结缕草肌动蛋白基因全长cDNA的克隆及序列分析

根据植物肌动蛋白(Actin)基因编码区的保守序列设计引物,提取结缕草叶片的总RNA,进行RT-PCR。并采用RACE技术扩增出1560bp的Actin基因全长cDNA序列。序列分析表明,该基因的开放阅读框(ORF)为1134bp,编码377个氨基酸,5′非编码区117bp,3′非编码区309bp。所得序列与GenBank中收录的其他植物肌动蛋白核苷酸序列的一致性均在85%以上,氨基酸序列的一致性高达97%以上。将其命名为ZjACT,GenBank登录号为GU290545。根据高等植物肌动蛋白相似性构建的系统进化树显示,结缕草肌动蛋白与大麦和圆锥小麦肌动蛋白之间的亲缘关系最为密切,在进化中分化时间最为接近。进一步分离克隆了结缕草Actin基因的基因组DNA序列(登录号GU290546),它由4个外显子和3个内含子组成。本研究有助于揭示植物Actin基因家族的进化历史,为研究植物Actin基因家族功能和进化上的多样性奠定理论基础,同时也为开展草坪草和牧草Actin基因的功能分析和利用研究提供参考。     

日本结缕草滞绿基因 ZjSGR 对烟草的转化及功能分析

SGR 基因是植物体内调控叶绿素降解的关键基因之一,在调控植物衰老以及响应非生物胁迫等方面也发挥着重要的作用。 本研究利用 DNA 重组技术,构建 35S::ZjSGR:YFP 植物表达载体,并通过农杆菌介导的方法成功转化烟草。PCR 和 qRT-PCR 结果显示日本结缕草滞绿基因ZjSGR已整合到烟草基因组中,并能够在转基因烟草中高效表达。在正常生长环境下,转基因烟草表现出黄化的表型。与对照相比叶绿素含量较低,光合速率下降。亚细胞定位实验证明ZjSGR定位在叶绿体,透射电镜观察结果表明过表达ZjSGR基因使叶绿体发育异常,且有加速降解的趋势。qRT-PCR结果发现转ZjSGR基因的烟草中SAG113,SAG12,NCED和AAO3的表达量明显高于野生型,衰老进程明显加快。本研究证明ZjSGR可在调控叶绿素降解和衰老的进程中发挥重要作用。     

Gateway技术构建结缕草低温和干旱诱导cDNA文库及其质量鉴定

为研究结缕草（Zoysia japonica）胁迫响应信号转导途径中的关键基因,揭示结缕草抗逆分子机制,建立结缕草功能基因组学研究基础平台,以经低温、干旱处理的结缕草为材料,采用Gateway技术构建了首个结缕草低温和干旱诱导的标准cDNA文库。文库质量分析表明,未扩增的原始文库滴度1.76×106 pfu·mL-1,库容7.04×106 pfu,插入片段平均大小大于1 kb,重组率90%。文库质量优良,可能包含大量新基因,不仅能为结缕草功能基因组分析提供必要资源,也可为后期进行高通量EST测序、发掘新抗逆相关基因、制作基因芯片等研究奠定基础。     

日本结缕草ZjTCP20基因生物信息学及表达模式分析

TCP是高等植物所特有的一类转录因子,参与调控植物的生长发育、衰老及逆境应答等多个生物学过程。本研究从日本结缕草(Zoysia japonica)中克隆出ZjTCP20基因,并对该基因进行生物信息学分析、自激活检测、表达模式分析等来探究该基因特性。ZjTCP20基因完整编码区为624 bp,编码208个氨基酸。ZjTCP20蛋白无信号肽,具有疏水性,系统发育进化树结果显示其与玉米(Zea mays)ZmTCP20亲缘关系最近。亚细胞定位显示该蛋白定位于叶绿体、细胞质和细胞核上。ZjTCP20基因表达模式结果显示,该基因在幼嫩叶片中大量表达,随植物发育表达量逐渐减少,但茉莉酸甲酯(MeJA)等3个激素对基因的表达量没有显著影响。酵母自激活试验显示ZjTCP20具备自激活活性。本研究为进一步研究ZjTCP20基因提供了科学依据。     

日本结缕草ZjNOL基因的克隆及转录自激活检测

NYC1-like(NOL)编码的短链氧化还原酶是叶绿素b降解的必需酶。对日本结缕草(Zoysia japonica)ZjNOL基因全长克隆结果显示,该基因开放阅读框为981个核苷酸,编码327个氨基酸。生物学分析显示,ZjNOL蛋白与高粱(Sorghum bicolor)中的NOL蛋白的亲缘关系最近。利用pGBKT7载体,通过DNA重组技术成功构建pGBKT7-ZjNOL酵母表达载体,通过PEG介导的转化方法,成功导入Y2HGold酵母中,自激活检测显示含有pGBKT7-ZjNOL的Y2HGold酵母细胞能够在SD/-Trp培养基上正常生长,而在SD/-Trp/AbA培养基上不能生长,也不能在含有X-α-Gal培养基显蓝色,证明ZjNOL蛋白没有自激活活性。生物信息学分析及转录自激活检测有助于深入研究ZjNOL基因功能,为延长结缕草绿期,改善结缕草坪用质量奠定基础。     

不同施肥处理对杂交结缕草草坪盖度及成坪时间的影响

通过不同的施肥处理,结果表明,杂交结缕草播种后不同天数之间草坪的盖度不同,各处理之间的盖度存在显著差异。在16个处理中,施用N 6 g/m2、P2O5 g/m2草坪的盖度最大;不同处理的成坪时间之间也存在显著差异,施用N 6g/m2、P2O5 4g/m2成坪时间最短,为93 d。     

不同施肥处理对杂交结缕草草坪盖度及成坪时间的影响

通过不同的施肥处理,结果表明,杂交结缕草播种后不同天数之间草坪的盖度不同,各处理之间的盖度存在显著差异.在16个处理中,施用N 6g/m2、P2O54g/m2草坪的盖度最大;不同处理的成坪时间之间也存在显著差异,施用N 6g/m2、P2O5 4g/m2成坪时间最短,为93 d.     

日本结缕草ZjHY5的克隆、亚细胞定位及转录自激活检测

转录因子LONG HYPOCOTYL 5(HY5)在光诱导基因表达中起中心调控因子的作用。为了探究日本结缕草(Zoysia japonica)中ZjHY5基因的亚细胞定位及自激活特性,本研究从日本结缕草(Zoysia japonica)中克隆得到ZjHY5基因。该基因开放阅读框为711 bp,编码236个氨基酸残基。ZjHY5蛋白无信号肽,进化树分析显示其与漆姑草(Sagina japonica)及苜蓿(Medicago sativa)中HY5蛋白的相似度最高。亚细胞定位结果显示,ZjHY5定位于细胞核中。通过构建酵母诱饵载体,并对其进行自激活检测,结果显示,ZjHY5基因无自激活活性,可用于后续试验。本试验为深入研究日本结缕草ZjHY5基因的功能奠定了基础。     

日本结缕草ZjNAC3基因在盐胁迫中的功能

盐胁迫能够加速草坪草的黄化,影响草坪的坪观质量.植物中的NAC转录因子在盐胁迫条件下发挥着重要作用,参与胁迫响应,而在日本结缕草(Zoysia japonica)中还鲜有NAC转录因子的功能研究.本研究对转ZjNAC3基因(GenBank登录号:MT254544)的YPH500酵母菌株进行盐敏感性检测,初步判定ZjNAC3在盐胁迫下具有负调节酵母细胞生长的作用;对过表达ZjNAC3基因的拟南芥(Arabidopsis thaliana)株系进行盐处理,发现150 mmol·L?1 NaCl处理7 d后转基因植株的生长明显弱于野生型(wild type,WT),脯氨酸含量、丙二醛含量、细胞膜透性均显著高于WT(P<0.05),而叶绿素、可溶性糖含量显著低于WT(P<0.05);AtNHX1基因的表达量显著低于WT(P<0.05),表明过表达ZjNAC3基因降低了拟南芥植株的耐盐性.分析认为ZjNAC3通过减弱渗透调节、增加细胞受损和降低将Na+隔离到液泡的作用,从而使得转基因拟南芥植株表现出盐敏感的性状.本研究揭示了ZjNAC3是一个负调控植物耐盐性的重要基因,为之后探究NAC转录因子调控日本结缕草的耐盐性及其机理奠定了基础.     

日本结缕草ZjNAC3基因在盐胁迫中的功能

盐胁迫能够加速草坪草的黄化,影响草坪的坪观质量.植物中的NAC转录因子在盐胁迫条件下发挥着重要作用,参与胁迫响应,而在日本结缕草(Zoysia japonica)中还鲜有NAC转录因子的功能研究.本研究对转ZjNAC3基因(GenBank登录号:MT254544)的YPH500酵母菌株进行盐敏感性检测,初步判定ZjNA...     

猪带绦虫六钩蚴cDNA文库的构建与筛选

在体外将猪带绦虫虫卵孵化为有活力的六钩蚴。采用商品化试剂盒抽提六钩蚴总 RNA、m RNA,反转录为双链c DNA,再加 Eco R Adapter。在去除小片段后 ,dsc DNA与 λgt11噬菌体 DNA连接 ,经蛋白包装 ,构建了猪带绦虫六钩蚴λgt11c DNA文库。该文库效价为 3.5× 10 9pfu/ m L ,重组 DNA片段大小为 0 .5～ 3.2 kb,平均为 1.6 kb,蓝白斑比 1∶ 9。用抗体探针对文库进行免疫学筛选 ,在消除非特异性反应的基础上筛选约 10 6 重组子 ,共得到 118株强阳性克隆 ;应用 PCR鉴定上述部分阳性克隆 ,均扩增到 0 .5 kb以上的片段。结果显示 ,构建的文库合格 ,含六钩蚴所有抗原基因 ,可用于六钩蚴 c DNA克隆的筛选 ;用免疫学与 PCR联合筛选 c DNA文库 ,可消除假阳性     

猪带绦虫六钩蚴cDNA文库的构建及免疫原基因的筛选与克隆

研究避开庞大的猪带绦虫基因组DNA,以构建六钩蚴发育阶段的cDNA表达文库为策略,利用pSPORT1质粒表达载体首次成功构建了表达文库。经库容量、重组率和代表性测定,库容量达5.0×106,重组率100%,用特异性引物能扩增出六钩蚴发育阶段10ku基因、18ku基因和45W基因家族的A型、B型、C型转录本,说明文库质量高,代表性强。应用快速筛选质粒表达文库和克隆免疫原基因的技术,成功地筛选和克隆到TsO1基因,其完整阅读框架(ORF)为393bp。将其登录到GenBank(AY327451),经BLAST分析,证实是猪带绦虫六钩蚴发育阶段的1个新免疫原基因。     

桑树幼叶cDNA文库的构建及部分表达序列标签分析

基于为鉴定和克隆桑树功能基因提供基础信息的目的,采用RNA转录5′末端转换(SMART)法构建了桑树幼叶全长cDNA文库。该文库容量为1.02×106pfu/mL,重组率95%,符合构建基因文库的质量要求。从构建的桑树幼叶cDNA文库中随机挑取48个克隆进行表达序列标签(EST)测序,有效序列为32条,经UniGene数据库归并后为32条,UniGene比率为100%;与NCBI核酸数据库进行比对、查询和注释,在32条序列中有29条序列具有同源性,其中16条为全长序列,完整性比率为55.2%;初步发现具有已知功能基因的ESTs 6个,具有推测功能基因的ESTs 5个,未命名或未知功能基因的ESTs 21个。     

ST细胞酵母双杂交cDNA文库的构建及鉴定

为了筛选与猪细小病毒（porcine parvovirus,PPV）结构蛋白VP2相互作用的宿主蛋白,深入研究病毒入侵及致病的分子机制,本试验建立了ST细胞酵母双杂交cDNA文库。采用RNeasy Min Kit提取ST细胞的总RNA,反转录合成cDNA第一链之后,通过SMART技术合成了双链cDNA,并利用同源重组的方法,构建了ST细胞的酵母cDNA文库。结果显示,文库滴度为8.1×10⁸ CFU/mL,插入的双链cDNA片段大小为250~1 000 bp,平均大小约为500 bp,文库的重组率为96%。此文库可用于筛选与病毒相互作用的ST细胞宿主蛋白,为进一步阐明病毒的致病机制奠定了基础。     

鹿茸尖端组织核心蛋白多糖基因全长cDNA的克隆及其表达分析

为了进一步了解鹿源DCN基因的结构与功能,揭示该基因在鹿茸尖端不同组织层的表达规律,本研究从梅花鹿鹿茸尖端组织cDNA文库中首次克隆具有完整编码区的DCN基因全长cDNA序列,并结合生物信息学方法和实时荧光定量RT-PCR技术对该基因的氨基酸序列结构和表达特征进行分析.结果表明,梅花鹿DCN基因cDNA全长为1 831 bp,编码360个氨基酸;其编码蛋白具有N端信号肽,相对分子质量为39.9 ku,理论等电点为8.8,其一级结构中亮氨酸所占比例最高(12.5%);梅花鹿与绵羊DCN氨基酸序列的相似性最高(98%).实时荧光定量RT-PCR分析表明,DCN在间充质层的表达显著高于其他3层组织,提示DCN的抗纤维化活性可能是维持鹿茸间充质层快速生长的重要调节因素.     

Construction and Characterization of the Yeast Two-hybrid cDNA Library of ST Cells

To seek out proteins interact with VP2 structural protein of porcine parvovirus (PPV) in ST cell and study the molecular mechanisms of viral infection and pathogenicity, a ST cDNA yeast hybrid library was created. Firtly,the total RNA of ST was extracted using RNeasy Min Kit,and double strands cDNA was synthesized by SMART technique. Then, the ST cDNA library was successfully created by homologous recombination in yeast, the titer was 8.1×10⁸ CFU/mL, the inserts varied from 250 to 1 000 bp,the average of inserted fragments was about 500 bp,and the recombination rate was 96%.These datas indicated that the yeast two-hybrid cDNA library was successfully constructed and might be useful for screening the host proteins interacting with structure protein of PPV.     

兰引3号结缕草成坪期施肥量与养分吸收量相关性研究

通过兰引3号结缕草肥效试验，分析了施肥对植株养分吸收量的影响。结果表明，在成坪期，随着N、P、K肥用量的增加，植株对养分吸收量呈逐渐增加的趋势。相关分析结果表明，地上部N吸收量与施N量呈极显著相关(r=0．8858)，地下部N吸收量与施N量之间呈极显著相关(r=0．7463)；K吸收量与施K量之间相关不显著，而与施N量呈极显著相关(r=0．7921);氮肥能促进植株对钾的吸收。