ１基因Ｃ末端的４００ｂｐ和Ｓ２基因Ｎ末端的５００ｂｐ。用该引物对５株ＩＢＶ参考毒株Ｇｒａｙ、Ｍ４１、Ｈ１２０、Ｈ５２和ＭＡ５进行ＲＴ－ＰＣＲ一步法扩增均获得预期的ＰＣＲ产物,该引物的ＲＴ－ＰＣＲ灵敏度检测结果表明,可以检测出０．１１２ｐｇ／μＬ的模板。用该引物对３０个地方分离株进行检测,１８株呈阳性,与鸡胚传代及电镜观察结果一致。     

鸡传染性支气管炎ELISA抗体检测试剂盒的研制

采用加蔗糖垫离心纯化鸡传染性支气管炎病毒(IBV)制备抗原，用提纯的IBV抗原包被微量板，建立了检测鸡传染性支气管炎(IB)抗体的ELISA试剂盒。抗原、被检血清和酶标结合物的最佳工作浓度分别为10ug／ml、1：200和1：3200。与IDEXX试剂盒相比，其敏感性、重复性、特异性均接近国外同类产品水平。对SPF鸡血清、实验免疫与攻毒的SPF鸡血清进行检测，结果表明所建立的ELISA特异性为95．6％，与IDEXX试剂盒符合率为95．6％。用于检测抗IBV特异性IgG抗体发现在免疫接种IB弱毒苗后，第4天即可检测到IgG抗体，峰值在第3周。试验鸡在通过滴鼻、点眼途径人工感染IBV强毒后，第5天抗体滴度明显上升。我们认为，该法是目前我国SPF鸡质量监测、养鸡生产中进行IB监测较好的方法。     

鸡新城疫、传染性支气管炎二联油乳剂灭活疫苗试验研究报告(Ⅰ报)——NDV、IBV同胚培养繁毒效果试验

本研究根据NDV、IBV二种病毒能在鸡胚中繁殖的特点,通过筛选上述二种病毒的最适稀释比例,将混合毒种接种9~10日龄鸡胚尿囊腔内(筒称同胚培养),使接种鸡胚尿囊液96h二种病毒毒价同时达到高峰,每0.1ml尿囊液含NDV≥10~8EID_(50)、IBV≥10~7EID_(50).本试验用兔抗NDV、IBV血清抗体封闭相应病毒测定混合毒获得成功.本研究目的在于为制备鸡二联油乳剂灭活苗时改进繁毒方法,降低疫苗成本.     

IBV分离株部分S1蛋白基因的序列分析

参考GenBank上的IBVS1基因序列,自行设计合成了一对跨幅约0.6kb的引物,RT-PCR对6株IBV分离株的S1基因进行扩增。序列分析显示,这些病毒从时间、空间和组织嗜性都没有明显的规律可循。2株从传染性腺胃炎病鸡中获得病毒(ZC4-3株和DB239-1株)属于既不同于国内其他分离毒株,又不同于国际参考毒株的独立一群。通过对IBV的分析,认为现流行的IBV已发生了很大的变异,分别利用嗜肾性、嗜呼吸道性和嗜腺胃性的毒株研制疫苗,对我国IBV的防疫十分重要。     

中药提取液对鸡传支病毒的效果研究

为筛选抗鸡传染性支气管炎病毒的中药,我们对麻杏石甘散组方进行了加减,研制形成三个中药组方,并以其为试验药物,观察其在9～15日龄鸡胚上对鸡传染性支气管炎病毒IBV-M41株的作用效果。结果表明,在安全浓度范围内,三个组方对该病毒均有一定的阻断和抑制作用,其中组方1的阻断和抑制作用较为突出。