茉莉酸合成关键酶基因FaOPR3调控草莓果实成熟

为了研究茉莉酸(Jasmonic acid,JA)合成路径关键酶基因FaOPR3在草莓果实成熟中的作用,测定了八倍体红颜草莓果实成熟过程中内源JA含量,并用外源茉莉酸甲酯(Me JA)涂抹草莓果实观察其果实着色情况及测定相关酶基因的表达,同时使用瞬时基因表达对草莓果实进行FaOPR3基因的超表达和干扰。结果显示草莓果实中内源JA含量从小绿果期到白果期急剧上升,到果实成熟后开始下降。草莓果实涂抹外源JA,能够促进果实发育和成熟。FaOPR3基因的过量表达可诱导果实内源JA含量的增加,并且可诱导色素合成基因FaCHS、FaCHI、FaF3H、FaUFGT、FaDFR的表达量上升。而FaOPR3基因干扰后果实内源JA含量降低,并且抑制相关色素代谢基因表达。说明FaOPR3基因能够促进草莓果实着色和成熟。     

FaPYL2在草莓果实成熟过程中发挥重要作用

【目的】为了验证脱落酸候选受体FaPYL2在草莓果实成熟过程中的作用。【方法】以八倍体‘蒙特瑞’草莓(Fragaria×ananassa cv.‘Monterey’)果实作为研究对象，利用农杆菌介导法瞬时果实侵染、亚细胞定位及等温滴定量热仪试验对FaPYL2进行功能鉴定。【结果】FaPYL2基因的表达随着草莓果实成熟而增加，并在片红期达到峰值。过表达FaPYL2基因促进果实成熟，增加花色苷和可溶性固形物积累，降低果实硬度，而沉默FaPYL2基因结果相反。另外，定位于细胞质中的FaPYL2直接与脱落酸结合，解离常数为67.56μmol/L,符合受体结合特性。【结论】FaPYL2作为一个潜在的脱落酸受体，正调控草莓果实的成熟。     

草莓果实中FaSAMDC基因的克隆、生物信息学及表达分析

【目的】为明确S-腺苷甲硫氨酸脱羧酶(SAMDC)在非呼吸跃变型草莓果实成熟中的作用。【方法】以‘北农香’草莓果实为试验材料,首先通过RT-PCR克隆FaSAMDC基因,其次通过SqRT-PCR分析发育果实(小绿、大绿、褪绿、白果、片红、全红)中的FaSAMDC基因的表达量。【结果】结果表明,FaSAMDC基因含有1 116bp开放阅读框,编码371个氨基酸,含有典型的脱羧酶保守功能结构域。随着草莓的果实发育,FaSAMDC表达量呈明显下降趋势并且在白果时期达到最低值,此后随着果实着色,表达量迅速上升并且成熟期达到最高。【结论】以上研究结果证实,S-腺苷甲硫氨酸脱羧酶可能参与草莓果实的成熟调控。     

生长素和脱落酸在草莓果实发育过程中的作用

草莓果实是非呼吸跃变型果实,关于其发育成熟的机理研究较少。以八倍体草莓甜查理为试材,分析了果实发育过程中脱落酸ABA和生长素IAA的含量,同时用ABA和IAA处理转色期的草莓果实,发现ABA能加速果实着色软化,抑制IAA的积累;相反IAA抑制果实着色软化,抑制ABA的积累。进一步分析表明ABA能降低IAA合成代谢路径中基因的表达水平,而IAA能降低ABA合成代谢路径中基因的表达水平。ABA能促进果实成熟相关基因的表达,包括与果实上色有关的基因如查尔酮合酶等,和与果实软化有关的基因如伸展蛋白基因等;但IAA表现为抑制。果实上色与软化直接影响草莓成熟进程。这些结果说明ABA和IAA协同调控了草莓果实的发育进程,为以后草莓果实品质的改善和育种提供了思路。     

ABA对草莓果实成熟和软化的调节

以‘法兰地’草莓为试材,研究草莓果实生长发育过程中内源脱落酸(ABA)含量、FaNCED基因表达量的变化以及外源ABA、去甲二氢愈创木酸(NDGA)和乙烯利处理对果实成熟软化的影响。结果表明:在草莓果实成熟过程中ABA含量和FaNCED表达量出现2次高峰,分别是花后35d(转色期)和花后45d(果实完熟期)。外源ABA促进FaNCED基因的表达及ABA的积累,促进草莓果实的成熟和后熟软化,NDGA处理表现出相反效果,喷施乙烯利表现不明显,推测ABA在草莓果实成熟和后熟软化中可能起着重要作用。     

草莓FaMRLK47蛋白原核表达条件优化

【目的】优化草莓FaMRLK47蛋白原核表达条件并在研究中应用。【方法】以八倍体草莓‘红颜’(Fragaria×ananassa Duch.‘Benihoppe’)为试材,对比研究异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(Isopropyl-beta-D-thiogalactopyranoside,IPTG)在0.5mmol/L和1mmol/L处理,对比分析0、2、4、6、8、12h等不同时间FaMRLK47蛋白诱导表达效率和产量。【结果】IPTG在1mmol/L下诱导8h,FaMRLK47蛋白的表达效率和产量高。【结论】优化草莓FaMRLK47原核诱导表达体系并检测FaMRLK47与寡糖的特异性结合。     

森林草莓FvWRKY22基因的克隆及表达分析

【目的】为了探究FvWRKY22在草莓抗重茬病中的调控作用。【方法】以森林草莓‘Hawaii 4’为材料,克隆FvWRKY22并对其序列进行生物信息学分析,利用qRT-PCR分析FvWRKY22在草莓不同组织中的相对表达量以及在受到重茬病诱导后该基因的表达模式。【结果】从森林草莓‘Hawaii 4’根部的cDNA文库中克隆到FvWRKY22基因,该基因在草莓根、茎、叶中均有表达,但在果实中的表达量相对较低;经过重茬病菌的处理后,FvWRKY22的表达量呈现先增加再降低再增加再降低的表达趋势。【结论】推测FvWRKY22基因可能与草莓重茬病的抗性有关。     

‘红颜’草莓体细胞胚发生过程中AP2/EREBP家族转录因子的表达分析及FaEREBP基因的克隆

【目的】筛选并克隆‘红颜’草莓(Fragaria×ananassa Duch.cv.‘Benihopp’)体细胞胚发生过程中AP2/EREBP家族特异性表达的基因,以期为草莓体细胞胚发生的分子调控机理研究提供理论依据。【方法】以‘红颜’草莓非胚性愈伤组织、胚性愈伤组织以及体细胞胚为试验材料,应用RNA-seq测序技术,筛选出差异表达的AP2/EREBP转录因子,并通过qRT-PCR技术,检测上调转录因子在非胚性愈伤组织、胚性愈伤组织、体细胞胚以及幼苗根、茎、叶等组织中的表达量,以同源克隆技术获得特异性表达的转录因子FaEREBP。【结果】FaEREBP编码区核苷酸序列全长822bp,编码273个氨基酸,其表达水平在胚性愈伤组织和体细胞胚中显著高于其他组织。【结论】FaEREBP是‘红颜’草莓体细胞胚发生潜在的重要转录因子。     

森林草莓FvM4K1基因的克隆及表达分析

【目的】旨在探究促分裂原活化蛋白激酶FvM4K1在森林草莓生长发育中的作用。【方法】从森林草莓(Fragaria vesca)‘Hawaii 4’中克隆FvM4K1基因编码区序列,对其进行生物信息学分析,然后利用荧光定量PCR分析FvM4K1在草莓不同器官中的相对表达量以及在1μmol/L生长素处理下基因相对表达量的变化趋势。【结果】在森林草莓‘Hawaii 4’的cDNA中克隆到FvM4K1基因,全长2 466 bp,共编码821个氨基酸,具有典型的激酶结构域,且其在根、茎、叶片、花朵、果实中皆有表达,尤其是在叶片、花朵和果实中的表达量相对较高。1μmol/L生长素处理使得FvM4K1的表达量呈现先增加后降低至初始水平的趋势。【结论】FvM4K1基因对生长素有响应,进一步推测其可能对草莓的生长发育产生影响。     

核桃内果皮苯丙氨酸解氨酶基因克隆及表达分析

【目的】苯丙氨酸解氨酶(PAL)为木质素单体生物合成途径中的关键酶。采用RT-PCR技术克隆露仁核桃WJ-PAL基因和硬壳完整核桃ZJ-PAL基因,研究PAL基因在硬壳完整和露仁核桃内果皮中发育过程中的表达特性。【方法】以‘温138’核桃为材料,‘纸皮’核桃作为对照,利用反转录PCR(RT-PCR)方法克隆WJ-PAL、ZJ-PAL基因、通过生物信息学方法分析,采用实时荧光定量PCR(qRT-PCR)分析WJ-PAL、ZJ-PAL在核桃硬核过程8个不同时期的表达特性。【结果】WJ-PAL基因cDNA序列包括600 bp ORF,编码200个氨基酸,分子量21.11 k D,理论等电点8.44; ZJ-PAL基因包含690 bp ORF,编码230个氨基酸,分子量24.10 kD,理论等电点7.44。实时荧光定量PCR分析表明,露仁核桃PAL基因在花后100 d的相对表达量为花后51 d相对表达量的117倍,硬壳完整核桃PAL基因在花后65 d相对表达量为花后72 d相对表达量的5倍,初步证明PAL基因在硬壳完整和露仁核桃的不同发育时期表达量存在明显差异。【结论】结果表明该基因参与核桃内果皮(硬壳)硬化过程,影响内果皮木质素的合成,从而造成核桃内果皮发育不全,出现露仁。     

外源6-BA对葡萄果实花色苷含量及相关基因表达的影响

【目的】阐明6-BA对葡萄果实花色苷含量及其生物合成相关基因表达的影响,为提高葡萄果实花色苷含量的研究提供参考。【方法】以‘梅洛’葡萄为试材,对其进行不同质量浓度(0,100,200,400mg/L)6-BA处理,研究6-BA对葡萄果实花色苷含量及其合成相关基因表达的影响,分析花色苷含量与其合成相关基因表达量的相关性。【结果】100mg/L 6-BA处理可提高葡萄果实花色苷含量,花后110d达到最大,为5.21mg/g;100mg/L 6-BA处理葡萄果实PAL、CHS1、F3′H、UFGT基因的表达量在花后90d显著提高,200mg/L 6-BA处理F3′5′H基因的表达量显著提高,400mg/L 6-BA处理则相反。相关性分析表明,100mg/L 6-BA处理葡萄果实花色苷含量与CHS1、UF-GT基因相对表达量呈显著正相关,200和400mg/L 6-BA处理组花色苷含量与PAL基因相对表达量呈显著和极显著正相关;100和400mg/L 6-BA处理组MybA1与UFGT的相对表达量呈显著正相关。【结论】低质量浓度6-BA处理有利于提高果实花色苷含量,在果实着色后期可影响花色苷合成相关基因的表达。     

CHS启动子差异片段在不同观赏海棠品种(系)中的功能验证

【目的】为探明查尔酮合酶基因的启动子序列差异在不同苹果属观赏海棠品种(系)中的功能。【方法】以‘王族’(Malus cv.‘Royalty’)和M10-5 (Malus M10-5)及‘火焰’(Malus cv.‘Flame’)叶片为试材,克隆得到McCHS基因的启动子,并进行序列比对。检测McCHS基因在3个品种(系)中的表达水平,进一步通过酵母单杂交和凝胶阻滞迁移分析确定McCHS基因的启动子序列差异和调控花色素苷生物合成关键MYB转录因子McMYB10的结合关系。【结果】‘火焰’McCHS基因启动子与‘王族’McCHS基因启动子序列比对发现,‘火焰’McCHS基因启动子中有743 bp的缺失,而M10-5的McCHS基因启动子同时拥有缺失和完整的两种启动子序列;酵母单杂交和凝胶阻滞迁移结果表明,743 bp缺失序列能够和McMYB10结合,而且McCHS基因的表达量和花色素苷含量呈相同趋势。【结论】McCHS基因的启动子序列差异可能影响观赏海棠叶片着色。     

草莓果实酯类合成关键酶基因SAATB2和VAATW2表达特性分析

利用RT-PCR的方法,分别从凤梨草莓栽培品种‘红颜’和森林草莓白果类型的成熟果实中克隆酯类合成关键酶基因SAATB2和VAATW2。利用半定量RT-PCR和酶活性测定分别对SAATB2、VAATW2在不同组织和花后不同发育时间果实中的表达情况进行分析。结果发现,SAATB2主要在果实中表达,而VAATW2则在叶片和果实中都有表达,说明AAT在草莓组织中的表达特性存在种间差异。而SAATB2和VAATW2在果实发育期间具有相同的表达趋势,表达量随果实发育先升高后降低,最大表达量均出现在完全成熟前后,但达到最大值的时间略有不同。‘红颜’和森林草莓的果实挥发性酯类质量分数随果实发育升高,完全成熟时达到最大质量分数,与AAT基因表达量的变化基本一致。     

外源6BA对葡萄果实花色苷含量及相关基因表达的影响

【目的】阐明6BA对葡萄果实花色苷含量及其生物合成相关基因表达的影响,为提高葡萄果实花色苷含量的研究提供参考。【方法】以‘梅洛’葡萄为试材,对其进行不同质量浓度（0,100,200,400 mg/L）6BA处理,研究6BA对葡萄果实花色苷含量及其合成相关基因表达的影响,分析花色苷含量与其合成相关基因表达量的相关性。【结果】100 mg/L 6BA处理可提高葡萄果实花色苷含量,花后110 d达到最大,为5.21 mg/g;100 mg/L 6BA处理葡萄果实PAL、CHS1、F3′H、UFGT基因的表达量在花后90 d显著提高,200 mg/L 6BA处理F3′5′H基因的表达量显著提高,400 mg/L 6BA处理则相反。相关性分析表明,100 mg/L 6BA处理葡萄果实花色苷含量与CHS1、UFGT基因相对表达量呈显著正相关,200和400 mg/L 6BA处理组花色苷含量与PAL基因相对表达量呈显著和极显著正相关;100和400 mg/L 6BA处理组MybA1与UFGT的相对表达量呈显著正相关。【结论】低质量浓度6BA处理有利于提高果实花色苷含量,在果实着色后期可影响花色苷合成相关基因的表达。     

草莓果实基因表达与花色苷代谢的关系

为进一步探究草莓果实花色苷合成过程中各个酶的作用,明确草莓果实花色苷的代谢机制,以‘阿尔比’草莓(Fragaria×ananassa‘Albion’)为试材,利用RT-PCR从草莓果实中克隆到DFR、ANS和LAR基因的编码序列,对预测的氨基酸序列进行分析,结果表明:各基因与NCBI(美国国立生物技术信息中心)上已有的草莓品种‘Queen Elisa’及‘Korona’(Fragaria×ananassa)所对应基因的同源性高达99％～100％.半定量RT-PCR分析表明,DFR基因依次在幼果期、白熟期和红熟期出现了3个表达峰值,其中红熟期最大;ANS基因的表达量在白熟期后迅速增加,红熟期达最大值;LAR基因的最大表达量出现在幼果期,后呈降低趋势.草莓果实发育过程中,DFR基因在幼果期和红熟期的表达峰值分别与黄烷-3-醇类和花色苷的合成峰值相一致,ANS及LAR分别与花色苷和黄烷-3-醇类的合成密切相关.     

东方百合查尔酮异构酶基因LhCHI的克隆及表达

利用RT-PCR结合RACE的方法从东方百合‘索邦’花被片中克隆了查尔酮异构酶(CHI)基因,命名为Lh CHI(Gen Bank登录号为KJ784468)。该基因开放阅读框702 bp,编码233个氨基酸,预测该蛋白相对分子质量25 KD,等电点(p I)为4.7。同源比对和系统进化分析表明,Lh CHI基因编码的氨基酸序列具有查尔酮异构酶典型的催化活性保守位点,与百合科郁金香(Tulipa fosteriana)查尔酮异构酶序列一致性为83.3%。半定量PCR和荧光实时定量PCR分析结果表明,Lh CHI基因在百合的根、茎、叶片、鳞茎、开放花被片、花药以及柱头中均有表达,花器官中相对表达量较高,花发育后期的柱头、花柱、花被片等组织中Lh CHI基因表达水平普遍高于花发育早期。     

红花查尔酮异构酶基因全长cDNA的克隆及表达分析

【目的】克隆红花(Carthamus tinctorius L.)黄酮合成途径中的关键酶查尔酮异构酶(Chalcone isomerase,CHI)基因的全长序列,研究其组织表达特异性,为红花代谢调控研究提供参考。【方法】利用RT-PCR技术克隆CHI基因的cDNA全长,并对其全长基因进行生物信息学分析;构建系统发育树,研究其与相似序列的同源性;利用实时荧光定量PCR方法,分析CHI基因在红花不同开花时期的表达量。【结果】CHI基因全长1 161bp,开放阅读框长654bp,编码217个氨基酸,理论分子质量约为23.14ku,等电点为5.67,序列含有典型的加尾信号序列AATAA和Poly(A)。系统发育树表明,该基因与其他物种CHI基因具有较高的同源性,其中与青木香的同源性最高,达到82%。实时荧光定量PCR结果表明,CHI基因在红花花蕾期的表达量最高。【结论】克隆得到了红花CHI基因,其在红花花蕾期的表达量最高。     

基于转录组测序的铁皮石斛黄酮代谢途径及相关基因解析

【目的】分析铁皮石斛Dendrobium officinale黄酮类化合物的生物合成途径及相关基因,为铁皮石斛黄酮类化合物代谢调控、药用价值的开发研究提供参考。【方法】利用Illumina HiSeq 4000测序平台对铁皮石斛2个生长阶段茎、叶进行高通量转录组测序,对组装获得的unigenes进行功能注释和黄酮类化合物的生物合成相关基因解析。【结果】铁皮石斛黄酮类化合物代谢相关Unigenes 48个,涉及14个酶。5个CHS相关Unigenes具有CHSlike保守结构域,活性位点氨基酸残基(Cys-His-Asn)高度保守,丙二酰辅酶A结合位点和产物结合位点的部分氨基酸残基发生变异。CHI(Unigene0013781)属于类型I查尔酮异构酶,异构化6′-羟基查尔酮为5-羟基黄烷酮。表达分析表明,2个生长时期的茎和叶,CHS(Unigene0008250)、 CHI(Unigene0013781)和F3H的表达量都高于CHS(Unigene0012884)和C3′H。【结论】通过对转录组数据分析,共获得铁皮石斛黄酮类化合物代谢相关Unigenes48个,涉及14个酶;5个CHS相关Unigenes中,2个编码查尔酮合酶,3个编码联苄合酶;CHI(Unigene0013781)属于类型I查尔酮异构酶。     

ALA对苹果幼果黄酮含量及CHS和CHI基因表达的影响

【目的】分析5-氨基乙酰丙酸(ALA)处理对苹果幼果黄酮含量及查尔酮合成酶基因(CHS)、查尔酮异构酶基因(CHI)表达量的影响,以确定适宜的ALA处理质量浓度和处理时间。【方法】在苹果疏果期前,用0(对照),100,200,300和400mg/L ALA处理苹果幼果,采用紫外分光光度法测定ALA处理后3,6,9,12d幼果中的黄酮含量,同时利用荧光定量法测定幼果中CHS和CHI基因的相对表达量。【结果】在ALA质量浓度为0~300mg/L时,随着ALA质量浓度的升高,苹果黄酮含量与CHS、CHI基因表达量均相应升高;在ALA质量浓度升至400mg/L时,各项指标均表现出下降趋势。用不同质量浓度ALA处理苹果幼果后,幼果的黄酮含量和CHS、CHI基因表达量均较对照明显提高,其中黄酮含量在处理后12d达到最高,而CHS和CHI基因相对表达量在处理9d时达到最高,12d后开始下降。【结论】为提高苹果疏除果中的黄酮含量,宜选择300mg/L的ALA在疏果前6~9d对苹果幼果进行喷洒。     

砂梨品种‘满天红’及其芽变品系‘奥冠’花青苷合成与相关酶活性研究

【目的】研究红色砂梨花青苷合成与苯丙氨酸解氨酶（PAL）和查尔酮异构酶（CHI）活性的关系。【方法】以红色砂梨‘奥冠’及其亲本‘满天红’为试材,研究果实着色过程中果皮中花青苷含量和PAL、CHI酶活性的变化,以及套袋对花青苷合成和相关酶活性的影响。【结果】在果实着色过程中,‘奥冠’花青苷含量高于‘满天红’,两个品种花青苷变化趋势基本一致,呈现先升高后下降的趋势;两品种PAL活性总体变化趋势基本一致,都呈下降趋势,且‘奥冠’PAL酶活性总体低于‘满天红’;并且,两品种CHI酶活性呈现相似的变化趋势,总体呈上升趋势;同时,‘奥冠’CHI酶活性高于‘满天红’;套袋抑制了‘奥冠’CHI酶的活性,也抑制了花青苷的合成,但对PAL酶活性的影响不明显;解袋后CHI酶活性和花青苷含量迅速上升,均超过了对照。但解袋对‘奥冠’果实PAL酶活性的影响不明显;并且,套袋‘奥冠’花青苷含量在果实成熟时下降。【结论】红色砂梨花青苷含量在果实着色早期上升,接近果实商品成熟期下降。PAL不是红色砂梨花青苷合成的关键酶,CHI与着色期砂梨花青苷含量关系密切。解袋后,‘奥冠’通过提高CHI酶的活性促进花青苷的合成。套袋试验表明：砂梨花青苷果实成熟时的降解不单是由光诱发的。光是花青苷合成的必需因素,同时又促进花青苷的降解。