橡胶炭疽病菌致病相关突变体的筛选及表型分析

通过对实验室已获得的1 685个橡胶炭疽病菌T-DNA插入突变体的生物学及致病性测定,从中筛选出15个致病力明显减弱的突变体,并进行PCR检测。结果表明,该基因组中均含潮霉素磷酸转移酶基因片段。在PDA培养基上,其中2个突变体菌落颜色异常,6个生长速率下降,8个产孢量显著降低,2个突变体分生孢子形态异常,2个附着胞形态异常,3个不能形成附着胞,在洋葱表皮上,侵染钉形成率显著降低。     

ATP硫酸化酶基因MoMET3在稻瘟病菌生长发育和致病过程中的功能分析

【目的】真菌对硫元素的利用始于ATP硫酸化酶对硫酸根离子的活化。对稻瘟病菌ATP硫酸化酶在病菌生长发育和致病过程中的功能进行分析,可为稻瘟病的防治提供药物靶标。【方法】采用同源重组方法构建基因敲除载体,并对突变体的表型进行分析。【结果】Mo MET3基因是病菌营养生长和分生孢子形成所必需的,但不是毒力因子。稻瘟病菌ATP硫酸化酶编码基因Mo MET3缺失后,突变体营养生长速率减慢,产孢量降低,但是突变体对寄主的毒力不受影响;虽然基因缺失不影响突变体分生孢子萌发和附着胞成熟,但突变体在硫营养限制时孢子萌发后次生菌丝的生长明显受抑。Mo MET3基因互补后,突变体恢复正常生长,能利用硫酸盐。【结论】无机硫的还原对分生孢子的萌发和附着胞的成熟并不是必需的,分生孢子内储存的还原态硫化合物可以满足这一过程中硫营养的需求,但病菌侵入寄主组织后需要吸收利用寄主源还原态硫以利于侵染菌丝的扩展。     

水稻白叶枯病菌hrcU基因缺失突变体构建及功能研究

 通过基因敲除方式,构建了水稻白叶枯病菌hrcU基因的缺失突变体。突变体丧失了在水稻上的致病性和在非寄主植物上的过敏反应。携带hrcU基因的黏粒完全互补了hrcU突变菌株的表型,互补菌在水稻组织中的生长能力也与野生型菌株相当。免疫杂交结果显示,hrcU基因突变后,水稻白叶枯病菌的Harpin蛋白Hpa1不能从细胞内分泌到胞外。这些结果表明,水稻白叶枯病菌hrcU基因的主要功能是形成Ⅲ型分泌系统,将效应分子分泌到病原细菌胞外,从而决定了在非寄主上的过敏反应和在水稻上的致病性。     

农杆菌介导的稻瘟病菌转化及致病缺陷突变体筛选

在构建了两个含有潮霉素B磷酸转移酶基因双元载体的基础上,成功地实现了农杆菌介导的稻瘟病菌转化,转化效率达每1×106个分生孢子>300个转化子,并得到了4000多个转化子。通过继代培养和PCR检测,证明插入到稻瘟病菌基因组中的潮霉素抗性基因可稳定遗传。Southern杂交分析表明,大约有2/3转化子的T DNA插入是单拷贝的。用大麦叶片离体接种的方法快速测定部分稻瘟病菌转化子的致病性,发现一个致病缺陷突变体：A1 412。该突变体不能侵入水稻叶片及擦伤的大麦或水稻叶片,说明A1 412突变体在寄主组织中扩展进程被阻断。进一步的表型分析发现A1 412突变体的产孢量显著下降,仅为野生菌株的7%,在疏水表面不能形成附着胞,部分分生孢子萌发也略有延迟。Southern 杂交显示A1 412基因组中T DNA插入是单拷贝的。上述结果表明,A1 412突变体表型的改变可能是由于T DNA插入而使某一具有重要生物学功能的基因失活所致。     

稻瘟病菌MoRho2基因功能初步分析

稻瘟病菌(Magnaporthe oryzae)是研究病原真菌生长发育及致病机理的重要模式生物。Rho家族蛋白是一类具有GTP酶活性的GTP结合蛋白,在多种细胞信号转导通路中起着分子开关的作用。通过生物信息学方法分析Mo Rho2的理化性质、蛋白结构域等信息,并推测其潜在功能。为进一步明确Mo Rho2蛋白的功能,利用基因敲除技术获得Mo Rho2基因的敲除突变体。表型分析结果表明,与野生型菌株相比,Mo Rho2敲除突变体的菌丝生长速度、分生孢子形态、附着胞形态、产孢量、对植物的毒力等方面均无明显的差异,但分生孢子萌发和附着胞形成略滞后于野生型菌株。突变体能够产生正常的侵入栓并侵入洋葱表皮。综上所述,Mo Rho2基因可能参与稻瘟病菌分生孢子的萌发和附着胞的形成,结果为进一步揭示基因Mo Rho2的生物学功能奠定基础。     

稻瘟病菌丝氨酸/苏氨酸磷酸酶MoPpz1的功能研究分析

稻瘟病菌（Magnaporthe oryzae）是一种在水稻不同生育期均能引起病害的真菌。在真核生物中,蛋白激酶CK2高度保守,包含2个调节亚基和2个催化亚基。稻瘟病菌中MoCKb1和MoCKb2分别编码MoCK2的2个调节亚基,MoCKa编码稻瘟病菌MoCK2的催化亚基。运用反向遗传学策略和同源重组原理,对MoCKa-GFP的pull-down实验结果中获得的一个丝氨酸/苏氨酸磷酸酶MoPpz1进行功能分析。经过生物信息学研究分析发现Ppz1在不同的真菌中具有不同的功能,同时与其他模式真菌的Ppz1蛋白序列具有较高同源性。在获得基因敲除突变体后,通过表型分析发现,与野生型Ku80相比,ΔMoppz1突变体菌落的营养生长和产孢量等方面均无明显差异,但分生孢子的萌发和附着胞的形成滞后于野生型菌株,且对水稻的致病能力减弱。激光共聚焦显微分析表明,MoPpz1定位在菌丝、分生孢子和附着胞的细胞质中。综上所述,蛋白磷酸酶MoPpz1可能参与稻瘟病菌分生孢子萌发、附着胞形成以及对水稻致病性的调控。     

稻瘟病菌分生孢子发芽和附着胞形成的影响因素研究

在8种培养基膜,多种cAMP、IBMX浓度梯度的琼脂表面膜,不同营养液及pH值条件下,研究了稻瘟病分子孢子发芽和附着胞形成的状况,并对稻瘟病拮抗细菌培养液的作用进行了研究。稻瘟病菌(Magnaporthe grisea) 91-11B1的分生孢子悬浮液浓度在10000~1000个/mL 和pH值在7.0为最适孢子萌发条件,但不影响附着胞的形成。疏水基物表面、营养饥饿或洋葱表皮细胞表面可以刺激附着胞形成。2.5 mmol/L cAMP和8.0 mmol/L磷酸二酯酶抑制剂IBMX显著地促进附着胞的形成。与去离子水和水洗法相比,自来水和振落法获得的分生孢子更有利于附着胞的形成。筛选到3株对孢子发芽及附着胞形成有强烈抑制作用的拮抗细菌     

水稻白叶枯病菌hrcU基因缺失突变体构建及功能研究

通过基因敲除方式,构建了水稻白叶枯病菌hrcU基因的缺失突变体.突变体丧失了在水稻上的致病性和在非寄主植物上的过敏反应.携带hrcU基因的黏粒完全互补了hrcU突变菌株的表型,互补菌在水稻组织中的生长能力也与野生型菌株相当.免疫杂交结果显示,hrcU基因突变后,水稻白叶枯病菌的Harpin蛋白Hpa1不能从细胞内分泌到胞外.这些结果表明,水稻白叶枯病菌hrcU基因的主要功能是形成Ⅲ型分泌系统,将效应分子分泌到病原细菌胞外,从而决定了在非寄主上的过敏反应和在水稻上的致病性.     

胶孢炭疽菌侵染橡胶树叶片染色方法的建立及显微观察

本研究建立了一种橡胶树叶片中胶孢炭疽菌的染色方法,通过显微观察明确胶孢炭疽菌在橡胶树叶片中的侵染结构,为橡胶树炭疽病的预测预报提供理论依据。在脱色剂（0.15%三氯乙酸乙醇溶液∶氯仿=5∶1）处理12 h,1%刚果红染色剂抽滤染色3 h的条件下,能清晰观察到胶孢炭疽菌在橡胶树叶片上的发育进程和侵染结构。结果表明,在28 ℃、100%相对湿度培养条件下,接种橡胶树淡绿期叶片2~6 h为分生孢子萌发高峰期,12 h后分生孢子萌发率大于85%;8~12 h为附着胞形成高峰期,接种12 h约75%的芽管顶端产生附着胞,少数附着胞中央部位开始形成侵染钉;24 h为侵染钉形成高峰期,同时分生孢子萌发形成多个芽管;36 h时附着胞顶端再次萌发产生次级附着胞,从而进一步侵染周围细胞,叶片出现零星病斑;48 h时芽管不断分支异化成菌丝并产生次级分生孢子,叶片出现大量典型的炭疽病病斑;72 h后菌丝在叶片表面纵横扩展,随机分支,逐步形成网状分布。随着菌丝的扩展,叶片组织发生一系列的病理变化,侵染部位组织出现褐色坏死病斑。本研究建立了一种着色效果好,简便易行,经济有效的橡胶树叶片中胶孢炭疽菌的染色方法,进一步明确了胶孢炭疽菌的侵染结构。     

野茼蒿链格孢YTH-21菌株的生物学特性及致病性研究

对野茼蒿(Alternaria sp.)YTH-21菌株的生物学特性及致病性进行研究,结果表明:该菌的菌丝体生长速度快,致病性强;菌丝体生长最适温度为25℃,产孢及孢子萌发最适宜温度均为30℃,致死温度为50℃、10min;菌丝体生长和产孢适宜pH值范围为5.0～8.0,最适宜于孢子萌发的pH值为7.0;对菌丝体生长及产孢最好的碳源为葡萄糖,但不利于孢子萌发;供试氮源以氯化铵对菌丝体生长及产孢表现出明显的抑制作用.     

香蕉黑星病菌侵入前发育的Ca2+/CaM依赖信号研究

测定Phyllosticta musarum 在不同疏水性的人工表面上的孢子萌发率和附着胞形成率,以及Ca2+,CaM依赖信号系统是否参与了P.musarum侵入前阶段的发育调控.结果表明,P.musarum在侵染寄主时形成一种专门的附着胞作为侵染结构,刚性的疏水表面有利于诱导P musarum分生孢子的萌发.刚性表面则有利于附着胞的形成,而对这种与侵染相关的特化结构即附着胞的发育影响不显著.加入外源Ca2+,不论浓度如何都能促进分生孢子萌发,而附着胞形成率在高浓度外源Ca2+存在时则明显下降.Ca2+敖合剂EGTA有抑制孢子萌发和附着胞形成的作用,但在EGTA中加入Ca2+载体A23187和CaCl2可部分缓解EGTA的这种抑制作用.磷酸酯酶C(PLC)抑制剂Neomycin可以抑制附着胞形成.Ca2+通道阻断剂TMB-8和Nicaldipine,CaM拈抗剂Chloropromazine在微摩尔剂量水平上均可抑制附着胞形成.证明由Caz+/CaM信号系统控制的生化过程参与了P.musarum在寄主香蕉表面侵入前的形态建成.     

Improved metribuzin tolerance in narrow-leafed lupin (Lupinus angustifolius L.) by induced mutation and field selection

Narrow-leafed lupin (Lupinus angustifolius L.) is a grain legume well adapted to sandy soils of a Mediterranean climate and is the major grain legume in Australia. Improved herbicide tolerance of lupin cultivars is now considered as top priority by the industry for effective weed management. This paper reports induced mutation by seed mutagenesis in metribuzin-sensitive but anthracnose resistant cv. Tanjil, selection for metribuzin tolerant mutants in the field and evaluation of the tolerant mutants to metribuzin and anthracnose resistance. Two highly tolerant mutants Tanjil-AZ-33 and Tanjil-AZ-55 were identified and they were the first reported metribuzin tolerant mutants. The estimated mutation rate was 2.5 × 10⁻⁵. Tanjil-AZ-33 was six times and Tanjil-AZ-55 was four times more tolerant to metribuzin than the original cultivar Tanjil and they were also more tolerant than the tolerant cv. Mandelup. Tanjil-AZ-33 was the most tolerant lupin germplasm. Disease nursery assessment over 2 years revealed that both mutants also retained anthracnose resistance. Seed yield under irrigation was 4.2 t/ha for Tanjil-AZ-33 and 1.9 t/ha for cv. Tanjil when the seedlings were treated with metribuzin at 300 g/ha at the six-leaf stage. Clearly the mutation process has created new tolerance to metribuzin, but did not alter the anthracnose resistance. The mutant Tanjil-AZ-33 has been used as a parent in the lupin breeding program as a source of both metribuzin tolerance and anthracnose resistance. Seed mutagenesis followed by field selection in M₂ proved to be an effective method to develop new tolerance to herbicides.     

温度对燕麦孢囊线虫（Heterodera avenae）侵入与发育的影响

为给燕麦孢囊线虫的综合治理提供理论依据,在室内条件下分析了温度对燕麦孢囊线虫侵入、发育与孢囊形成的影响。结果表明,接种3d后,在18℃下燕麦孢囊线虫侵入数量最多;接种6～9d后,16℃处理的线虫侵入数量明显高于其他温度处理;在12、14℃下线虫侵入数量分别于接种15、12d达到最大值。在16～18、20、22、24℃下线虫完成生活史分别需要34、30、27和18d;在10～12℃下,于2个月后尚未发现雌虫形成。线虫在18～22℃下形成的孢囊数量最多。综合线虫的侵染数量与速度,认为线虫的最适宜侵染温度为16℃,最适宜的发育温度为18～22℃。     

人工控温条件下稻米垩白形成变化及胚乳扫描结构观察

 利用人工气候箱设高温（33℃）和适温（23℃）2个不同的温度处理,对2个不同垩白类型品种西农8116和广二矮104抽穗后稻米垩白的变化动态进行了研究,并通过对不同温度下稻米胚乳内部淀粉体形态、大小、发育程度、排列结构的扫描电镜观察,分析了稻米垩白形成变化与胚乳内部淀粉体结构特征的关系,结果表明,水稻灌浆结实期稻米垩白形成的变化过程主要是在抽穗5 d到15~20 d的这一时期,其余时段垩白度的变化幅度不大;高温（33℃）与适温（23℃）处理相比,以抽穗后10~20 d间的变化差别最为明显;胚乳淀粉体表现为“裸露型”还是“非裸露型”,主要与胚乳细胞内部淀粉粒发育程度有关,而与品种本身的垩白类型特征无必然联系     

早籼品种苗期耐冷性的遗传研究

 应用人工气候箱低温处理．研究了早籼品种的苗期耐冷性。根据3叶期在6℃下处理48小时，3O℃／25℃ 24小时恢复生长后的叶片黄化程度及48小时恢复生长后的死苗情况，发现3个早籼品种的耐冷性均由一对显性基因控制。品种耐冷性愈差，电导率愈高，以此评价的耐冷性遗传也可能由一对主基因控制。     

马铃薯立枯丝核菌病的研究

马铃薯立枯丝核菌病,是甘肃省高海拔冷凉山区发生普遍而危害严重的一种病害。据调查,田间植株平均发病率为10～15％左右。重病区薯块平均带菌率28.4～43.65％。经鉴定,病原菌属于立枯丝核菌(Rhizoctonia solanikihn)。该菌的菌丝生长温度范围是:最低为4℃,最适为23℃,最高为32～33℃,34℃时停止生长。菌核形成的最适温度为23～28℃。病菌能侵染马铃薯、豌豆、小麦等主要作物。并以贮藏期病薯上的菌核或残留在土壤中的菌核越冬。带菌种薯是第二年初侵染来源,也是远距离传播的主要途径。药剂防治试验表明,播前采用0.5%的福尔马林液或采用0.1％福美双或0.1％多菌灵浸种,都有明显的防病效果。采用抗病品种也能减轻病害的发生和危害。     

The Complete Mitochondrial Genome of Brachmia macroscopa (Lepidoptera: Gelechiidae) and Its Related Phylogenetic Analysis

The sweet potato leaf folder, Brachmia macroscopa, is an important pest in China. The complete mitogenome, which consists of 13 protein-coding genes (PCGs), 22 transfer RNA genes, two ribosomal RNA genes, and an A + T-rich region, was sequenced and found to be 15,394 bp in length (GeneBank no. KT354968). The gene order and orientation of the B. macroscopa mitogenome were similar to those of other sequenced lepidopteran species. All of the PCGs started with ATN as the canonical start codon except for cox1, which started with CGA. In regard to stop codons, most PCGs stopped at TAA except for cox2, which stopped at TA, and nad4, which stopped at a single T. Thirteen PCGs of the available species (33 taxa) were used to demonstrate phylogenetic relationships. The ditrysian cluster was supported as a monophyletic clade at high levels by using maximum likelihood and Bayesian methods. The apoditrysian group, covering the Gelechioidea, formed a monophyletic clade with a bootstrap value of 88% and a posterior probability of 1.00. The superfamily Gelechioidea was supported as a monophyletic lineage by a posterior probability of 1.00.     

Enhanced defense responses of tomato plants against late blight pathogen Phytophthora infestans by pre-inoculation with rhizobacteria

The efficacy of resistance in tomato plants, induced by rhizobacteria isolated from Jeju Island in Korea, against late blight disease caused by Phytophthora infestans was tested. Among the bacterial isolates tested, pre-inoculation with four isolates induced an effective defense against late blight. The four isolates, TRH423-3, TRH427-2, KRJ502-1 and KRY505-3, were identified as Burkholderia gladioli, Miamiensis avidus, Acinetobacter quenomosp and Bacillus cereus, respectively, by sequencing the ribosomal intergenic spacer region. They also promoted the growth of tomato seedlings. To illustrate resistance mechanisms, the infection process by P. infestans was examined using a fluorescence microscope. There were no noticeable differences in the rate of germination and appressorium formation between the untreated and pre-inoculated plants. However, callose was more frequently formed at the penetration sites on the leaves of pre-inoculated plants than the untreated plants, suggesting that these rhizobacterial isolates induce defense responses against P. infestans.