重组人磷脂酰肌醇3-激酶p110β催化亚基的原核表达

目的：表达人磷脂酰肌醇3－激酶p110β催化亚基。方法：将构建有人磷脂酰肌醇3－激酶（phosphatidylinositol 3-kinase,PI3-K)p110β催化亚基cDNA的重组质粒，转化大肠杆菌BL21（DE3），用IPTG进行诱导表达。用磷脂酰肌醇－4、5－二磷酸、[γ-^32P]ATP与重组PI 3－K p110β催化亚基一起保温的方法测定PI 3－K的活性；^32P标记的磷脂用氯仿和甲醇抽提、板薄层层析和放射自显影来分析。结果：SDS－PAGE显示表达出－110kD的新蛋白质分子，重组蛋白占菌体总蛋白的比例为15％，大多数重组蛋白以可溶性形成存在。wortmannin是PI3－K特异的抑制剂，wortmannin对重组PI 3－K p110β亚基有抑制作用，这种抑制作用呈剂量依赖关系（2.5-20nmol/L)。结论：重组蛋白是有活性的人PI3－Kp110β催化亚基。     

杨梅素、槲皮素和山萘黄素对重组人PI3K p110β催化亚基活性的影响

目的:研究杨梅素、槲皮素和山萘黄素对重组人肌醇磷脂3-激酶(P I3K)p110β催化亚基的直接作用。方法:通过基因工程技术的方法获得P I3K p110β催化亚基。用P tdIns(4,5)P2,[γ3-2P]ATP与重组P I3K p110β催化亚基一起保温的方法测定P I3K的活性;32P标记的磷脂用氯仿和甲醇抽提,加闪烁液于液闪计数仪计数。结果:杨梅素和槲皮素对重组人P I3K p110β催化亚基有抑制作用,IC50分别为2.93μm o l/L和9.91μm o l/L,而山萘黄素对P I3K p110β催化亚基则无抑制作用。结论:杨梅素和槲皮素是P I3K的抑制剂,杨梅素和槲皮素对P I3K p110β催化亚基的抑制作用与浓度成正比关系。     

槲皮素对重组人肌醇磷脂3-激酶p110β催化亚基的影响

肌醇磷脂3-激酶(phosphoinositide 3-kinase,PI3-K)是多磷脂酰肌醇通路中的一个重要的效应器和涉及信号转导和细胞转化的关键酶。PtdIns(3)P、PtdIns(3,4)P2和PtdIns(3,4,5)P。是PI3-K的酶促反应产物,它们在细胞内起到第二信使的作用,调节一些蛋白激酶的活性如PAC、PKB和有些PKC同工酶等,PI3-K通过这些信号传导途径参与多种生物学事件,如囊泡运输、     

Tyrphostin AG555对重组人磷脂酰肌醇3-激酶pll0 β催化亚基的影响

磷脂酰肌醇 3 -激酶 (P13 - K)是多磷脂酰肌醇通路中一个重要的效应器和涉及信号转导、细胞转化的关键酶。P13 - K根据结构的相似性和底物的特殊性可分为 3种类型 ,其中第一种类型的 P13 - K是由 85 k D(p85 α和 p85 β)调节亚基和 110 k D(p110 α、p110 β和 p110 δ)催化亚     

磷脂酰肌醇特异性磷脂酶C基因在乳酸乳球菌中的异源表达

根据乳酸乳球菌密码子的偏好性,在不改变编码蛋白的基础上,优化设计并合成枯草芽孢杆菌磷脂酰肌醇特异性磷脂酶C基因,将其与大肠埃希菌 乳酸乳球菌穿梭质粒pAMJ399连接,构建重组质粒pAMJ399 PIPLC,并电转化至乳酸乳球菌中进行诱导表达。SDS PAGE分析显示：重组蛋白以可溶性蛋白的形式分泌于胞外,分子质量约35 ku,与预期蛋白大小一致。重组蛋白在PI 李斯特氏菌显色平板上显现明显的乳白色晕圈,证明重组蛋白具有酶活性,磷脂酰肌醇特异性磷脂酶C（PI PLC）在重组乳酸乳球菌中成功获得表达。通过优化培养条件,以2%转接量,在含有1%红霉素抗性的GM17液体培养基中,于32 ℃静止培养24 h,测得培养基上清液中PI PLC的浓度为1.092 μg·mL-1。     

磷脂酰肌醇3-磷酸对UV-B诱导蚕豆保卫细胞中过氧化氢产生和气孔关闭的影响

【目的】研究磷脂酰肌醇3-激酶（PI3K）催化产物磷脂酰肌醇3-磷酸（PI3P）对紫外线B（UV-B）诱导保卫细胞中过氧化氢（H2O2）产生和气孔关闭的影响,为进一步阐明植物细胞转导UV-B辐射信号的机制提供依据。【方法】以蚕豆（Vicia faba L.）表皮条为材料,采用PI3K的抑制剂沃曼青霉素（WM）和LY294002（LY）来抑制PI3P的形成,采用二苯基碘（DPI）和水杨基氧肟酸（SHAM）分别抑制H2O2形成的NADPH氧化酶途径和细胞壁过氧化物酶途径,通过气孔开度分析和激光扫描共聚焦显微镜技术,确定PI3P在0.8 W•m-2 UV-B辐射诱导蚕豆保卫细胞H2O2产生和气孔关闭中的作用。【结果】WM和LY能显著抑制UV-B诱导的保卫细胞H2O2产生和气孔关闭;外源H2O2处理能显著逆转WM和LY对UV-B诱导气孔关闭的抑制效应,但WM和LY不能抑制外源H2O2诱导的气孔关闭;UV-B诱导的保卫细胞H2O2产生和气孔关闭能被活性氧清除剂和SHAM显著抑制,但不能被DPI抑制。【结论】PI3P通过诱导蚕豆保卫细胞中产生于过氧化物酶途径的H2O2形成来介导UV-B辐射诱导的气孔关闭。     

大豆黄酮对重组人蛋白激酶CK2全酶的抑制作用及其动力学分析

目的：体外观察大豆黄酮对重组人蛋白激酶CK2的抑制效果及酶动力学分析以确定其抑制作用类型。方法：利用基因工程技术进行克隆、表达和纯化．获得重组人CK2的α^ 及β亚基在体外等摩尔混合构成CK2全酶．并测定大豆黄酮对酶的抑制作用及采用IC50结果的回归方程分析其动力学。结果：大豆黄酮能显著抑制重组人蛋白激酶CK2的活性(IS50=2．38μmol／L),抑制作用明显强于已知的CK2抑制剂5,6-二氯-1-β-D-呋哺核糖苯并咪唑(DRB)和N-(2-氨乙基)-5-氯萘-1-硫胺(A3)。酶动力学分析表明,大豆黄酮与ATP(Ki=3．02μmol／L)及酪蛋白(Ki=2．22μmol／L)均呈混合型抑制CK2的活性。结论：大豆黄酮是一种较强的体外蛋白激酶CK2的抑制剂。     

Wortmannin对凝血酶诱导的人血小板聚集和3┐磷酸化肌醇磷脂累积的影响

Ｗｏｒｔｍａｎｎｉｎ是能引起动物出血的真菌代谢产物,它是肌醇磷脂－３－激酶的不可逆抑制剂。Ｗｏｒｔｍａｎｎｉｎ对血小板的多种抑制作用已被广泛研究。用比浊法分析血小板聚集;用［γ－３２Ｐ］标记磷酸化肌醇磷脂;用氯仿和甲醇抽提磷酸化肌醇磷脂;用ＴＬＣ和放...     

EGF对人鼻咽癌细胞体外生长和膜蛋白磷酸化与肌醇磷脂磷酸化的影响

本文观察了表皮生长因子（ＥＧＦ）与人低分化鼻咽癌上皮细胞系 　ＣＮＥ－２ Ｚ在软琼脂培养基上集落形成能力及膜蛋白、膜肌醇磷脂磷酸化的关系。 结果表明：（１）ＥＧＦ经受体介导，低浓度时（０．０１～０．１７ｎｍｏｌ／Ｌ）促进细胞生 长，高浓度时（≥１．６７ｎｍｏｌ／Ｌ）抑制细胞生长；（２） ＥＧＦ促进膜蛋白磷酸化反 应；（３） ＥＧＦ促进膜肌醇磷脂转换。提示了ＥＧＦ对ＣＮＥ－ ２ Ｚ细胞体外生长的影 响与其促进膜蛋白磷酸化和膜肌醇磷脂转换有关。本文根据实验结果探讨了ＥＧＦ 与人鼻咽癌的关系。     

肝素等药物对猪红细胞膜上磷脂酰肌醇磷酸化的影响

在Mg~(2+)存在下,用(γ-~(32)P)ATP与猪红细胞膜保温(30℃)3min,观察一些药物对猪红细胞膜上磷脂酰肌醇磷酸化的影响。用氯仿:甲醇中止反应。用酸性氯仿:甲醇混合液抽提磷脂及硅胶板TLC分离磷脂。经放射自显影及液体闪烁计数测定生成的(~(32)P)-磷脂酰肌醇-4-磷酸。结果表明①肝素和新霉素对磷脂酰肌醇磷酸化有抑制作用;②六氯环己烷对磷脂酰肌醇磷酸化有促进作用;③Li_2SO_4(10mmol/L)、EGTA(100μmol/L)、茶硷(100μmol/L)作用不明显;④二甲亚矾在低浓度时有促进作用,而在较高浓度时则有抑制作用。结果提示上述作用可能与这些药物的作用机理有关。     

精胺对猪血小板膜中肌醇磷脂和蛋白质磷酸化的影响

用猪血小板膜与(r-~(32)P)ATP进行磷酸化反应,观察精胺对肌醇磷脂和蛋白质磷酸化的影响.结果表明:(1)对磷脂酰肌醇-4,5-二磷酸的生成有明显促进作用;(2)对血小板中47KDa蛋白质磷酸化有强烈抑制作用(IC_(50)≈1.0mmol/L)。精胺的这些作用可能与其生理作用机理有关。     

广东医学院学报2003年第21卷第1～6期 总分类目次

基础研究L ipofectin介导 bcl- x L 反义寡核苷酸对鼻咽癌 CNE- 2 Z细胞的影响何桂蓉 ,周克元 ,张月飞 ,等 (1)…………………………………第 2～ 6肋间神经前皮支及其营养血管的解剖学研究梁大宁 ,罗少军 ,汤少明 ,等 (5 )…………………………………………………基于第三类极限数学理论的 Goldbach猜想和 Fermat猜想的同时证明李英杰 (7)……………………………………………………蝙蝠葛碱和胡椒碱对两株鼻咽癌细胞增殖的影响丁　航 ,唐旭东 ,周克元 (16 )…………………………………………………………重组人磷脂酰肌醇 3-激酶 p110 …     

腺苷对大鼠心肌原蛋白I及磷脂酰肌醇磷酸化的抑制作用

用差速离心及等密度离心法从大白鼠心肌细胞中分离收缩蛋白质及质膜,分别与[γ-~(32)P]ATP 保温,观察细胞成分的磷酸化,以及腺苷或腺苷类似物对磷酸化的影响.结果表明,在收缩蛋白质组分,~(32)P 主要掺入肌原蛋白Ⅰ(TroponinⅠ,29000Da);在质膜组分、~(32)P主要掺入磷脂酰肌醇-4-—磷酸(PtdIns-4-P);也就是 ATP 使磷脂酰肌醇(PtdIns)磷酸化。腺苷对此两种磷酸化都有抑制作用,尤以对PtdIns 的磷酸化抑制作用最强。cAMP 对肌原蛋白Ⅰ的磷酸化有刺激作用,这与文献报道相符.作者认为腺苷和 cAMP 对肌原蛋白Ⅰ磷酸化的拮抗作用,与腺苷和肾上腺素对心肌调节的拮抗作用有明显的相关性。鉴于近年发现肌醇磷脂转换在调节细胞活动中起有重要作用,腺苷对磷脂酰肌醇磷酸化的抑制作用,可能具有重要的生物学意义。     

腺苷对大鼠心肌钙蛋白 I 及磷脂酰肌醇磷酸化的抑制作用

用差速离心及等密度梯度离心法从大白鼠心肌细胞分离收缩蛋白质及质膜,分别与[γ—~(32)P]ATP 保温以观察细胞成分的磷酸化,以及腺苷和腺苷类似物对磷酸化的影响。结果表明,在收缩蛋白质组分,~(32)P 主要参入肌钙蛋白 I(Troponin1,29000Da);在质膜组分,~(32)P 主要参入磷脂酰肌醇-4-一磷酸(Ptd Ins4P),亦即 TAP 使磷脂酰肌醇(PtdIns)磷酸化。腺苷对此两种磷酸化都有抑制作用,尤以对 Ptd Ins 磷酸化的抑制最强烈。cAMP 对肌钙蛋白 I 的磷酸化有剌激作用,这与文献报道相符。作者认为,腺苷和 cAMP 对肌钙蛋白 I 磷酸化的拮抗作用与腺苷和肾上腺素对心肌调节的拮抗作用有明显的相关性。鉴于近年发现,肌醇磷脂转换在调节细胞活动中起重要作用,腺苷对磷脂酰肌醇磷酸化的抑制作用可能有重要的生物学意义。     

β－胡萝卜素对奶牛繁殖性能及产后疾病的影响研究

试验研究了宁夏地区奶牛日粮每天补充β－胡萝卜紊300mg,对奶牛产前和产后血清β－胡萝卜素浓度变化、产后发病率、产后配种率和受胎率的影响。结果表明：添加300mg β－胡萝卜紊能显著提高奶牛产后10天、产后60天的血清β－胡萝卜素浓度（p〈0．05）,加州乳房炎测定法（CMT）测定乳区阳性率减少10．15个百分点,产后胎衣不下、隐性乳腺炎和临床乳腺炎的发病率均减少12个百分点。产后70天内的发情率68％,显著高于对照组52％（p〈0．05）,产后70天内的受胎率32％,显著高于对照组28％（p〈0．05）;但对一次配种受胎率（47．1％,46．1％）和110天受胎率（96％,92％）差异不显著（p〉0．05）。     

山楂生物膜磷脂组成的研究

本文用硅胶薄板进行单向层析,从山楂的不同组织和细胞器中分离出了7种膜磷脂:磷脂酰胆碱(PC)、磷脂酰肌醇(PI)、磷脂酰已醇胺(PE)、磷脂酰甘油(PG)、磷脂酰丝氨酸(PS)磷脂酸(PA)和溶血磷脂酰胆碱(LPL).除定性分析外,对山楂不同组织和器官中膜磷脂的含量进行了测定比较。     

真核表达质粒pIRES-ST3GAL Ⅰ的构建及其在大肠杆菌中的初步表达

构建β半乳糖苷α-2,3-唾液酸转移酶I(ST3GALI)基因的真核表达载体p IRES-ST3GALI,并诱导使其在大肠杆菌中高效表达。以p GEM-ST3GALI质粒为模板,采用PCR技术特异性扩增ST3GAL I基因,通过酶切和连接,构建真核表达载体p IRESST3GALI。经PCR、双酶切和测序鉴定正确后,转化筛选阳性重组大肠杆菌(DH5α),用不同浓度的异丙基硫代半乳糖苷(IPTG)诱导表达目的蛋白,并用12%SDS-PAGE鉴定。结果表明,重组质粒p IRES-ST3GAL I中的ST3GAL I序列与原鸡的ST3GAL I氨基酸序列同源性98.8%,与猪的同源性达53.5%,与人的同源性达52.6%。β半乳糖苷α-2,3-唾液酸转移酶I在大肠杆菌中实现了良好的表达。本试验已成功构建了含有β半乳糖苷α-2,3-唾液酸转移酶I(ST3GAL I)的真核表达载体p IRES-ST3GAL I,为其转染传代细胞建立重组传代细胞系奠定了基础。     

新城疫病毒xx08毒株血凝素-神经氨酸酶基因主要抗原区原核表达及鉴定

利用基因工程技术构建新城疫病毒HN基因抗原表位集中区HNI175-K367基因片段(523-1101位)的重组表达质粒pET32-HNI175-K367。将该质粒转化大肠杆菌BL21(ED3),经IPTG诱导,SDS-PAGE鉴定表明,HNI175-K367蛋白得到高效表达,其分子量约为38kD。Western-blot分析证实,HNI175-K367蛋白与鸡新城疫病毒高免血清发生特异性反应,表明利用原核表达系统获得的重组蛋白具有良好的反应原性。     

卵巢颗粒细胞自噬与PI3K/AKT/FOXO3a信号通路的相关性

细胞自噬是哺乳动物细胞物质代谢的一个重要机制,与细胞凋亡共同参与卵巢卵泡的发育和闭锁,并发挥重要的作用。近年研究发现,磷脂酰肌醇3-激酶/蛋白激酶B（phosphatidylinositol 3-kinase/protein kinase B,PI3K/AKT）信号通路参与卵巢疾病的发生。PI3K和AKT的过度激活可使原始卵泡过早发育以及卵泡过快凋亡,卵巢颗粒细胞作为卵泡发育重要的支持细胞,其功能的减退或凋亡很可能引发一系列女性内分泌方面的疾病。FOXO3a转录因子是PI3K/AKT信号通路下游的重要靶蛋白之一,参与抗增殖和凋亡。本文就关于卵巢颗粒细胞自噬与PI3K/AKT/FOXO3a信号通路的相关进展加以综述。     

LPS对猪中性粒细胞Mac-1表达的影响及相关信号机制

【目的】研究致炎因子LPS对猪中性粒细胞表达巨噬细胞表面分子抗原(Mac)-1的诱导作用及有关的信号机制,为LPS致炎机制及抗炎药物机理研究提供依据。【方法】采用密度梯度离心法分离猪中性粒细胞,以流式细胞术检测Mac-1表达,以实时荧光定量PCR检测p38丝裂原活化蛋白激酶(p38 MAPK)、磷脂酰肌醇-3-激酶(PI3K)、Janus激酶(JAK)、p65核转录因子(p65 NF-κB)mRNA相对表达量。【结果】1、10、100、1 000 ng/mL的LPS对猪中性粒细胞Mac-1表达表现出增加趋势,其中100、1 000 ng/mL的LPS明显促进Mac-1表达,差异极显著(P<0.01)。1、10、100、1 000 ng/mL的LPS可呈剂量依赖性促进猪中性粒细胞JAK mRNA表达(P<0.01);100 ng/mL LPS可显著促进p38 MAPK mRNA表达(P<0.05);10 ng/mL LPS可分别显著促进PI3K、p65 NF-κB mRNA表达(P<0.05)。【结论】LPS呈剂量依赖性诱导猪中性粒细胞Mac-1表达,其信号机制与...