合浦珠母贝DNA的抽提和RAPD反应体系的优化

分别从保存于-70℃和95%乙醇的合浦珠母贝组织提取总DNA。结果表明,乙醇保存标本用双蒸馏水预处理后所提的DNA与-70℃保存的标本所提的DNA质量均较好。用抽提的DNA为模板优化RAPD条件,得到适合于合浦珠母贝的RAPDPCR反应条件为:20μL反应体系中包括20ngDNA模板,1×PCRBuffer,0.1mmol·L-1dNTPs,2.5mmol·L-1MgCl2,0.2μmol·L-1引物,1UTaqDNA聚合酶。最佳退火温度40℃。PCR产物用非变性PAGE银染和琼脂糖EB染色检测所得到的主要带型相同,但PAGE能检测到更多的多态带。     

鳙鱼不同组织基因组DNA提取方法的探讨

分别采用试剂盒和常规苯酚/氯仿抽提法提取新鲜的鳙鱼肌肉、肝脏、尾鳍以及用乙醇保存的3种组织基因组DNA,并对其进行综合分析。结果表明,对3种组织的新鲜样品2种方法均能提取高质量的DNA,而用乙醇保存的3种组织,DNA样品质量最好的是尾鳍,其次是肌肉,肝脏最差;总的来看,试剂盒法提取的DNA纯度较好,但是浓度低,而苯酚法得到的DNA浓度高,质量好,且相对成本低。综合比较,苯酚/氯仿抽提法提取乙醇保存的尾鳍组织基因组DNA是一种行之有效的方法,可以在鱼类分子研究中推广应用。     

鲍基因组DNA提取新方法研究

为更好地保存样本,提取高质量的基因组DNA,采取先将试验材料用75%乙醇固定,然后再提取基因组DNA的方法,经过检测后用于RAPD等基因工程分析。与从新鲜材料和液氮冷冻材料提取DNA方法的比较表明,用乙醇固定材料提取DNA是一种确实可行的方法,并克服了通常用新鲜材料或液氮冷冻材料所存在的不足(DNA容易降解)和远途异地取材的困难。     

不同方法保存的患病异育银鲫中鲤疱疹病毒2型DNA提取和PCR扩增效果分析

以患鲤疱疹病毒2型(Cyprinid herpesvirus 2,Cy HV-2)疾病的异育银鲫(Carassius auratus gibelio)肾脏为实验材料,采用-20℃冷冻、100%乙醇、Dafano's液、10%福尔马林、Zenker's液、Müller's液、2.5%戊二醛、Helly's液、Mossman's液、Bouin's液和Carnoy's液不同方法进行保存,通过微量分光光度计检测和琼脂糖凝胶电泳探讨不同保存方法对病毒DNA提取效果、常规PCR扩增效果和巢式PCR扩增效果的影响。结果表明:从病鱼肾脏中提取DNA时,除100%乙醇保存方法与-20℃冷冻保存组一样可以提取高质量的DNA外,其它保存方法对DNA提取有不同程度的影响,100%乙醇保存方法和保存的材料可以用作于鲤疱疹病毒2型DNA的提取;常规PCR扩增时,100%乙醇、Zenker's液、2.5%戊二醛、Helly's液、Bouin's液和Carnoy's液保存方法与-20℃冷冻保存组具有相同的效果,在362 bp处出现明亮一致的清晰单一目的条带,这6种保存方法及其保存的材料可以用作鲤疱疹病毒2型的常规PCR扩增;巢式PCR扩增时,100%乙醇、Dafano's液、10%福尔马林、Zenker's液、Müller's液、2.5%戊二醛、Helly's液、Mossman's液、Bouin's液和Carnoy's液所有保存方法与-20℃冷冻保存组具有相同的效果,在339 bp处出现明亮一致的清晰单一目的条带,这些保存方法及其保存的材料均可以用作于鲤疱疹病毒2型的巢式PCR扩增,在采用巢式PCR进行检测和诊断患鲤疱疹病毒2型疾病上具有应用价值。     

福尔马林固定鱼类标本DNA提取方法的优化

气候变化和人类活动胁迫致使许多海洋鱼类种群结构发生了显著变化。为了摸清鱼类种群结构对气候变化和人类胁迫活动的响应机理,利用福尔马林固定标本研究较早年代海洋鱼类DNA是一种有效的途径。为了解决福尔马林固定鱼类样本DNA提取质量差的难题,以福尔马林固定近50年的金线鱼(Nemipterus virgatus)标本为例,研究DNA提取过程中多个因素对DNA提取产量的影响。以取样部位、除甲醛处理、消化时间、抽提方法为考察因素,以DNA提取浓度为评价指标,通过SPSS软件设计L8(4×24)正交实验。结果,得到的最优处理组为:肌肉组织样品经GTE缓冲液浸泡与酒精梯度处理后,90℃水浴30 min,真空干燥处理,加入裂解液与蛋白酶K,55℃水浴消化3 h,试剂盒法提取DNA。除甲醛处理是提高DNA产量的关键,处理步骤越多效果越好。90℃水浴后再消化能够显著提高DNA提取效率。通过对比标本DNA与新鲜样品DNA,PCR扩增的结果,证明使用优化方法提取的DNA能够满足后续研究的需求。     

大黄鱼血液基因组DNA的提取及其效果

应用Sangon血液基因组DNA小量抽提试剂盒,提取大黄鱼血液组织的基因组DNA,并以所提取的DNA为模板进行RAPD扩增效果分析。结果显示,血液基因组DNA稳定性好、质量高,分子量大小在20kb左右;RAPD扩增条带清晰,能满足RAPD等一般分子实验对于模板DNA的质量要求。为大黄鱼的隔代连续研究和濒危鱼类分子实验所要求的活体基因组DNA的获得提供了一个可行的样本组织采集方法。     

一种保存鱼类鳍条的便捷方法

鳍条是研究鱼类分子生物学常用的组织样本,长期保存的鳍条为实验提供源源不断的基因组DNA。本研究介绍一种便捷保存鱼类鳍条用于DNA提取的方法---干燥法,并说明了用此方法保存鲤（Cyprinus carpio）、施氏鲟（Acipenser schrenckii）和虹鳟（Onchorynchus mykiss）鳍条效果。采集新鲜鳍条,贴在滤纸等吸水性强的纸张上,覆盖另一张滤纸,防止受潮、霉变,自然干燥后在室温保存3个月。剪取部分鳍条样本,用常规酚、氯仿抽提法提取基因组DNA,分别用紫外分光光度计、琼脂糖凝胶电泳、PCR扩增方法检测基因组DNA的质量。结果显示：用干燥法保存的3种鱼类的鳍条样品,提取获得的基因组DNA的OD260/OD280值在1.82-1.89之间, OD260/OD230值在2.29-2.70之间,琼脂糖凝胶电泳条带清晰明亮,可以用于后续的分子生物学研究。本研究证实用干燥法长期保存鱼类鳍条能够获得高质量的基因组DNA,为珍贵样品的长期保存提供了一种行之有效的方法,也为远距离、大样品的采集和保存提供了便捷的选择。     

福尔马林的妙用与慎用

固定保存病鱼和病原体标本：1．用10％福尔马林，可固定保存病鱼及其大型组织器官的标本。2．用4％福尔马林，可固定保存小型的寄生虫和敌害生物等病原体标本。     

红毛菜种间遗传差异的RAPD分析

在对红毛菜丝状体和叶状体DNA的提取中，突破常规海藻DNA提取方法，通过低温研磨以及温浴、冰浴等措施，提取到较高质量的DNA。应用随机扩增多态DNA(RAPD)技术对取自我国福建莆田海区红毛菜(Bangia fusco -purpurea Lyngb)和江苏南通海区红毛菜(Bangia spp.)进行了种间遗传差异分析，在使用的20个随机引物中，有14个引物扩增出条带清晰的多态性片段，这2个种的种间相似率为0．5618，遗传距离为0．4382。由此判断福建红毛菜和江苏红毛菜为同一属的2个不同物种。     

虹鳟胚胎组织单细胞悬液制备方法的研究

采用0.01MPBS等渗液配制的浓度为70%的乙醇固定液对虹鳟活体胚胎进行固定,并以蒸馏水配制的浓度为70%乙醇固定液作为对照,探讨用于流式细胞术分析的胚胎组织单细胞悬液制备方法。实验结果表明:PBS-乙醇和蒸馏水-乙醇固定液均可获得分散良好的单细胞悬液,但蒸馏水-乙醇固定液制备的胚胎细胞悬液中细胞数量相对较少,细胞碎片明显增多,流式细胞仪检测G0/G1峰较宽。而PBS-乙醇固定液制备的细胞悬液,细胞形态完整、背景较干净,细胞粘连少,几乎没有细胞碎片,流式上机检测各参数值较理想;以PBS-乙醇固定液制备2n虹鳟胚胎单细胞悬液作为材料检测,其结果与以红细胞为对照的样品检测DNA相对含量结果相一致,均为50AU。本研究表明利用PBS-乙醇固定液制备鱼类胚胎组织单细胞悬液方法是可行的。     

条斑紫菜冷藏网技术应用研究

在-18℃～-20℃的低温条件下，对含水率在20～25％的紫菜网进行20天左右的冷藏，对清除杂藻、防治病害、增产、增收和提高紫菜成品质量有较好的效果。     

乙醇固定中华绒螯蟹组织的DNA提取方法

由于ＲＡＰＤ技术简单、灵敏度高、设备要求不高、工作成本低和研究周期短等优点,已经在生物、医学领域被广泛地使用。张德春等[1]曾提出可用于ＲＡＰＤ分析的鱼类血样乙醇保存方法。考虑到乙醇固定标本应用范围广,且乙醇对ＤＮＡ的保护作用明显、时间长等优点,笔者直接采用75%的乙醇固定中华绒螯蟹(Ｅｒｉｏｃｈｅｉｒｓｉｎｅｎｓｉｓ,河蟹)肌肉组织,初步研究了如何经乙醇固定的河蟹肌肉组织中提取ＤＮＡ的方法,作为进一步在分子水平研究河蟹基因的基本参考。以往未见有关这方面的研究报道。收稿日期:20000425基金项目:江苏省教委资助项目…     

韩国开设鱼类基因银行

为改良鱼类品种和保护濒临灭种的鱼类，韩国国立水产振兴院遗传育种科研小组开设了一家鱼类基因银行。所谓鱼类基因银行，即采用生物化学的方法，对从鱼体上提取的基因进行分析，查清基因特性，用于鱼类品种改良和优良杂交鱼生产等的机构。韩国去年开设的鱼类基因银行，用冷冻高速离心分离机、DNA染色及截断装置、DNA分析器等，从鱼肝中提取基因，杏明基因的碱性序列，然后将优良的基因放入冰箱，在一40C的条件下保存。这家鱼类基因银行已入韩国具有代表性的8个养殖鱼种的基因和遗传信息祛行提取保存，计划用保存的基因开发抗病力强，肉…     

对虾组织样品中RNA的铵盐常温保存法及其效果

本研究以凡纳滨对虾为研究对象,取其肌肉组织28℃下保存于不同饱和度和不同pH的铵盐保存液中,保存一定时间后,通过组织总RNA提取、RT-PCR法及荧光定量RT-PCR法鉴定比较选择方便有效的保存方法。结果显示,从含25mmol/L柠檬酸钠和20mmol/L EDTA的饱和醋酸铵保存液和饱和硫酸铵保存液中保存的组织中提取的RNA较完整。通过调节pH进行保存液的优化,提取RNA后的凝胶电泳、RT-PCR及荧光定量RT-PCR确定的基因拷贝数显示,从含25mmol/L柠檬酸钠和20mmol/L EDTA的饱和醋酸铵保存液（pH 6.0）和饱和硫酸铵保存液（pH 5.2）保存的组织中能成功地提取出大量的RNA,且RNA分子完整;通过荧光定量RT-PCR法显示新鲜组织的18S rRNA拷贝数为107Copies/mg组织,保存28d后的组织18S rRNA拷贝数可达到105Copies/mg组织,而空白对照组的18S rRNA拷贝数只有103Copies/mg组织。说明保存液对于抑制核酸降解有较好的效果。这种简便有效的保存液为样品的保存、现场采集标本及后续的分子实验奠定了基础。     

荷斯坦奶牛RAPD反应条件的优化

以中国荷斯坦奶牛为实验材料，研究了Mg^2＋浓度、dNTPs浓度、引物浓度、模板DNA浓度、TaqDNA聚合酶，以厦退火温度对RAPD反应的影响，建立一套适合中国荷斯坦牛的最佳RAPD反应体系，反应总体积为20μL。Mg^2＋浓度为2．5μmol／L，TaqDNA聚合酶浓度为1U，引物浓度为2μmol／L，dNTPs浓度为400μmol／L．模板DNA浓度为100ng。PCR反应程序：94℃预变性2min→40循环（94℃变性1 min→36℃退火1min→72℃延伸lmin）→72℃延伸5min．     

坛紫菜（Porphyra haitanensis）果孢子在液氮中保存的初步研究

初步研究了坛紫菜(Porphyra haitaneusis)果孢子在液氮(-196℃)保存后的存活率及萌发率。试验表明，甘油和脯氮酸在冷藏中作为低温保护剂是不适用的，二甲基亚砜(DMSO)有效，且以10％浓度为最佳。加入该种浓度DMSO，采用快速降温法，短期冷藏(一小时到五天)，孢子的存活率在25～30％。进行培养试验表明，生存下来的孢子萌发率为50％左右，接近未经冷藏的正常孢子的萌发率，而且幼苗生长健壮。     

达氏鳇总DNA提取初探

本文报道了我国特有珍稀鲟科鱼类达氏鳇总DNA的提取方法,并对所得的DNA样品做了电泳、紫外分光光度计检测分析,检测结果表明这是一种简便可行的DNA提取方法,且能够最大限度地减轻对鱼体的伤害。     

应用RAPD技术分析雅砻江5种裂腹鱼类的亲缘关系

利用随机扩增多态DNA(RAPD)技术对雅砻江流域的2属5种(亚种)裂腹鱼类的亲缘关系进行了初步分析.采用筛选确定的20个扩增效果好的引物进行扩增,检测出214个位点.遗传距离和用UPG-MA法聚类得到的聚类图反映的5种裂腹鱼类的亲缘关系,与形态学分类方法所得结果基本一致.说明RAPD技术可有效用于这几种裂腹鱼类亲缘关系的研究.     

鱼在冷冻冷藏中肌肉组织学的变化

几种经济鱼类在冷冻冷藏中组织学变化的研究,得到了以下结果: 1.鱼肉在低温下冷冻时,肌肉纤维的水发生内冻结,冰晶体小,可以较好地保持其组织结构的完整。考虑到冻鱼在冷藏中仍继续变化,采用-25°——35℃温度冷冻鱼品是适宜的。 2.快速冷冻可使鱼肉组织不受冰晶体的破坏。梭鱼片在104分钟以内的不同速度 (鱼肉中心温度由0°至-5℃所需的时间)冷冻的结果均较好,其中以27、40、72分钟者更能令人满意。试验表明,鱼肉的冷冻速度不是愈快愈好。鲵鱼片用60—1,500分钟八种速度单向冷冻时,除720、1,380和1,500分钟的较差外,其他速度冷冻的肌肉组织相似。 3.冰藏1、7和13天的小黄鱼在相同温度下冷冻后,肌肉组织结构有差异,冰藏了天以上者差异特别明显。三种冰藏期的冻鱼以相同温度冷藏时,冰藏13天后的冻鱼,其保藏期较前二种冰藏期的短2—3个月。 4.冻鱼的冷藏温度十分重要。用相同的和低于冷冻时的温度保藏鱼类,可以较好地保持肌肉组织不受破坏。在-18℃冷冻并冷藏和-10℃冷冻后、-18℃冷藏的大黄鱼的保藏期,较之在-29℃(鼓风)冷冻后分别在-18°和-10℃冷藏的延长1—2个月。 5.不同含脂量的鱼(小黄鱼、带鱼、鲐鱼)以相同温度冷冻(-29℃,鼓风)和冷藏(-18℃),其肌肉组织有明显差别,多脂鱼肉的组织结构受到的破坏比少脂鱼的轻得多。     

坛紫菜丝状体种质保存技术的研究

采用液体培养基、固体培养基以及胶囊化冷冻法保存坛紫菜丝状体种质，探讨了不同保存条件对其生存的影响。结果表明：液体培养基保存丝状体，在低温5℃，培育30d时，藻丝的增重率为-0．67％；温度为10℃，有利于延长更换培养液的时间，即使120d不换培养液，丝状体也能正常生长。固体培养基保存丝状体，在5℃时固体平板上的细菌生长慢、数量少，但藻丝无法适应低温条件，逐渐死亡；丝状体在10℃固体平板上生长缓慢，但保存100d以上仍然正常生长，达到了长期保存的目的：在胶囊化低温保存中，丝状体存活率较高，而且随着保存时间的延长，成活率没有显著的变化，保持在75％以上。