重组人磷脂酰肌醇3-激酶p110β催化亚基的原核表达

目的：表达人磷脂酰肌醇3－激酶p110β催化亚基。方法：将构建有人磷脂酰肌醇3－激酶（phosphatidylinositol 3-kinase,PI3-K)p110β催化亚基cDNA的重组质粒，转化大肠杆菌BL21（DE3），用IPTG进行诱导表达。用磷脂酰肌醇－4、5－二磷酸、[γ-^32P]ATP与重组PI 3－K p110β催化亚基一起保温的方法测定PI 3－K的活性；^32P标记的磷脂用氯仿和甲醇抽提、板薄层层析和放射自显影来分析。结果：SDS－PAGE显示表达出－110kD的新蛋白质分子，重组蛋白占菌体总蛋白的比例为15％，大多数重组蛋白以可溶性形成存在。wortmannin是PI3－K特异的抑制剂，wortmannin对重组PI 3－K p110β亚基有抑制作用，这种抑制作用呈剂量依赖关系（2.5-20nmol/L)。结论：重组蛋白是有活性的人PI3－Kp110β催化亚基。     

槲皮素对重组人肌醇磷脂3-激酶p110β催化亚基的影响

肌醇磷脂3-激酶(phosphoinositide 3-kinase,PI3-K)是多磷脂酰肌醇通路中的一个重要的效应器和涉及信号转导和细胞转化的关键酶。PtdIns(3)P、PtdIns(3,4)P2和PtdIns(3,4,5)P。是PI3-K的酶促反应产物,它们在细胞内起到第二信使的作用,调节一些蛋白激酶的活性如PAC、PKB和有些PKC同工酶等,PI3-K通过这些信号传导途径参与多种生物学事件,如囊泡运输、     

杨梅素、槲皮素和山萘黄素对重组人PI3K p110β催化亚基活性的影响

目的:研究杨梅素、槲皮素和山萘黄素对重组人肌醇磷脂3-激酶(P I3K)p110β催化亚基的直接作用。方法:通过基因工程技术的方法获得P I3K p110β催化亚基。用P tdIns(4,5)P2,[γ3-2P]ATP与重组P I3K p110β催化亚基一起保温的方法测定P I3K的活性;32P标记的磷脂用氯仿和甲醇抽提,加闪烁液于液闪计数仪计数。结果:杨梅素和槲皮素对重组人P I3K p110β催化亚基有抑制作用,IC50分别为2.93μm o l/L和9.91μm o l/L,而山萘黄素对P I3K p110β催化亚基则无抑制作用。结论:杨梅素和槲皮素是P I3K的抑制剂,杨梅素和槲皮素对P I3K p110β催化亚基的抑制作用与浓度成正比关系。     

人工半合成槲皮素水溶性衍生物对重组人磷脂酰肌醇3-激酶p110 β催化亚基的影响

黄酮类化合物是广泛存在于植物界的多酚类化合物 ,具有多种药理学作用 ,如抑制肿瘤细胞生长、抗血小板聚集等。近来的研究表明 ,黄酮类化合物是几种与细胞内信号转导、细胞转化有关激酶的抑制剂。黄酮类化合物具有的多种生物学作用 ,是由于它们抑制了这些关键酶从而能够选择性地阻断细胞内信号转导通路。因此 ,黄酮类化合物被认为是治疗肿瘤的潜在化合物。但是 ,多数黄酮类化合物不溶于水 ,这极大地限制了其生物利用度和给药途径。理论上 ,在力求保持黄酮类化合物活性结构的情况下 ,将其改造成水溶性衍生物可望开发出一种抗肿瘤或抗血小板聚…     

Tyrphostin AG555对重组人磷脂酰肌醇3-激酶pll0 β催化亚基的影响

磷脂酰肌醇 3 -激酶 (P13 - K)是多磷脂酰肌醇通路中一个重要的效应器和涉及信号转导、细胞转化的关键酶。P13 - K根据结构的相似性和底物的特殊性可分为 3种类型 ,其中第一种类型的 P13 - K是由 85 k D(p85 α和 p85 β)调节亚基和 110 k D(p110 α、p110 β和 p110 δ)催化亚     

肝素等药物对猪红细胞膜上磷脂酰肌醇磷酸化的影响

在Mg~(2+)存在下,用(γ-~(32)P)ATP与猪红细胞膜保温(30℃)3min,观察一些药物对猪红细胞膜上磷脂酰肌醇磷酸化的影响。用氯仿:甲醇中止反应。用酸性氯仿:甲醇混合液抽提磷脂及硅胶板TLC分离磷脂。经放射自显影及液体闪烁计数测定生成的(~(32)P)-磷脂酰肌醇-4-磷酸。结果表明①肝素和新霉素对磷脂酰肌醇磷酸化有抑制作用;②六氯环己烷对磷脂酰肌醇磷酸化有促进作用;③Li_2SO_4(10mmol/L)、EGTA(100μmol/L)、茶硷(100μmol/L)作用不明显;④二甲亚矾在低浓度时有促进作用,而在较高浓度时则有抑制作用。结果提示上述作用可能与这些药物的作用机理有关。     

磷脂酰肌醇3-磷酸对UV-B诱导蚕豆保卫细胞中过氧化氢产生和气孔关闭的影响

【目的】研究磷脂酰肌醇3-激酶（PI3K）催化产物磷脂酰肌醇3-磷酸（PI3P）对紫外线B（UV-B）诱导保卫细胞中过氧化氢（H2O2）产生和气孔关闭的影响,为进一步阐明植物细胞转导UV-B辐射信号的机制提供依据。【方法】以蚕豆（Vicia faba L.）表皮条为材料,采用PI3K的抑制剂沃曼青霉素（WM）和LY294002（LY）来抑制PI3P的形成,采用二苯基碘（DPI）和水杨基氧肟酸（SHAM）分别抑制H2O2形成的NADPH氧化酶途径和细胞壁过氧化物酶途径,通过气孔开度分析和激光扫描共聚焦显微镜技术,确定PI3P在0.8 W•m-2 UV-B辐射诱导蚕豆保卫细胞H2O2产生和气孔关闭中的作用。【结果】WM和LY能显著抑制UV-B诱导的保卫细胞H2O2产生和气孔关闭;外源H2O2处理能显著逆转WM和LY对UV-B诱导气孔关闭的抑制效应,但WM和LY不能抑制外源H2O2诱导的气孔关闭;UV-B诱导的保卫细胞H2O2产生和气孔关闭能被活性氧清除剂和SHAM显著抑制,但不能被DPI抑制。【结论】PI3P通过诱导蚕豆保卫细胞中产生于过氧化物酶途径的H2O2形成来介导UV-B辐射诱导的气孔关闭。     

Wortmannin对凝血酶诱导的人血小板聚集和3┐磷酸化肌醇磷脂累积的影响

Ｗｏｒｔｍａｎｎｉｎ是能引起动物出血的真菌代谢产物,它是肌醇磷脂－３－激酶的不可逆抑制剂。Ｗｏｒｔｍａｎｎｉｎ对血小板的多种抑制作用已被广泛研究。用比浊法分析血小板聚集;用［γ－３２Ｐ］标记磷酸化肌醇磷脂;用氯仿和甲醇抽提磷酸化肌醇磷脂;用ＴＬＣ和放...     

健脾补土组方对体外神经元低氧/复氧后PI3K、Akt、Caspase-3表达的影响

目的 观察健脾补土组方对新生SD鼠神经元体外培养低氧/复氧后的凋亡情况以及PI3K、Akt、Caspase-3表达的影响,探讨其减少神经元凋亡的作用机制。方法 原代分离培养新生SD鼠神经元,随机分为正常血清对照组、低氧模型组、神经生长因子组、健脾补土组。将标本低氧诱导24 h,再复氧培养4 h进行造模。用流式细胞术检测神经元凋亡情况,RT-qPCR法检测PI3K、Akt、caspase-3 mRNA的表达,免疫细胞化学法和Western blot法检测PI3K、Akt、caspase-3蛋白的表达。结果 与正常对照组相比,低氧模型组神经元凋亡率显著增加,PI3K、Akt mRNA与蛋白表达显著减少,Caspase-3 mRNA与蛋白表达显著增加;与低氧模型组比较,神经生长因子组、健脾补土组神经元凋亡率均显著减少,PI3K、Akt mRNA及蛋白表达显著增强,Caspase-3 mRNA及蛋白表达显著较少（P<0.01）;与神经生长因子组比较,健脾补土组神经元凋亡率显著减少,PI3K、Akt mRNA及蛋白表达显著增加,Caspase-3 mRNA及蛋白表达显著降低。结论 健脾补土组方能减少脑缺血后神经元的凋亡,其作用机制可能与其通过上调PI3K和Akt的表达水平,最终抑制在细胞凋亡中起关键作用的因子Caspase-3的表达有关。     

小麦胚乳14-3-3基因的克隆及其重组蛋白的原核表达

【目的】克隆小麦籽粒胚乳14-3-3基因,并进行体外表达,为进一步研究其对籽粒生长发育的调控作用奠定基础。【方法】根据已有同源基因保守序列,设计插入限制性酶切位点的特异性扩增引物,采用RT-PCR方法扩增发育的小麦胚乳14-3-3基因,克隆测序后转入表达载体,在大肠杆菌中进行表达,并进行纯化。【结果】从开花后灌浆13-15 d的小麦品种济麦22籽粒胚乳中克隆到1个14-3-3基因,序列分析表明为非ε型,含1个777 bp的开放阅读框,编码蛋白259 aa,分子量约29 kD。核苷酸序列分析表明与小麦、水稻、玉米、大麦、大豆等主要农作物和模式植物拟南芥的14-3-3基因有较高的同源性,最高达98%,编码蛋白氨基酸长度也一致（260 aa左右）;在大肠杆菌中高效表达的重组蛋白约为30 kD,分子量大小与根据核苷酸序列推导的编码蛋白一致。从基因序列的同源性、编码蛋白的氨基酸长度、表达蛋白的分子量大小分析都说明克隆到的基因为14-3-3基因,并准确插入表达载体,得到了高效正确表达。将克隆的基因插入pET29c载体,热激转化大肠杆菌BL21-CodonPlus(DE3)-RP,得到了高效表达,但主要以包涵体形式（80%）存在。对重组蛋白进行了纯化,可溶性重组蛋白利用S-蛋白琼脂糖树脂得到纯化的蛋白,包涵体重组蛋白经变性溶解、复性后,也利用S-蛋白琼脂糖树脂得到了高度纯化的重组蛋白。【结论】利用RT-PCR技术从发育的小麦胚乳中克隆到1个14-3-3基因,并在大肠杆菌中得到了高效表达,重组蛋白经过纯化得到了纯度较高的活性蛋白。     

EGF对人鼻咽癌细胞体外生长和膜蛋白磷酸化与肌醇磷脂磷酸化的影响

本文观察了表皮生长因子（ＥＧＦ）与人低分化鼻咽癌上皮细胞系 　ＣＮＥ－２ Ｚ在软琼脂培养基上集落形成能力及膜蛋白、膜肌醇磷脂磷酸化的关系。 结果表明：（１）ＥＧＦ经受体介导，低浓度时（０．０１～０．１７ｎｍｏｌ／Ｌ）促进细胞生 长，高浓度时（≥１．６７ｎｍｏｌ／Ｌ）抑制细胞生长；（２） ＥＧＦ促进膜蛋白磷酸化反 应；（３） ＥＧＦ促进膜肌醇磷脂转换。提示了ＥＧＦ对ＣＮＥ－ ２ Ｚ细胞体外生长的影 响与其促进膜蛋白磷酸化和膜肌醇磷脂转换有关。本文根据实验结果探讨了ＥＧＦ 与人鼻咽癌的关系。     

重组小鼠14-3-3蛋白theta亚型的构建

目的克隆编码14—3—3蛋白质θ亚型的cDNA，制备该蛋白质的基因重组蛋白质．方法参照小鼠14—3-3蛋白质θ亚型mRNA结构设计引物，以小鼠脑总RNA为模板，RT—PCR法克隆编码14—3—3蛋白质θ亚型的cDNA，插入原核表达质粒pGEX-4T-1，转化大肠杆菌BL21（DE3）使其表达谷胱甘肽S转移酶（GST）为标签的融合蛋白质，以凝血酶定点分解融合蛋白并采用GlutathioneSepharose4B亲和层析纯化目的蛋白．结果RT—PCR扩增产物经1％琼脂糖凝胶电泳分离可见约800bp条带，序列分析表明重组质粒pGEX-1433theta中的插入子为738bp，编码245个氨基酸，其核苷酸及氨基酸序列与PubmedNM-011739展示的结果一致．重组质粒pGEX-1433theta在BL21（DE3）中的表达量随IPTG诱导时间递增，融合蛋白质为可溶性组分．亲和层析纯化的14—3—3theta在SDS．PAGE上表现为单一条带，表观相对分子质量为30ku．每L培养菌液可收获4mg基因重组型小鼠14—3—3theta．结论克隆了编码小鼠14—3-3蛋白质θ亚型的cDNA，制备了高纯度基因重组型小鼠14—3—3theta，为进行单克隆抗体的制备奠定了坚实的基础．     

腺苷对大鼠心肌原蛋白I及磷脂酰肌醇磷酸化的抑制作用

用差速离心及等密度离心法从大白鼠心肌细胞中分离收缩蛋白质及质膜,分别与[γ-~(32)P]ATP 保温,观察细胞成分的磷酸化,以及腺苷或腺苷类似物对磷酸化的影响.结果表明,在收缩蛋白质组分,~(32)P 主要掺入肌原蛋白Ⅰ(TroponinⅠ,29000Da);在质膜组分、~(32)P主要掺入磷脂酰肌醇-4-—磷酸(PtdIns-4-P);也就是 ATP 使磷脂酰肌醇(PtdIns)磷酸化。腺苷对此两种磷酸化都有抑制作用,尤以对PtdIns 的磷酸化抑制作用最强。cAMP 对肌原蛋白Ⅰ的磷酸化有刺激作用,这与文献报道相符.作者认为腺苷和 cAMP 对肌原蛋白Ⅰ磷酸化的拮抗作用,与腺苷和肾上腺素对心肌调节的拮抗作用有明显的相关性。鉴于近年发现肌醇磷脂转换在调节细胞活动中起有重要作用,腺苷对磷脂酰肌醇磷酸化的抑制作用,可能具有重要的生物学意义。     

LPS对猪中性粒细胞Mac-1表达的影响及相关信号机制

【目的】研究致炎因子LPS对猪中性粒细胞表达巨噬细胞表面分子抗原(Mac)-1的诱导作用及有关的信号机制,为LPS致炎机制及抗炎药物机理研究提供依据。【方法】采用密度梯度离心法分离猪中性粒细胞,以流式细胞术检测Mac-1表达,以实时荧光定量PCR检测p38丝裂原活化蛋白激酶(p38 MAPK)、磷脂酰肌醇-3-激酶(PI3K)、Janus激酶(JAK)、p65核转录因子(p65 NF-κB)mRNA相对表达量。【结果】1、10、100、1 000 ng/mL的LPS对猪中性粒细胞Mac-1表达表现出增加趋势,其中100、1 000 ng/mL的LPS明显促进Mac-1表达,差异极显著(P<0.01)。1、10、100、1 000 ng/mL的LPS可呈剂量依赖性促进猪中性粒细胞JAK mRNA表达(P<0.01);100 ng/mL LPS可显著促进p38 MAPK mRNA表达(P<0.05);10 ng/mL LPS可分别显著促进PI3K、p65 NF-κB mRNA表达(P<0.05)。【结论】LPS呈剂量依赖性诱导猪中性粒细胞Mac-1表达,其信号机制与...     

钙对苹果果实过氧化物酶、β-1,3-葡聚糖合成酶和β-1,3-葡聚糖分解酶活性的影响

 采用贮藏实验与果实薄片培养实验相结合的方法,研究了钙素对苹果果实β-1,3-葡聚糖合成酶、β-1,3-葡聚糖分解酶和过氧化物酶(POD)的活性及对丙二醛(MDA)含量的影响。结果表明,与对照比较,幼果期喷钙显著降低了苹果苦痘病发病率, POD和β-1,3-葡聚糖合成酶的活性增加,β-1,3-葡聚糖分解酶活性和MDA含量降低;果实薄片培养中,与低钙处理比较,高钙处理POD和β-1,3-葡聚糖合成酶的活性增加,β-1,3-葡聚糖分解酶活性和MDA含量下降。说明苹果果实生理变化与钙素营养关系密切,果实钙营养不足导     

重组GSTA3蛋白对福美双诱导的TD肉鸡生长性能的影响

胫骨软骨发育不良(TD)是在快速生长的肉鸡中常发的一种骨骼性疾病,给禽类养殖带来了严重的经济损失。试验在基础日粮中添加福美双,诱导产生TD肉鸡,然后分4次注射谷胱甘肽硫转移酶A3蛋白(GSTA3),探究谷胱甘肽硫转移酶A3蛋白(GSTA3)对于TD肉鸡生长性能的影响。结果表明,注射了GSTA3蛋白的TD肉鸡精神恢复快,增质量恢复快。试验结果证明重组外源GSTA3蛋白对TD肉鸡有促生长作用,可为TD肉鸡生长性能的恢复奠定理论基础。     

14-3-3蛋程中的互作靶蛋白鉴定及其对外源激素的响应

【目的】籽粒灌浆对水稻产量及品质的形成至关重要。14-3-3蛋白是一种信号转导调节因子,在植物生长发育中发挥着重要调控作用。本研究通过分析14-3-3蛋白家族在籽粒灌浆过程中的基因表达模式及其互作靶蛋白,从而揭示其在籽粒灌浆过程中的功能。【方法】利用实时荧光定量PCR（qRT-PCR）技术分析水稻14-3-3基因家族在籽粒灌浆过程中的表达变化模式,并从中选取GF14b及GF14e进行后续的蛋白功能分析。利用KEGG数据库对GF14b及GF14e蛋白功能motif位点进行分析;构建GST-GF14b及GST-GF14e表达载体,利用亲和层析技术分别钓取籽粒中与GF14b及GF14e互作的靶蛋白,并借助LC-MS/MS对靶蛋白进行鉴定。采用GST pull-down方法验证靶蛋白与GF14b及GF14e间的蛋白互作关系。利用Kinasephos在线程序对靶蛋白的Ser和Thr磷酸化位点进行预测;采用MapMan 3.6.0软件对靶蛋白的功能及参与的代谢过程进行分析。在籽粒灌浆期（花后15 d）,分别喷施25×10^-6mol·L^-1 ABA,10×10^-6mol·L^-1 IAA,100×10^-6mol·L^-1 GA,50×10^-6mol·L^-1 ZR和 2×10^-4mol·L^-1 BR,研究外源激素处理对籽粒灌浆过程中GF14b,GF14e及其互作靶基因表达的影响。【结果】14-3-3家族基因中,除GF14h外,其余7个家族成员在水稻籽粒中均有表达,其中GF14b及GF14e在籽粒灌浆过程中的表达水平较高且变化幅度较大。通过蛋白序列分析发现,GF14b与GF14e间具有3个相同,2个差异的motif功能位点。通过亲和层析试验,在籽粒中共鉴定到59个与GF14b和72个与GF14e互作的靶蛋白,其中有43个靶蛋白与2个成员均有互作,分别有16个和29个靶蛋白与GF14b和GF14e特异结合。随机选取2个靶蛋白进行体外蛋白互作验证,结果表明靶蛋白SUS3与GF14b和GF14e均存在互作关系,而靶蛋白PSA仅与GF14e有相互作用关系,验证了亲和层析结果的准确性。蛋白功能的分析表明,GF14b和GF14e通过与靶蛋白的结合,共同参与了籽粒灌浆过程中蔗糖转化、淀粉合成、糖酵解、TCA循环等碳代谢途径。同时,GF14b及GF14e还具有特异的调控功能,其中GF14b与核酸代谢及物质转运密切相关,而GF14e与C1代谢中的关键蛋白存在互作。此外,大部分靶蛋白均鉴定到具有潜在的Ser和Thr磷酸化位点。外源激素处理下,籽粒中GF14b和GF14e上调表达,而与淀粉合成代谢相关的靶基因（SUS2、 AGPS、AGPL、PPDK2、SBE）大部分呈下调表达的趋势。【结论】14-3-3基因家族成员GF14b和GF14e在水稻籽粒灌浆过程中的表达变化幅度较大,且会响应激素浓度的改变,并通过蛋白互作的形式负调控淀粉合成代谢相关基因的表达,从而对水稻籽粒淀粉的合成起到重要的调控作用。     

α-亚麻酸对TM3细胞活性及相关基因表达的影响

α-亚麻酸(ALA)是哺乳动物必需脂肪酸的重要成员,在机体生长和发育过程中起着重要作用。在雄性动物生殖系统,ALA通过代谢生成二十二碳六烯酸(DHA)和二十碳五烯酸(EPA),进而对生殖系统发挥调控功能。采用WST-1、JC-1以及RT-PCR等方法研究ALA对体外培养的小鼠睾丸间质细胞TM3细胞的活力及相关基因表达的影响。结果表明:培养体系中添加10,50,100,200,400μmol/L的ALA,处理24 h可以显著提高TM3细胞活力(P0.05),并且呈剂量依赖性。与对照组相比,50μmol/L的ALA处理24 h可以促进TM3细胞增殖,提高线粒体膜电位,抑制凋亡相关基因Caspase-3表达(P0.05),促进类固醇代谢相关基因StAR表达(P0.05)。这说明在体外培养体系中添加ALA可以增加TM3细胞活性,促进细胞增殖和StAR基因表达,抑制Caspase-3基因表达。     

重组鸡GSTA3蛋白对福美双诱导的TD肉鸡血清中Bax含量的影响

为研究谷胱甘肽硫转移酶A3(GSTA3)对胫骨软骨发育不良(TD)肉鸡血清中凋亡因子Bax的影响,试验将90羽1日龄AA肉仔鸡预饲7 d后,随机分为6组(A,B,C,D,E和F组),分别在8,9日龄对D,E,F组饲喂添加100 mg/kg福美双的日粮,将饲喂基础日粮组(A,B,C组)和添加福美双日粮组(D,E,F组)的肉鸡各分对照组(A,D组)、重组GSTA3蛋白低剂量(20μg/kg)注射组(B,E组)和高剂量(50μg/kg)注射组(C,F组),在试验第8,10,12天腿部肌肉注射重组GSTA3蛋白,对照组注射稀释用PBS。在饲喂福美双后第1,2,4天分别采集各组肉鸡血液、分离血清,利用ELISA方法测定肉鸡血清中Bax的含量。结果显示,低剂量的重组GSTA3蛋白显著降低第2天基础日粮(B)组肉鸡血清中Bax的浓度,同时显著降低第4天福美双处理(E)组肉鸡血清中Bax的浓度;高剂量的重组GSTA3蛋白显著降低第4天基础日粮(C)组和福美双处理(F)组肉鸡血清中Bax的浓度。低剂量的重组鸡GSTA3蛋白对降低TD肉鸡血清中Bax含量的效果较好,这一研究将为肉鸡TD的防治提供新的方向和研究基础。