甘草提取物对叔丁基氢过氧化物(t-BHP)诱导的建鲤原代培养肝细胞损伤的保护作用

以肝(细胞)损伤为主要特征的鱼类肝胆综合症是水产养殖中日趋严重的病害之一,目前还没有有效的防治措施.本研究拟以叔丁基氢过氧化物(t-BHP)构建建鲤(Cyprinus carpio var.jian)原代肝细胞损伤模型,并利用该模型评价甘草(Glycyrrhiza glabra)提取物对t-BHP诱导的鱼类急性肝细胞损伤的保护作用.1 mmol/L的t-BHP与原代肝细胞共培养2h能显著提高肝细胞培养上清中谷丙转氨酶(GPT)、谷草转氨酶(GOT)、乳酸脱氢酶(LDH)和丙二醛(MDA)水平,显著降低谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-Px)和超氧化物歧化酶(SOD)的含量以及肝细胞增殖活性.在t-BHP诱导肝细胞损伤前(前处理)、损伤后(后处理)、损伤前和损伤后(前后处理)将不同浓度(0.1、0.2和0.4 mg/mL)的甘草提取物加入肝细胞培养液中,与肝细胞共培养2h,结果显示,前后处理时,不同浓度(0.1、0.2和0.4 mg/mL)的甘草提取物均能显著抑制t-BHP诱导的GOT、GPT、LDH和MDA水平的升高,恢复GSH-Px和SOD水平;前处理时,高浓度(0.4 mg/mL)的甘草提取物对抑制GOT、GPT、LDH和MDA水平的升高,恢复GSH-Px水平有显著效果;后处理时,只有高浓度(0.4 mg/mL)的甘草提取物能有效提高GSH-Px活性;中浓度和高浓度(0.2和0.4mg/mL)的甘草提取物在前处理、后处理及前后处理时均能显著提高肝细胞的增殖活力.研究的结果表明,中药与损伤剂的给予顺序影响着甘草提取物对肝细胞的保护作用,前后处理时甘草提取物对损伤肝细胞的保护效果明显优于前处理和后处理.研究证实了甘草提取物对t-BHP诱导的鱼类肝细胞损伤具有保护作用,对应用甘草提取物作为鱼类肝胆综合症的防治药物还需要进一步的在体研究.     

高温胁迫下水稻氨基酸态氮与铵态氮营养效应研究

在高温胁迫无菌砂培条件下对无机氮 (硫酸铵 )、有机氮 (甘氨酸 ,谷氨酸和赖氨酸 )和缺氮 (对照 )培养的水稻植株干物重、总氮量及其根、叶谷草转氨酶 (GOT)和谷丙转氨酶 (GPT)活性作了研究。结果表明 ,有机、无机氮均被水稻吸收 ,且吸收量相当。低浓度无机氮 (N 10mg/L)或有机氮培养 2 0d后的水稻植株总氮量比对照的高 50%以上 ;无机氮培养的植株干物重显著低于有机氮培养和对照 ,表明植株受NH4+毒害。培养 15d后 ,多数有机氮培养的植株根或叶GOT或GPT活性显著高于对照 ,但根、叶间有较大差别 ;而无机氮培养的植株根GOT及根、叶GPT活性是对照的 2倍或以上。高浓度无机氮 (N 500mg/L)处理 6h后稻株根、叶GPT活性分别是对照的2.5和4倍 ,而高浓度甘氨酸 ,谷氨酸和赖氨酸态氮 (N 500mg /L)处理 6h后 ,根、叶GPT活性分别是对照的 5.7、9.4、1.9倍及1.8、2.3、1.4倍。     

银杏花粉黄酮组分分离纯化及其清除DPPH自由基能力

为了分离纯化银杏花粉中具有潜在抗氧化活性的黄酮组分及研究其潜在抗氧化活性,该文对银杏花粉的总黄酮进行提取和分步萃取,采用1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl(DPPH)自由基清除率检测和组分分析锁定待纯化萃取相。通过DPPH-HPLC-PAD技术筛选目标清除自由基组分,并采用制备型液相色谱技术分离纯化这些组分,然后采用紫外可见吸收光谱、质谱、核磁共振氢谱、碳谱等技术进行结构鉴定,最后通过测定DPPH自由基清除率初步研究其潜在抗氧化活性。结果显示,银杏花粉粗提物具有清除DPPH自由基活性,对DPPH的半抑制率(IC50值)为1.32 mg/m L,乙酸乙酯相和正丁醇相的IC50值为0.46、0.84 mg/m L,分别是粗提物的34.85%和63.64%。可见,乙酸乙酯相的清除DPPH活性最高。进一步研究显示,乙酸乙酯相富集了6种主要银杏花粉黄酮,而且均具有清除DPPH活性。经纯化和结构鉴定分别为山奈酚-3,4’-双-O-β-D-葡萄糖苷(1)、山奈酚-3-O-β-D-葡萄糖基-7-O-α-L-鼠李糖苷(2)、山奈酚-3-O-β-D-葡萄糖苷(3)、山奈酚-3-O-α-L-鼠李糖苷(4)、柚皮素(5)和山奈酚(6)。其清除DPPH自由基的活性由高到低依次为:化合物6化合物2化合物3化合物4化合物1化合物5。其中山奈酚清除DPPH的IC50值为0.017 mg/m L,与维生素C及芦丁相比没有显著性差异(P0.05)。上述研究为银杏花粉功能成分的深入研究奠定了基础。     

赭曲霉毒素A引起HepG2细胞损伤及DNA甲基化水平降低

赭曲霉毒素A (ochratoxinA,OTA)是一种污染食品的真菌毒素,对许多动物具有肾毒性,肝毒性,免疫毒性,致畸和致癌作用.本研究以人肝癌细胞HepG2为体外模型,研究OTA引起的细胞损伤及对DNA稳定性的影响.MTT结果显示,OTA能抑制HepG2细胞的生长,存在时间剂量——效应关系.OTA引起细胞上清中酸脱氢酶(LDH),谷草转氨酶(GOT)和谷丙转氨酶(GPT)活性的升高,诱导细胞内活性氧(ROS)生成,降低超氧化物歧化酶(SOD)活力.彗星实验结果显示OTA引起DNA链断裂,形成拖尾现象.同时,本研究还首次研究了OTA对DNA甲基化的影响.HPLC/MS/MS结果显示,经OTA处理后的细胞,其DNA中5-甲基脱氧胞苷(5mdC)百分数显著低于对照组.这些结果表明OTA会抑制HepG2细胞生长,引起氧化损伤,破坏DNA的稳定性和完整性.本研究表明OTA引起的肝毒性可能与氧化损伤和DNA损伤有关.     

绿豆、小豆种质清除自由基作用的研究

为了解绿豆、小豆种质资源清除自由基的潜力,本文对我国26份绿豆品种、18份小豆品种清除自由基的活性及稳定性进行了研究。不同种质间清除DPPH·、·OH、02·-自由基的活性及还原力差异较大,2种豆清除·OH的活性和还原力基本相当,绿豆擅长清除02·-,小豆则擅长清除DPPH·,清除DPPH·的活性主要在种皮中,种皮与子叶清除·OH的活性差别不大;绿豆、小豆提取液于100℃煮30min或p H1.5下放置5h,清除DPPH·的活性分别保存95.2%~105.4%和85.4%~152.8%,清除·OH的活性分别保存93.6%~105.3%和37.6%~73.4%,小豆的稳定性高于绿豆;豆皮提取液常温下贮藏266d,其DPPH·清除活性保存81.5%~106.8%。本研究为我国绿豆、小豆种质的利用、加工以及清除自由基产品的开发奠定了基础。     

黑莓原花青素超声波辅助提取优化及抗氧化性研究

论文采用响应曲面法研究了超声波辅助提取时温度、时间、料液比、超声波功率及其交互作用对黑莓原花青素提取效果的影响,同时研究了黑莓原花青素对二苯代苦味酰自由基(DPPH)、·OH及·O2-的清除效果.用SAS软件确定了黑莓原花青素超声波提取的工艺参数为:提取温度为70.9℃,料液比为1∶9.14,时间为30.5 min,超声波功率为526.9 W.黑莓原花青素对DPPH、·O2-及·OH 3种自由基具有显著的清除效果,且明显优于茶多酚,当浓度为3.0 μg/mL时,对DPPH、·O2-及·OH 3种自由基的最大清除率分别可达到82.54%、79.90%和65.90%,且黑莓原花青素对3种自由基的清除效果与其浓度之间存在明显的量效关系.     

氮肥用量和插秧密度对寒地粳稻籽粒转氨酶活性及蛋白质含量的影响

试验以寒地粳稻牡丹江30、东农426、松粳14为材料,采用裂区设计,研究氮肥用量和插秧密度对寒地粳稻籽粒转氨酶活性、蛋白质含量、蛋白质产量及水稻产量的影响。结果表明:3个品种齐穗后籽粒谷草转氨酶(GOT)和谷丙转氨酶(GPT)活性呈单峰曲线变化,到达峰值时间不同;齐穗后21、28、35 d GOT活性和齐穗后14、21、28、35 d GPT活性分别与齐穗后21、28、35 d籽粒蛋白质含量呈显著或极显著正相关;籽粒蛋白质含量均随施氮量的增加而升高,插秧密度处理间差异不明显;综合水稻产量和蛋白质产量,牡丹江30最佳处理为N2D3(N 150 kg/hm2,30 cm×16.6 cm),东农426为N3D2(N 225 kg/hm2,30 cm×13.3 cm),松粳14为N3D1(N 225 kg/hm2,30 cm×10.0 cm)。     

铜藻多糖微波辅提工艺优化及其抗氧化活性研究

运用响应曲面法优化铜藻多糖(tong zao polysaccharide,TZP)微波辅助提取的工艺条件,利用分级醇沉法得到TZP30%、TZP60%和TZP80%3个多糖组分。并对其DPPH自由基、ABTS自由基、OH自由基和O2-自由基的清除能力及其还原力进行了研究。结果表明:铜藻多糖微波辅助提取的最佳条件为料液比1:65,提取温度72℃,提取时间39min,多糖提取率为12.02%(n=3);在试验浓度范围内,TZP30%组分对羟基自由基的清除能力最高达98.07%;TZP60%组分对DPPH自由基清除能力最高达85.01%;TZP80%组分对ABTS自由基清除能力较强,还原力较大。铜藻多糖具有较高的抗氧化活性,具有作为天然抗氧化剂的应用前景。     

枣果皮中酚类物质提取工艺优化及抗氧化活性分析

为提高枣果皮中的酚类物质的提取效率,该文以马牙枣为试验材料,对枣果皮中酚类物质提取条件进行了优化,同时通过测定酚类物质清除2,2’-二苯基-1-间三硝苯基联肼(DPPH),2,2'-连氮基双(3-乙基苯并噻唑啉)-6-磺酸(ABTS)自由基和铁还原能力,分析了枣果皮提取物中酚类物质的抗氧化活性。结果显示,枣果皮中酚类物质提取的最优条件是采用70%(V/V)的甲醇、在40℃下,以1∶60的料液比浸提4h,重复浸提2次。枣果皮中酚类物质具有很强的抗氧化能力,与合成抗氧化剂2,6-二叔丁基对甲酚(BHT)相比,虽然果皮中酚类物质清除ABTS·+自由基能力略低于BHT,但其清除DPPH自由基和铁还原能力与之相当。研究结果表明枣果皮中酚类物质具有很强的抗氧化能力,在一定程度上可以取代合成抗氧化剂BHT,应用于食品加工业。     

超声预处理大米蛋白制备抗氧化肽

为优化中性蛋白酶酶解大米蛋白制备抗氧化肽的工艺条件,采用超声波预处理大米蛋白.以1,1-二苯基-2-苦基苯肼(DPPH)清除率为响应值,用响应面分析法研究超声功率、超声处理时间和超声处理初始温度对制备抗氧化肽工艺的影响.同时研究了其抗氧化肽清除超氧自由基、DPPH、羟自由基能力及螯合Fe2 和还原能力.结果表明:最佳超声预处理大米蛋白的工艺为:超声功率1500 W、超声处理时间20 min、超声处理初始温度40℃,该条件下的抗氧化肽(2.2057 g/L)清除DPPH可达到74.8%,抗氧化肽得率为33.2%.与未经超声预处理比较,抗氧化肽得率提高了43.7%,DPPH的半抑制率(IC50)降低了17.7%.抗氧化试验表明,大米蛋白抗氧化肽清除超氧自由基、DPPH和羟自由基的IC50值分别为0.0678、0.9315和0.1173 g/L,分别是维生素C的IC50值的1.8、175.8和1.4倍;其螯合Fe2 的IC50值是乙二胺四乙酸的42.2倍,还原能力是维生素C的0.7倍.     

小鼠卵巢内细胞色素P450胆固醇侧链裂解酶的发生

利用免疫组织化学技术探讨了细胞色素P450胆固醇侧链裂解酶[P450（SCC）]在小鼠卵巢内的发生时相，研究发现15日龄的胎鼠卵巢内即存在P450（SCC）的免疫染色；出生前后卵巢内的基质细胞和前体颗粒细胞中均可检测到P450（SCC）的免疫染色，伴随卵泡发育，产后10d的小鼠卵巢次级卵泡膜细胞开始出现P450（SCC0的免疫染色，并随着日龄的增加而逐渐增强；临近性成熟小鼠卵巢内较大的有腔卵泡颗粒细胞也开始出现P450（SCC）的免疫染色。研究结果初步阐明了P450（SCC）在卵巢内的发生时相和表达模式；产后小鼠卵巢内P450（SCC）伴随次级卵泡膜细胞的形成而发生；优势卵泡排卵前的成熟发育进程中壁层颗粒细胞逐渐获得表达P450（SCC），进而分泌孕酮的能力。     

不同鳞翅目昆虫细胞色素P450基因(CYPs)的比较基因组学分析

细胞色素P450(cytochrome P450,CYP)涉及许多昆虫生理功能,包括对信号分子的代谢、宿主植物的适应性及杀虫剂的抗性等.鳞翅目(Lepidoptera)昆虫的种类仅次于鞘翅目(Coleoptera),包含了大量的农业害虫.根据鳞翅目烟草天蛾(Manduca sexta L.)的基因组数据,开展CYPs的全基因组学分析,在该基因组中发现了110个可能的CYPs,可分为29个家族,其中有大量CYPs以串联重复形式排列.将分析所得序列与蝶类昆虫黑脉金斑蝶(Danaus plexippus L.)和模式昆虫家蚕(Bombyx mori L.)的CYPs进行比较基因组学分析,结果表明,在CYP2与线粒体集团(clan)中存在12对CYPs直向同源基因,而CYP3与CYP4集团的CYPs呈现种属特异性扩增趋势.通过比较分析鳞翅目昆虫与其他非鳞翅目昆虫的CYPs发现,鳞翅目昆虫之间不仅存在更多的直向同源基因对,而且鉴别出的直向同源基因群也更多,但出现新的家族与亚家族数量相对较少.不同鳞翅目昆虫基因组中的CYPs存在相当广泛的线性保守现象.这些不同昆虫间的比较基因组学分析将促进鳞翅目昆虫CYPs的研究,也有助于害虫治理新靶标的选择.     

小麦微粒体对丙酯草醚的代谢作用初探

用5%乙醇和10mmol/L丙酯草醚诱导的小麦黄化苗茎部制备微粒体,与[C环-U1-4C]丙酯草醚保温反应,产物经乙酸乙酯萃取,HPLC-LSC分离测定,最后用HPLC-MS鉴定其分子结构,发现了3种与Smiles重排相关的14C标记丙酯草醚代谢物(Y1,Y2和Y3),据此推测丙酯草醚在小麦微粒体(细胞色素P450酶系)的作用下进行了羟基化。研究结果还表明,微粒体反应体系可能也有助于丙酯草醚的异构化作用。     

利用shRNA真核表达载体干涉雌性鸡胚性腺中芳香化酶基因(CYP19A1)的表达

本研究通过把构建的短发夹结构RNA(shRNA)真核表达载体导入鸡胚,检测鸡胚性腺分化期质粒载体在鸡胚体内代谢情况及雌性鸡胚性腺中芳香化酶基因(CYP19A1)mRNA表达效率,进而探讨利用该方法在鸡胚体内进行特定基因干涉的可行性.实验针对CYP19A1基因构建了4条特异性表达载体,一条非特异性表达载体.每个实验组选取45个新鲜种蛋作为实验材料进行胚盘下腔注射,并设立空白对照组.鸡胚发育12d时,检测各处理组鸡胚肝脏组织中质粒存在情况,并取其左侧性腺组织进行目标基因的荧光定量分析.研究结果表明,导入组在12日胚龄时所有鸡胚基因组中均可检测到绿色荧光蛋白基因(EGFP);荧光定量结果显示,导入特异性表达载体cyp-580、cyp-1083和cyp-1295后,对应雌性鸡胚性腺CYP19A1 mRNA表达效率显著低于空白对照组,干涉效率分别为:73％、52％和85％;特异性表达载体cyp-1403组CYP19A1mRNA表达效率与空白对照组相比有所降低但无显著性差异.本实验为诱导鸡胚性反转提供了新方法并建立了鸡胚发育期特定基因体内干涉新平台.     

4种鱼类肝脏细胞色素P450对毒死蜱、对硫磷及马拉硫磷的脱硫代谢

以毒死蜱、对硫磷及马拉硫磷为供试农药,以斑马鱼、剑尾鱼、麦穗鱼及太阳鱼为供试生物,研究了3种农药对4种鱼的急性毒性,4种鱼肝细胞色素P450对3种农药的脱硫代谢作用及两者之间的相关性。结果表明,毒死蜱对于上述4种鱼的96hLC50分别为1.94、0.171、0.0273、0.0681mg·L^-1;对硫磷为2.6、0.0559、1.78、1.02mg·L^-1;马拉硫磷为7.07、0.907、6.03、0.172mg·L^-1。4种鱼肝脏P450对于毒死蜱代谢的Vmax/Km值分别为1.67×10^4、2×10^4、5×10^4、2×104min^-1;对于对硫磷代谢的Vmax/Km值分别为2×10^4、5×10^5、1.11×10^5、1.43×10^5min^-1;对于马拉硫磷的值分别为5×10^3、5×10^4、2.5×10^3、1.67×10^4min^-1。96hLC50值与Vmax/Km值大体呈负相关,其中毒死蜱的相关性较弱,对硫磷及马拉硫磷的相关性较强（R^2值分别为0.2181、0.8490、0.5102）。研究结果说明P450在鱼类耐药性形成过程中发挥了阻碍作用。     

蓖麻细胞色素P450基因片段的克隆及RNAi表达载体的构建

采用PCR方法克隆了蓖麻细胞色素P450基因的正反2个片段。正向片段长为525个碱基,反向片段长为421个碱基。经测序分析,得到的正向基因片段和反向基因片段与GenBank上的蓖麻细胞色素P450基因（XM₀02525863.1）的碱基同源性分别为98.85%和99.51%。利用载体pHANNIBAL和限制性内切酶将正反2个片段连接成具有发夹结构的中间载体pHAN-P450S-P450A,然后将中间载体和表达载体pBI-121连接,构建了P450基因的RNAi植物表达载体,为利用RNA干扰抑制P450基因表达的研究奠定了基础。     

高羊茅细胞色素FaP450基因克隆及其在非生物胁迫下表达分析

细胞色素P450属于一种含亚铁血红素单加氧酶的超基因家族,在植物多种代谢途径与防御反应中起着重要作用。为探究细胞色素P450基因在高羊茅中的表达模式,本研究采用cDNA末端快速扩增技术从高羊茅叶片中克隆了细胞色素P450基因,命名为FaP450。FaP450全长1 737 bp,含1 437 bp的开放阅读框,共编码478个氨基酸,具有P450基因家族典型的P450结构域。系统进化树分析表明,高羊茅FaP450与禾本科植物小麦、山羊草的P450蛋白亲缘关系较近。荧光定量PCR表明,高羊茅FaP450基因受干旱、高温、氮胁迫及盐胁迫的诱导表达上调,表明该基因与非生物胁迫的抗性相关。构建FaP450超量表达载体,利用农杆菌侵染法转化拟南芥,对其进行低氮胁迫,发现低氮胁迫下FaP450基因过量表达植株的鲜重与根长显著高于野生型,表明FaP450基因的超量表达可以增强拟南芥对低氮的适应性。本研究为深入探索P450基因家族在牧草生长发育与抗逆功能的研究奠定了理论基础。     

砀山酥梨细胞色素P450的基因组学分析

细胞色素P450在植物的苯丙烷类、生物碱和萜类等生物合成中起着非常重要的作用。为了更好地了解砀山酥梨中P450的种类和数量,利用砀山酥梨基因组的氨基酸和c DNA数据库对P450基因进行筛选,分析砀山酥梨全基因组中P450基因的种类、进化关系、基因的物理定位、以及二级结构元件。结果显示,在砀山酥梨基因组中发现并初步确定了226个P450基因,通过基因的定位分析确定了226个基因分布在17条染色体上,其中除了4、5、9号染色体上无基因簇分布外,其他的染色体都有基因簇的分布。通过基因结构和进化树之间的比较,进一步确定了基因结构和进化之间的相互联系。二级结构的分析表明,砀山酥梨P450蛋白序列同样具有P450蛋白特征性结构域。本研究结果为砀山酥梨P450基因功能的深入分析奠定了基础。     

苦荞细胞色素CYP81家族同源基因FtP450-R4的克隆、分子鉴定及其功能分析

细胞色素P450 (cytochrome P450,CYP450)是高等植物中最大的酶蛋白家族之一,广泛参与植物的次生代谢和抗逆生理.本研究采用同源克隆和cDNA末端快速克隆(rapid-amplification of cDNAends,RACE)技术,获得苦荞(Fagopyrum tataricum) CYP81家族同源基因FtP450-R4 (GenBank登录号:KM271986).FtP450-R4 cDNA全长1770bp,5'-UTR为49 bp,3'-UTR为194bp,ORF为l 527 bp,其ORF序列可编码508个氨基酸残基的蛋白.生物信息学分析表明,FtP450-R4蛋白通过N-端4～24位氨基酸残基定位于内质网,与F3'H (flavonoid 3'-hydroxylase)、I2'H (isoflavone 2'-hydroxylase)和其他CYP450的同源性在44％～46％之间;多重序列比对显示,FtP450-R4具有CYP450中经典的基序和保守序列,但不含F3'H的特征基序(GGEK);系统进化树分析显示,FtP450-R4与拟南芥(Arabidopsis thaliana) CYP81家族和I2'H聚为一大簇,说明其可能参与苦荞黄酮类化合物的羟化或对逆境胁迫的应答.UV-B、寒冷和干旱均能引起FtP450-R4在苦养子叶中表达量的显著变化,而在胚轴中其表达量变化不显著.利用大肠杆菌(Escherchia coli) BL21 (DE3)菌株对FtP450-R4蛋白进行了可溶性表达,活性鉴定表明,重组FtP450-R4蛋白能以还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸(reduced form of nicotinamide-adenine dinucleotide phosphate, NADPH)和山奈酚为底物进行酶促反应,具有生物学活性.本研究可为了解CYP450在黄酮合成代谢中的功能,明确苦荞黄酮代谢调控的分子机制提供了基础资料.     

土壤低剂量荧蒽胁迫下蚯蚓的抗氧化防御反应

以人工污染土壤为介质,荧蒽为供试化学品,以蚯蚓内脏中细胞色素P450含量、谷胱甘肽转移酶(GST)、超氧化物歧化酶(SOD)、过氧化物酶(POD)、过氧化氢酶(CAT)活性和丙二醛(MDA)含量为指标,进行了不同暴露时间(1、3、7和14d)下低剂量荧蒽(60、120、240、480和960μg kg-1)污染胁迫对蚯蚓(Eiseniafetida)的毒性效应研究。结果表明,在供试浓度范围内,蚯蚓内脏中各生化酶系产生了不同程度的响应。其中P450含量、SOD和POD活性比较敏感;而GST和CAT活性,以及MDA含量在供试浓度范围内对荧蒽的暴露没有明显的指示作用。研究发现,低剂量污染物暴露的时间效应较剂量效应更有指示作用,并且生物体内各生化酶系对污染物暴露的敏感性存在差异,因而在土壤污染生态毒性诊断时,选择多时段检测和多指标联合诊断,对污染暴露指示的有效性和敏感性尤为重要。