共查询到18条相似文献,搜索用时 78 毫秒
1.
运用变性聚丙烯酰胺凝胶电泳和PCR产物测序技术检测斑点叉尾鮰CC趋化因子基因SCYA113 内含子1的序列长度和多态性。在3个群体的60个个体中,斑点叉尾鮰CC趋化SCYA113 内含子1存在15种单元型和8种长度类型,长度类型分别为A、B、C、D、E、F、G和H型。对这8种序列进行比对分析发现,斑点叉尾鮰SCYA113 内含子1长度为395~443 bp, 8种长度类型中A、G、T、C的平均百分比为30.01%、15.43%、38.37%、16.19%,而且G+C(31.62%)含量明显小于A+T(68.38%)含量,内含子1与外显子1和2的连接处存在真核基因中mRNA剪接的识别信号GT/AG;引起长度变化的主要原因是短串联重复序列(微卫星序列)TTC和TTA引起的;除了微卫星序列以外,共检测到6个突变位点,其中3个转换位点为118(C→T),209(G→A),250(T→C),3个颠换位点为266(T→A),289(G→T),387(G→C),核苷酸多样性指数(π)为0.004,平均核苷酸差异(K)为1.576;在变异水平上,3个群体表现出一定的遗传差异,84群体中检测到8种长度类型和14种基因型,97群体中检测到8种长度类型和10种基因型,04群体中6种长度类型和10种基因型(缺少A、B等位基因)。从3个群体60个个体拥有22种频率较低(0.017~0.150)的基因型可以看出,斑点叉尾鮰的遗传基因资源较为丰富。 相似文献
2.
在α-螺旋抗菌肽序列比较和两亲性分析的基础上,提取序列模板,计算机辅助(螺旋轮法)设计出新型抗菌肽模式肽PGYa(Peptide以Gly开头,以Tyr-NH2结尾),然后选用毕赤酵母偏爱密码子,设计合成了PGYa基因(rPCR法)。所合成的基因全长为94bp,并在其N端引入kex2裂解位点,以保证表达抗菌肽具有天然N端。基因克隆入pPICZα-A质粒,构建分泌型酵母表达载体pPICZα-A-PGYa。在AOX1 (醇氧化酶)启动子调控下,PGYa蛋白获得分泌表达,其表达量达到132 mg/L。初步抑菌(E.coli DH5α)活性显示:PGYa有较好的抗菌活性。 相似文献
3.
根据毕赤酵母(Pichia pastons)密码子的偏好性,以氨基酸序列不变为原则,对源于蜡样芽胞杆菌(Bacillus cernes)M22的Mn-SOD基因进行分子改造,设计、合成了新的基因序列Mn-SOD-2.构建酵母表达载体pPICZαA/Mn-SOD-2,并整合至毕赤酵母GS115染色体.结果表明,所构建的重组体经0.5%甲醇诱导表达后,Native-PAGE检测证实有清晰单一活性条带;SDS-PAGE检测证实重组蛋白的分子量24 kD.酶活分析表明,外源蛋白的活性较改造前增加了2.2倍,且表达稳定性良好. 相似文献
4.
蜡样芽孢杆菌M22锰超氧化物歧化酶基因在毕赤酵母中的表达 总被引:7,自引:3,他引:7
实验成功地构建了毕赤酵母(Pichia pastoris)表达质粒pPICZA—Mn—sod,质粒线性化后通过电激法导入毕赤酵母GSl15,抗生素zeocin抗性梯度筛选得到高拷贝重组菌株。PCR鉴定及Mut^+表型分析表明,目标基因已经重组到宿主基因组染色体上;0.5%甲醇诱导表达后,SDS—PAGE结果显示,表达蛋白的相对分子量约为23kD,活性电泳出现明显活性条带;酶活性测定显示,重组菌株SOD活性比对照提高5倍左右;氯仿-乙醇(3:5/V:V)和KCN(5mmol/L)抑制反应进一步证明,所表达的SOD为锰超氧化物歧化酶C。来源于蜡样芽孢杆菌(Bacillus cereus)M22的Mn—sod基因在毕赤酵母中得到正确表达。为研究该酶的生理功能提供了必要的物质条件。 相似文献
5.
以ConA刺激的犬外周血淋巴细胞总RNA为模板,通过RT-PCR方法扩增出犬IL-2成熟蛋白基因,将目的片段连接到pMD18-T载体,测序结果显示,扩增片段与GenBank上发表的序列一致。然后将目的片段连接到酵母表达载体pPICZa-A上,得到重组酵母犬IL-2表达载体pPICZaA-CaIL-2,经SacⅠ酶切线性化后电转化导入毕赤酵母菌株X-33。PCR方法筛选重组酵母菌,甲醇诱导表达,SDS-PAGE结果显示表达上清中有大小约20kDa的目的条带,比实际分子量略大,推测蛋白可能发生糖基化。MTT法测定生物学活性结果表明,重组犬IL-2能够极显著促进犬外周血淋巴细胞增殖。证明酵母表达的犬重组IL-2具有良好的生物学活性。 相似文献
6.
里氏木霉木聚糖酶基因Ⅱ在毕赤酵母中的分泌表达及其酶学性质研究 总被引:1,自引:0,他引:1
利用RT-PCR技术从高产木聚糖酶菌株T. reesei Rut C-30中成功扩增出其主要木聚糖酶基因XynⅡ,经序列分析证实,在该菌株诱变选育过程中其成熟肽序列有两处碱基发生突变;将不带原基因信号肽的XynⅡ克隆到毕赤酵母高效表达载体pPICZαA上,线性化后经电击转化到毕赤酵母中,经Zeocin及PCR筛选后得到的转化子用1%甲醇诱导。SDS-PAGE证实,重组子实现了分泌表达,且发酵上清中几无杂蛋白;对该重组酶酶学性质分析表明,该酶最适反应温度为60℃,最适反应pH值为6.0,该酶热稳定性较好,在50℃下保温30 min仍能保留其95%以上活性。 相似文献
7.
牛γ-干扰素在大肠杆菌与毕赤酵母中的表达及抗病毒活性比较** 总被引:2,自引:0,他引:2
用RT-PCR从经ConA刺激的荷斯坦奶牛外周血淋巴细胞总RNA中扩增了BolFN-γ基因,克隆人pGEM T-easy载体测序。再亚克隆其成熟肽基因,分别构建大肠杆菌(Escherichia coli)表达载体pET28a/BolFN-γ和毕赤酵母(Pichia pastoris)表达载体pPICZα/BolFN-γ前者存Ecoli BL21中经IPTG诱导实现了高效表达,表达蛋白占菌体总蛋白的30%,表达产物以包涵体形式存;后者存P. pastorisGS115中经甲醇诱导实现了高效分泌表达,表达产物直接分泌到培养上清中,表达量约为1.0g/L。分别在CEF/VSV和MDBK/VSV细胞系上对2种表达蛋白的抗病毒活性进行了比较,结果表明,两种重组蛋白在MDBK/VSV抗病毒活性高于在CEF/VSV上的活性,而毕赤酵母表达的蛋白抗病毒活性高于大肠杆表达蛋白,约为前者的2倍。 相似文献
8.
采用酵母偏爱密码子合成五条编码猪IGF-I基因的引物,利用重叠PCR技术拼接获得长度为210bp的猪IGF-I成熟蛋白基因。将该基因插入分泌表达载体pPIC9K中,转化巴斯德毕赤酵母菌。经表型鉴定、PCR分析及G418筛选得到Muts型多拷贝整合菌,以1.5%甲醇诱导培养后,经SDS-PAGE检测表达产物,在7.5 kDa处出现一特异蛋白条带,目的蛋白表达量达410mg/L。Dot blot检测表明,重组蛋白可与抗IGF-I多克隆抗体反应。 相似文献
9.
美洲商陆抗病毒蛋白真核表达载体的构建及在毕赤酵母中的表达 总被引:6,自引:0,他引:6
摘要:从美洲商陆(Phytolacca americana)叶片中通过异硫氰酸胍法提取出了总RNA,经RT-PCR扩增出缺失突变型抗病毒蛋白PAP基因,将该基因克隆于分泌型真核表达载体pPIC9K,然后导入毕赤酵母(Pachia pastoris )菌株GS115细胞。在甲醇的诱导下,经过酵母高密度发酵进行PAP的表达,经SDS-PAGE分析。结果表明,在培养基上清液中含有一明显的特异性蛋白条带,大小为34 kD,经Western-blotting分析,该蛋白与法国PAP抗血清有特异性反应,体外活性检测表明该蛋白对病毒的侵染性具有高度的抑制性,表明该基因在毕赤酵母GS115中得到了表达。 相似文献
10.
选用巴斯德毕赤酵母(Pichia pastoris)系统表达特异性抗速灭威单链抗体(scFv)基因,以为速灭威特异性抗体的大量制备奠定基础。设计引物扩增阳性克隆scFv基因,亚克隆至表达载体pPICZαC,获得重组酵母表达质粒pPICZαC-scFv,线性化pPICZαC-scFv并高效电转P.pastoris(X-33),对转化子进行抗性梯度筛选得到一株高效表达的X-33-Pp-SMW-12-6菌株。对获得的菌株先后进行表达条件的优化、优化条件下的诱导表达及单链抗体性质研究。结果表明:P.pastoris-scFv的质量接近其亲本E.coli-scFv的质量,X-33-Pp-SMW12-6在优化条件下的表达产量达28mg/L,比未优化前的产量提高了约8mg/L,经纯化后抗体纯度可达85%以上。因此,利用P.pastoris表达系统制备抗速灭威单链抗体比细菌表达系统更有效、更经济。 相似文献
11.
草鱼leptin基因的分离鉴定及在巴斯德毕赤酵母中的表达 总被引:1,自引:0,他引:1
利用RT-PCR技术扩增出草鱼(Ctenopharyngodonidellus)的leptin基因,将leptin基因克隆至真核表达载体pPIC9K,电穿孔转化GS115菌株,经G418筛选和甲醇诱导后,对表达产物进行SDS-PAGE琼脂糖凝胶电泳和Westernblot分析。结果表明,草鱼leptin基因cDNA序列由438个核苷酸组成,编码146个氨基酸组成的多肽(GenBank登陆号AY551335),与鲤鱼(Cyprinuscarpio)leptin基因相比,核苷酸和氨基酸的同源性为99%;与人、猪和鼠相比,核苷酸同源性分别为84%、86%和95%,氯基酸的同源性分别为84%、82%和96%;与河豚(Takifugurubripes)相比,氨基酸具有较大的差异,仅有9%的同源性,表明leptin在物种的进化上具有一定的差异;实现了草鱼leptin基因在毕赤酵母(Pichiapastoris)中的表达,表达蛋白的分子量约为16kD,Westernblot分析表明,表达产物具有一定的免疫学活性。 相似文献
12.
本文运用AFLP分子标记技术,对江西省4个斑点叉尾鮰(Ictalurus punctatus)养殖群体(GZ、XJ、PYA和PYB)进行遗传多样性分析。结果表明,在64对引物组合中,E3/M2、E4/M7、E3/M8和E5/M5引物从4个群体72个体中共扩增出179个位点,其中多态位点为109,占60.89%。其中,PYA、GZ、XJ和PYB群体的多态位点比例(P)分别为56.54%、56.47%、56.32%和56.14%。Shannon多样性指数(I)分别为0.2890、0.3003、0.2896和0.2852,平均杂合度(H)分别为0.1935、0.2027、0.1938和0.1898。4个群体间的遗传分化系数(Gst)为0.1314,说明群体间发生了一定程度的遗传分化,但分子方差分析(AMOVA)显示,群体的遗传变异90.98%来源于群体内的个体间,9.02%来源于群体间。聚类分析也表明,4个群体所产生的遗传分化主要也来源于群体内。本研究为斑点叉尾鮰种质资源的调查和保护提供参考,为斑点叉尾鮰优良品种的选育提供科学依据。 相似文献
13.
黄颡鱼抗菌肽hepcidin基因的克隆和表达分析 总被引:1,自引:0,他引:1
用RT-PCR方法,从黄颡鱼(Pelteobagrus fulvidraco)肝脏中克隆获得了hepcidin cDNA序列,并对其进行序列测定,在此基础上分析了hepcidin基因在不同组织中的表达差异和不同细菌感染后对其表达的影响。结果表明,黄颡鱼hepcidin的cDNA片段(GenBank登陆号EU257703)长为282bp,编码93个氨基酸,由信号肽(23个氨基酸)、前肽(45个氨基酸)和成熟肽(25个氨基酸)组成,成熟肽含有8个保守的半胱氨酸(cys)残基,可形成4个链内二硫键。与已报道的其他鲶形目鱼类hepcidin核苷酸序列的同源性为80-82%,推导的氨基酸序列的同源性为69-71%。RT-PCR半定量分析显示黄颡鱼hepcidin基因在不同组织中普遍表达,其中肝脏表达水平最高,头肾、肠道、肌肉、脑、胃、鳃、心脏、卵巢表达次之,皮肤、脾脏、肾脏表达较低。感染嗜水单胞菌和腊样芽孢杆菌的黄颡鱼,肝脏hepcidin mRNA水平显著升高。 相似文献
14.
弹性蛋白酶基因(PAE)的克隆及在毕赤酵母中的表达 总被引:1,自引:0,他引:1
以1株产弹性蛋白酶的铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)基因组DNA为模板,经PCR扩增得到的铜绿假单胞菌弹性蛋白酶(P.acruginosa elastase,PAE)基因,与GenBank中的序列对比发现同源性为99%.成功地构建了重组表达载体pPIC3.5K/PAE,莺组质粒Sac Ⅰ线性化后转化毕赤酵母(Pichia pastoris)菌株KM71中,通过PCR和表型鉴定表明,PAE基因已经整合到毕赤酵母染色体上.经大量筛选获得48株含高拷贝的重组毕赤酵母转化子.在甲醇诱导下,经过毕赤酵母高密度发酵进行PAE的表达,经SDS-PAGE分析.结果表明,在培养基上清中含有一明显特异性蛋白条带,大小为34kD.活性检测结果,酶活为1 060 U/mL,是出发菌株的26倍. 相似文献
15.
抗菌肽基因在毕赤酵母中分泌表达及其条件优化 总被引:1,自引:0,他引:1
用化学合成法合成了以酵母偏爱密码子编码的抗菌肽cecropinA(1-8)-melittin(1-18)基因片段,合成片段与酵母表达载体pPIC9K重组,构建胞外分泌表达载体pPIC9K-came,电击法转化毕赤酵母(Pichiapastoris)SMD1168宿主菌,对CAME抗菌肽重组酵母菌的摇瓶发酵条件进行了优化。结果表明,酵母表达抗菌肽具有抗菌活性且溶血活性显著降低;重组酵母在含2%葡萄糖pH7.0的YPD培养液中,250r/min震荡培养24h后,重组酵母菌的A600为6.0时,经0.5%甲醇在28℃条件下诱导48h能够诱导产生较高抗菌活性的抗菌肽。 相似文献
16.
疏绵状嗜热丝孢菌糖化酶基因(gla)的克隆及在毕赤酵母中的表达 总被引:2,自引:0,他引:2
本研究以疏绵状嗜热丝孢菌(Thermomyces laltltginosus)cDNA为模板,克隆了糖化酶基因(gla),序列分析表明gla的开放阅读框由1854个核苷酸组成,编码617个氨基酸.根据氨基酸序列推算该酶的分子量为64 kD,属于糖苷水解酶第15家族,具有该家族催化保守区的典型特征.PCR扩增gla的成熟蛋白编码基因,构建表达载体,经线性化后电击转化导入巴斯德毕赤酵母(Pichia pastoris GS115),并成功进行了表达.重组酶经摇瓶发酵后酶活可达11.6 U/mL,经硫酸铵沉淀、DEAE-Sepharose Fast Flow阴离子交换等步骤纯化了该重组蛋白,SDS-PAGE显示该重组蛋白大小约为67kD,比推测的蛋白分子量稍大,可能与该蛋白的糖基化有关.该重组酶的最适反应温度和最适pH值分别为60℃和5.0,该酶具有较高的热稳定性,70℃保温20 min后剩余酶活为54%. 相似文献
17.
应用RT-PCR技术,直接从麻鸭(Tadorna ferruginea)脾淋巴细胞总RNA中扩增出麻鸭IL-18成熟蛋白(mDuIL-18)基因,克隆到pGEM-T Easy载体。测序结果表明获得了mDuIL-18基因,其大小为513bp,并将该基因亚克隆到原核表达载体pQE30。SDS-PAGE可检测到分子质量为19.76kD的重组蛋白,Western blot证实该重组蛋白可与兔抗鸡IL-18血清发生特异性反应。表达产物以包涵体形式存在,经变性和复性处理后明显促进鸭T细胞转化。用mDuIL-18(150或200ng/鸭)和禽流感病毒(AIV)疫苗免疫鸭2周后,血凝抑制(HI)抗体平均滴度达到7.5~7.7log2,而只用AIV疫苗免疫和用mDuIL-18(100ng/鸭)和AIV疫苗免疫的HI抗体平均滴度仅达到6.3~6.6log2,表明mDuIL-18提高AIV灭活油乳苗诱导的免疫应答。 相似文献
18.
猪细小病毒VP2蛋白主要抗原域在毕赤酵母中的表达及鉴定 总被引:1,自引:0,他引:1
猪细小病毒(Porcine parvovirus,PPV)是一自主型细小病毒(Autonomous parvovirus),它是引起母猪繁殖障碍的主要因素之一。目前国内外的诊断方法多以全病毒为抗原,存在很大的局限性,而重组蛋白无感染性,易于生产和纯化。因此用重组蛋白来检测猪细小病中抗体水平对于猪细小病的防 相似文献