小檗碱／IGF-Ⅰ对猪体外受精胚胎发育作用初探

【目的】初步探讨小檗碱(Berberine,Ber)和胰岛素样生长因子I (Insulin like growth factorI,IGF-I)对猪体外受精胚胎发育效果的作用。【方法】通过在NCSU-23基础培养液中添加IGF-I (50、100、150ng/mL),筛选出最佳质量浓度;以添加Ber (0.1μg/mL,Ber组)、最佳质量浓度的IGF-I (IGF-I组,100ng/mL)和同时添加二者(Ber+IGF-I组)为三个试验组,观察猪体外受精胚胎的发育效果,并检测各组别IGF-I、IGF-IR(Insulin-like growth factor I recepter,胰岛素样生长因子I受体)转录水平。【结果】IGF-I 100、150ng/mL组胚胎各时期发育率均极显著高于对照组和50ng/mL组(P0.01),100ng/mL与150ng/mL组之间无显著差异(P0.05),最佳质量浓度为100ng/mL;Ber组、IGF-I组、Ber+IGF-I组胚胎各时期发育率、IGF-I、IGF-IR转录水平均极显著高于对照组(P0.01),但三组之间均无显著差异(P0.05)。【结论】Ber和IGF-I可显著提高猪体外受精胚胎发育率,提高其内源性IGF-I、IGF-IR基因转录水平,但同时添加二者与单独添加相比并无显著变化,推测二者可能参与介导同一个信号通路,有待进一步研究。     

HMGCS1基因对猪肌肉生长发育的影响及 miRNA-18a/b对HMGCS1基因的调控

【目的】研究HMGCS1基因对猪骨骼肌生长发育的影响及其靶标的验证。【方法】采用real-time PCR对通城猪不同组织以及背最长肌不同发育时间点的HMGCS1基因的表达变化进行检测。【结果】①HMGCS1基因在成年猪肺组织中的表达量最高;②在背最长肌发育中,该基因分别在胚胎期33 和65 d高表达,出生后20、30、40和60 d低表达;③双荧光素酶试验显示,转染miR-18a/b minics组荧光素酶活性低于对照组。【结论】HMGCS1参与了猪骨骼肌生长发育过程,并受miR-18a/b的调控,是猪的产肉性状的潜在候选基因。     

川芎嗪和小檗碱对猪卵母细胞体外成熟效果的影响

以mTCM-199添加抗生素为对照组,以分别添加0．5μg／mL川穹嗪（1igustrazine,Lig）和0．1μg／mL小檗碱（berberine,BR）为试验组,初步探讨川芎嗪、小檗碱对猪卵母细胞体外成熟效果的影响,以期提高猪卵母细胞体外成熟率。试验结果表明：以卵丘扩散和第一极体排出率分别作为猪卵母细胞体外成熟的判断标准,Lig组和BR组均显著高于对照组（P〈0．05）,Lig组和BR组间无显著差异（P〉O．05）。结论：川芎嗪和小檗碱对猪卵母细胞体外成熟具有一定的促进作用。     

猪HIF-1α基因启动子区及编码区的生物信息学分析

利用生物信息学方法,对NCBI中公布的猪缺氧诱导因子HIF-1α基因的5′端上游2 000 bp长度的候选启动子区进行了核心启动子及转录结合位点的预测;同时对其所编码蛋白的理化性质、亚细胞定位、跨膜结构域、信号肽、高级结构及进化关系进行了分析。结果显示：猪HIF-1α基因5′端上游存在潜在启动子区,存在CpG岛,存在多个转录因子结合位点,编码的蛋白为亲水性蛋白;蛋白质等电点为5.11,共由824个氨基酸组成,含量最高的为亮氨酸。HIF-1α蛋白主要定位于细胞核内,不存在跨膜结构域,为非跨膜蛋白,不存在信号肽,二级结构主要为α-螺旋及无规卷曲。此外通过对猪HIF-1α基因序列的同源性比较发现,与猪HIF-1α基因同源性最近的是绵羊,同源性最远的是原鸡。此研究为猪HIF-1α基因结构和功能的探索提供了一定的理论依据。     

小檗碱对NIT-1细胞胰岛素分泌的影响

目的 探讨小檗碱对NIT-1细胞胰岛素分泌的影响及可能的作用机制。方法 采用小檗碱干预后,用MTT法、放射免疫法及Western blotting确定小檗碱干预的合适浓度范围及检测NIT-1细胞胰岛素水平和腺苷酸活化蛋白激酶（AMP-activated protein kinase,AMPK）蛋白的表达。结果 小檗碱在浓度为100 μmol/L时对基础培养基和高糖培养基干预的NIT-1细胞的增殖存在显著性抑制作用（P<0.05）;而小檗碱在浓度为30 μmol/L时就明显抑制高脂培养基诱导的NIT-1细胞的增殖（P<0.05）。小檗碱分别对基础、高糖和高脂诱导的NIT-1细胞短时相干预（1 h）后,显示葡萄糖刺激胰岛素分泌（GSIS）被明显抑制（P<0.05）;小檗碱对高糖高脂诱导的NIT-1细胞长时相干预（24 h）后显示基础胰岛素分泌和GSIS均有一定的增加（P<0.05,P<0.01）。小檗碱可以促进高糖高脂诱导的NIT-1细胞AMPK蛋白的表达。结论 小檗碱不仅仅作为一种AMPK激活来调节胰岛素分泌,其也可能通过其他的通路进一步影响胰岛素分泌。     

小檗碱对猪卵巢卵母细胞体外成熟及其脂滴含量和分布的影响

[目的]探明不同形态的猪卵巢中卵母细胞体外成熟效果与脂滴的相关性,以及小檗碱对其的影响.[方法]将卵泡型卵巢GV期和黄体型卵巢GV期卵母细胞分别用添加小檗碱的成熟液体外成熟,观察体外成熟效果;用尼罗红染色的方法测定成熟前后的卵母细胞的脂滴含量,并观察成熟后各组卵母细胞脂滴的分布.[结果]卵泡型卵母细胞的颗粒细胞扩散率和第一极体排出率均显著高于黄体型卵母细胞(P＜0.05),小檗碱(Berberine,Ber)组卵母细胞的颗粒细胞扩散率显著高于对照组(P＜0.05),第一极体排出率极显著高于对照组(P＜0.01);体外成熟后,对照组卵母细胞中脂滴含量显著降低(P＜0.05),小檗碱组极显著降低(P＜0.01),且极显著低于对照组(P＜0.01).黄体型卵母细胞的脂滴含量则显著低于卵泡型(P＜0.05).猪卵母细胞成熟后的脂滴分布为分散型、外围型和不规则型,卵泡型卵母细胞脂滴主要呈分散分布,黄体型卵母细胞脂滴主要呈外围分布,并且黄体型卵母细胞脂滴呈不规则分布多于卵泡型.[结论]小檗碱能明显促进猪卵母细胞体外成熟,且卵泡型成熟效果显著好于黄体型;体外成熟后,卵母细胞脂滴逐渐减少,小檗碱组脂滴含量极显著减少,且黄体型卵母细胞脂滴含量明显减少;猪卵母细胞内脂滴的分布与卵巢所处的时期有关.     

猪干扰素α1与胸腺肽α1融合蛋白原核表达系统的建立

依据GenBank已发表的猪干扰素α1(poIFN-α1)成熟肽基因序列,胸腺肽α1(THY-α1)蛋白序列及Escherichia coliB密码子使用频率表,优化并人工合成poIFN-α1和THY-α1基因,利用SOE-PCR法在poIFN-α1和THY-α1之间设计1个13肽Linker。将融合基因克隆至pRSFDue-t 1表达载体,转化BL21(DE3)感受态,37℃培养至菌液OD600为0.6~0.8,IPTG(0.5 mmol/L)诱导,20℃培养12h,SDS-PAGE和Western blot鉴定。结果表明:目的蛋白为菌体内可溶性表达,经强阴离子交换层析和疏水层析纯化获得高纯度poIFNα1-THYα1融合蛋白。     

HIF-1反义核酸对金鱼HIF-1α及其靶基因VEGF表达水平的影响

金鱼是低氧耐受能力最强的淡水鱼类之一,低氧诱导因子-1(hypoxia induced factor,HIF-1)在动物低氧应答调节中发挥关键作用,目前尚没有关于鱼类HIF-1抑制剂的研究报道。试验分析了HIF-1反义寡聚核苷酸对金鱼肝脏组织HIF-1及其靶基因血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor,VEGF)的基因表达差异。荧光定量PCR结果显示,低氧状态下,30,60 mg/kg剂量的反义核酸能有效抑制VEGF基因的表达,但对HIF-1αm RNA水平没有影响。制备金鱼HIF-1兔源多克隆抗体并进行Western Blot分析,结果显示,60 mg/kg剂量的反义核酸抑制低氧所诱导的HIF-1蛋白水平的上升,表明合成的反义核酸能够特异性地抑制金鱼HIF-1 m RNA的翻译。金鱼HIF-1抗体的合成及反义寡聚核苷酸的制备,可为进一步探索金鱼独特的低氧应答机制提供有效研究手段。     

低氧环境下甘肃鼢鼠延髓中c-Fos和HIF-1α的表达模式分析

[目的]低氧环境可造成中枢神经系统的损伤,延髓可通过对自身的调控来应对低氧协迫.本研究利用甘肃鼢鼠自身的低氧适应能力来分析其与SD大鼠延髓中不同核团的低氧适应机制.[方法]采用免疫组织化学法,在常氧、急性低氧和间歇性慢性低氧条件下,分析延髓孤束核(NTS)、灰质(GC)及蓝斑核(LC)中c-Fos和HIF-1α的表达....     

人HIF-1α基因重组减毒沙门氏菌载体的构建及稳定性检测

利用RT-PCR方法从低氧预处理的A549细胞中获得HIF-1α基因片段,将其定向插入pIRES-SEQ质粒NheⅠ、MLuⅠ2个酶切位点之间,得到真核表达载体pIRES-HIF-1α;采用电转化方法将其电转化入减毒沙门氏菌Ty21α中,获得重组减毒沙门氏菌菌株TPH;转染A549细胞,RT-PCR法检测HIF-1α基因表达,ELISA方法检测HIF-1α蛋白表达;TPH菌株在氨苄青霉素(+)和氨苄青霉素(-)LB培养板上分别传代40代,每10代提取质粒进行PCR及酶切鉴定.结果表明:试验成功构建了携带HIF-1α基因的重组减毒沙门氏菌TPH,其可在体外细胞中稳定表达HIF-1α基因及蛋白,TPH可稳定遗传.     

高原鼠兔HIF-1α基因真核表达载体的构建及细胞表达和定位

利用PCR从克隆质粒PMD18-T-pHIF-1α中扩增鼠兔HIF-1α;构建重组质粒pcDNA3.0/6Xmyc-p HIF-1α,用重组质粒转染HEK-293T,HeLa和COS-7细胞,通过免疫印迹分析,检测HIF-1α表达蛋白在细胞中的分布。EcoRI和XhoⅠ酶切鉴定和序列分析表明,构建的pcDNA3.0/6Xmyc-pHIF-1α真核表达载体序列正确;HIF-1α在真核细胞中能够正确表达,且其表达产物主要存在于细胞核中。     

中草药肉苁蓉和黄芪对猪早期胚胎体外发育的影响

利用猪体外受精的胚胎进行研究,比较了在培养基NCSU-23中添加中药成分肉苁蓉和黄芪对早期胚胎发育的影响,实验证明:(1)培养液中添加体积比0.10%的肉苁蓉和0.10%的黄芪,肉苁蓉添加组囊胚率(15.76%)显著高于空白组(9.26%)(P<0.05),黄芪添加组囊胚率(10.09%)与空白组(9.26%)差异不显著(P>0.05),表明肉苁蓉能够显著促进早期胚胎发育。(2)肉苁蓉添加浓度(V/V)为0.05%和0.10%时,囊胚率(17.02%和16.75%)显著高于空白组(0)(P<0.01)和0.15%组(8.94%)(P<0.05)。(3)培养液在2细胞期添加0.10%中药肉苁蓉,囊胚发育率(13.81%)显著高于4细胞期(7.53%)(P<0.05),比卵裂之前添加肉苁蓉(13.67%)稍高,但差异不明显(P>0.05)。     

黄芪多糖和小檗碱复合制剂对鸡蛋品质的影响

试验初步探讨了不同剂量的黄芪多糖和小檗碱复合制剂对蛋鸡蛋品质的影响。处理Ⅰ~Ⅳ在基础日粮上分别添加100 mg/kg黄芪多糖+30 mg/kg小檗碱、200 mg/kg黄芪多糖+30 mg/kg小檗碱、100 mg/kg黄芪多糖+60 mg/kg小檗碱、200 mg/kg黄芪多糖+60 mg/kg小檗碱。结果表明,黄芪多糖(APS)和小檗碱(Ber)复合制剂对各处理组的蛋形指数、蛋黄指数、蛋黄比例、蛋壳厚度、蛋黄颜色和水分含量影响不显著(P>0.05);对处理组Ⅱ的哈夫单位影响极显著(P<0.01);极显著降低了处理组Ⅰ、Ⅱ、Ⅳ的粗脂肪含量(P<0.01),极显著提高了处理组Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ的粗蛋白含量(P<0.01),极显著降低了处理组Ⅰ、Ⅳ的胆固醇含量(P<0.01),显著降低了处理组Ⅲ的胆固醇含量(P<0.05)。     

植物源农药10％小檗碱对草莓白粉病的预防和治疗效果

[目的]探索新型小檗碱对草莓白粉病的预防和治疗作用及其田间施药剂量和方法。[方法]以50%醚菌酯水分散粒剂稀释3000倍为阳性对照,采用随机区组设计研究10%小檗碱(BBR)可湿性粉剂稀释800、1 200和1 600倍喷药3次,喷药间嘧隔7和12 d对红颜草莓白粉病的防治效果及对草莓的安全性。[结果]10%BBR对草莓白粉病具有较好的预防和治疗作用,且防效与醚菌酯无明显差别。对于发病严重的草莓白粉病,喷药间隔7 d,稀释800~1 200倍防效较佳,在相同试验条件下BBR的防效期较醚菌酯短。预防用药以施药间隔12 d、稀释1 200~1 600倍为宜。[结论]10%BBR可湿性粉剂对草莓安全、有效,可作为防治草莓白粉病的天然杀菌剂。     

LIF和IGF-1对牛胚胎干细胞分离的影响

比较了添加 L IF,IGF- 1和 L IF+IGF对牛胚胎干细胞 (ES)分离的影响。结果表明 :1添加10 ng/m L L IF能提高胚胎贴壁率 ,促进内细胞团 (ICM)和 ES细胞的增殖并抑制其分化 ;2添加 10 ng/m L IGF- 1既能提高胚胎贴壁率 ,又能使 ICM明显增殖的时间和传代后集落出现的时间提前 ;3添加 10 ng/m L L IF+10 ng/m L IGF- 1,可以同时发挥两种生长因子的作用效果 ,更有利于牛胚胎干细胞的分离。     

小檗碱复方对桃褐腐病的田间防效和安全性评价

[目的]探讨小檗碱复方对桃褐腐病的田间防治效果及安全性.[方法]根据杀菌剂作用机制选择β-微管蛋白抑制剂多菌灵、甾醇脱甲基化抑制剂腈苯唑和苯醌外部抑制剂(QoIs)嘧菌酯作为阳性对照,研究了10％小檗碱可湿性粉剂不同稀释倍数(5000、4 000、3 000、1 500、800倍)对桃褐腐病的防治效果及安全性.[结果]10％小檗碱可湿性粉剂4 000倍稀释液防治效果与对照药剂无显著差异,防治效果达70％以上;10％小檗碱可湿性粉剂剂量范围内对桃树安全.[结论]为小蘖碱在作物病害防治上的推广应用提供了参考.     

CTNNB1对猪卵巢颗粒细胞的调控

【目的】卵巢颗粒细胞的增殖和分化是原始卵泡生长启动的关键因素,卵巢颗粒细胞过度凋亡是卵泡闭锁的主要原因,因此卵巢颗粒细胞的功能对卵泡生长发育、排卵、激素分泌等至关重要。研究通过探究连环蛋白β1（catenin beta 1, CTNNB1）对猪卵泡发育过程中颗粒细胞的增殖、凋亡及类固醇激素分泌等功能的影响,为猪卵泡发育的分子调控机制研究提供参考。 【方法】利用RNA抽提、实时定量PCR（Quantitative real time PCR, qRT-PCR）等方法,构建CTNNB1在母猪卵巢、肌肉、大脑等9个组织的表达谱;检测母猪性成熟过程中卵巢组织和小（≤3 mm）、中（3—6 mm）、大（≥6 mm）卵泡颗粒细胞中CTNNB1的表达情况。构建CTNNB1的真核表达载体及合成siRNA,转染至猪卵巢颗粒细胞,采用EdU、Annexin V- FITC/PI双染、ELISA等方法,检测CTNNB1对颗粒细胞增殖、凋亡、类固醇激素分泌的影响,以及对类固醇激素合成通路重要基因转录表达的影响。【结果】与肌肉、大脑等组织相比,CTNNB1在卵巢中mRNA表达水平最高。性成熟母猪卵巢中CTNNB1转录水平显著高于性成熟前和性成熟后的母猪;卵巢卵泡中CTNNB1转录和蛋白水平随卵泡发育明显上调;且卵巢颗粒细胞中CTNNB1转录和蛋白水平也随卵泡的发育逐渐上调。更重要的是,CTNNB1显著促进颗粒细胞增殖,抑制颗粒细胞凋亡;CTNNB1能够上调CYP1A1和HSD17B7的转录水平,下调CYP11A1、ESR1、ESR2、FSHR、LHR和NR5A1等类固醇激素合成相关基因的转录水平,进而促进颗粒细胞雌激素的分泌,抑制颗粒细胞雄激素和孕激素的分泌。【结论】本研究证实CTNNB1可能通过促进颗粒细胞增殖及雌激素的合成和分泌,抑制颗粒细胞凋亡及雄激素、孕激素的合成和分泌,进而促进卵泡的生长发育。     

猪α1岩藻糖转移酶基因点突变的PCR-SSCP检测

猪α1岩藻糖转移酶基因(FUT 1)位于猪第6号染色体上,是猪肠毒素大肠杆菌F 18受体(ETEC F 18R)理想的候选基因。采用PCR-SSCP法共检测外来猪种、国内地方猪种和培育猪种3个类型9个猪种共计255个个体FUT 1基因M 857位点的多态性,所检测的3个外来猪种均存在GG和AG两种基因型,而国内地方猪种中除临高猪外均表现为极端的单态分布,只存在GG基因型。采用PCR-SSCP方法对FUT 1基因点突变进行检测,具有试验成本低、操作简便和灵敏度高等优点,可望在育种实践中得到更广泛的应用。