大口黑鲈IGF-I基因内含子1、3和4序列多态性研究

根据大口黑鲈IGF-I基因的cDNA序列设计引物,克隆IGF-I基因内含子核苷酸序列,采用PCR产物直接测序方法,在中国养殖群体和美国野生群体中筛选IGF-I基因内含子上的多态位点.应用RFLP、CRS-RFLP和SSCP技术建立多态位点的检测方法,同时比较分析其中4个多态位点在两个群体中基因频率分布.结果表明:(1)IGF-I基因内含子1、3和4序列长分别为1 317 bp、712 bp和1 941 bp;(2)在3个内含子上共发现7个多态位点,其中在内含子1的208和1070位为G-A突变;内含子3的第40个碱基为一个 "A" 的插入-缺失突变,第307位为C-T突变,683位是G-A突变;内含子4上的696碱基处有一个20 bp的插入-缺失突变,在1 563位为G-A突变,表明大口黑鲈IGF-I基因序列上存在较多的SNPs;(3)内含子1上SNP G1070A的A等位基因能为Hind III限制性内切酶识别,采用RFLP技术分型.根据内含子1上SNP G208A侧翼序列,设计错配引物,使错配碱基和A等位基因共同形成Taq I酶切位点,建立CRS-RFLP检测方法.内含子4上SNP G1563A采用SSCP检测方法,同时对内含子4上的插入-缺失突变进行PAGE电泳分型.试验结果显示,RFLP、CRS-RFLP和SSCP三种SNP检测方法简单易行,适于在水产动物SNP标记研究中推广应用;(4)在中国养殖群体中,只有内含子1上的SNP G1070A具有多态性,其它3个多态位点只在美国野生群体中存在多态,证实中国养殖群体的遗传多样性相对较低.     

大口黑鲈胰岛素基因cDNA全序列的克隆及其编码蛋白的结构分析

胰岛素在鱼体内是一种重要的内分泌激素,其主要的生理功能是调控鱼体的代谢和血糖稳定。用RTPCR和cDNA末端快速扩增法（RACE）技术克隆了大口黑鲈（Micropterus salmoides）胰岛素基因cDNA全序列,并对其编码的氨基酸序列和蛋白结构进行了分析。结果显示,该基因cDNA序列全长665 bp,其中包括5′端非翻译区101 bp、3′端非翻译区213 bp和开放阅读框351 bp。该开放阅读框编码包括信号肽、B链、C肽和A链的116个氨基酸,其分子量约为12.7 ku,理论等电点为5.44。在线分析表明：推测的大口黑鲈前胰岛素原氨基酸序列存在一段跨膜区;并存在信号肽序列,信号肽分裂位点在Ala24Phe25处。大口黑鲈与其他硬骨鱼类及脊椎动物的前胰岛素原氨基酸序列的比对结果显示,大口黑鲈前胰岛素原A链和B链氨基酸序列均高度保守,与其他硬骨鱼类的前胰岛素原氨基酸序列相似度较高,为75%~94%,但与其他脊椎动物的相似度较低,为59%~62%。用邻接法构建的系统进化树显示,大口黑鲈前胰岛素原与同为鲈形目的岩钝鲈、红甘鲹和尼罗罗非鱼的亲缘关系较近。     

大口黑鲈食性快速驯化技术研究

大口黑鲈养殖过程中,食性驯化是决定养殖成败的关键点之一。本文采用"诱食+迫食""定点+沿线"的投喂方法,实现了大口黑鲈食性的快速转化,缩短了驯化时间,提高了驯化成活率,从而进一步提高了养殖效益。     

香猪PIT-1基因内含子多态性的研究

采用PCR和DNA测序方法,对香猪及对照猪种(上海白猪、大约克夏猪)的PIT-1基因进行了单核苷酸多态性(SNP)分析,并采用RT-PCR方法对3个猪种PIT-1基因的表达水平进行了半定量分析。结果显示:香猪在DNA序列的963位(位于第4内含子)和1429位(位于第5内含子)分别发生G→A突变,而对照猪种在这2个位置未发生突变;香猪PIT-1基因表达水平显著低于上海白猪和大约克夏猪(P<0.05)。结论:香猪第4和第5内含子的两处突变可能会造成PIT-1基因表达量下降,最终可能导致香猪的生长受到影响。     

大口黑鲈早期生长发育规律的研究

为了研究大口黑鲈Micropterus salmodies早期生长的发育规律,选用8个全同胞家系的大口黑鲈,每月从每个家系中随机选取30～40尾,对其体重和体长进行测量。运用Gompertz、Logistic和Von Bertalanffy3种非线性模型对大口黑鲈体重和体长的生长进行非线性曲线拟合分析,同时利用幂函数方法对大口黑鲈体重与体长的生长关系进行分析。结果表明：3种非线性模型均能较好的模拟大口黑鲈体重和体长的生长,而Logistic模型拟合效果更佳;进一步分析体重和体长的最佳拟合参数,发现体重和体长的拐点月龄分别为5.77月龄和4.95月龄,拐点处体重和拐点处体长分别为146.35 g、13.75 cm;幂函数方程能很好地拟合大口黑鲈体重和体长之间的关系,其方程为W=0.076L2.650（R2=0.998）。研究结果可为大口黑鲈养殖中的饲养管理和品种选育提供参考。     

大口黑鲈胰岛素基因cDNA全序列的克隆及其编码蛋白的结构分析

胰岛素在鱼体内是一种重要的内分泌激素,其主要的生理功能是调控鱼体的代谢和血糖稳定。用RT-PCR和cDNA末端快速扩增法(RACE)技术克隆了大口黑鲈(Micropterus salmoides)胰岛素基因cDNA全序列,并对其编码的氨基酸序列和蛋白结构进行了分析。结果显示,该基因cDNA序列全长665 bp,其中包括5'端非翻译区101 bp、3'端非翻译区213 bp和开放阅读框351 bp。该开放阅读框编码包括信号肽、B链、C肽和A链的116个氨基酸,其分子量约为12.7 ku,理论等电点为5.44。在线分析表明:推测的大口黑鲈前胰岛素原氨基酸序列存在一段跨膜区;并存在信号肽序列,信号肽分裂位点在Ala24-Phe25处。大口黑鲈与其他硬骨鱼类及脊椎动物的前胰岛素原氨基酸序列的比对结果显示,大口黑鲈前胰岛素原A链和B链氨基酸序列均高度保守,与其他硬骨鱼类的前胰岛素原氨基酸序列相似度较高,为75%～94%,但与其他脊椎动物的相似度较低,为59%～62%。用邻接法构建的系统进化树显示,大口黑鲈前胰岛素原与同为鲈形目的岩钝鲈、红甘鲹和尼罗罗非鱼的亲缘关系较近。研究亮点:采用RT-PCR和RACE技术首次克隆了...     

玫瑰冠鸡IGF-I基因多态性与体重及屠体性状关系的研究

采用PCR-RFLP技术,对100只玫瑰冠鸡的胰岛素样生长因子一I(IGF-I)基因的5′端调控区进行遗传多态性研究,该调控区的扩增产物经PstI酶切后出现"-/-"+/-"+/+"3种基因型,其基因型频率分别是0.22、0.36和0.42。经x2检验,玫瑰冠鸡在IGF-I位点上处于哈代-温伯格平衡状态(P>0.05)。分析基因型与12周龄体重和部分屠体性状时发现:玫瑰冠鸡在12周龄体重、半净膛重和胸肌重上都存在"-/-">"+/-">"+/+"的趋势,且在半净膛重和胸肌重上,"-/-"型和"+/-"个体显著高于"+/+"型个体(P<0.05);在12周龄体重上,"-/-"型显著高于"+/+"型个体(P<0.05)。     

大口黑鲈早期生长发育规律的研究

为了研究大口黑鲈Micropterus salmodies早期生长的发育规律,选用8个全同胞家系的大口黑鲈,每月从每个家系中随机选取30～40尾,对其体重和体长进行测量。运用Gompertz、Logistic和Von Bertalanffy3种非线性模型对大口黑鲈体重和体长的生长进行非线性曲线拟合分析,同时利用幂函数方法对大口黑鲈体重与体长的生长关系进行分析。结果表明:3种非线性模型均能较好的模拟大口黑鲈体重和体长的生长,而Logistic模型拟合效果更佳;进一步分析体重和体长的最佳拟合参数,发现体重和体长的拐点月龄分别为5.77月龄和4.95月龄,拐点处体重和拐点处体长分别为146.35 g、13.75 cm;幂函数方程能很好地拟合大口黑鲈体重和体长之间的关系,其方程为W=0.076L2.650(R2=0.998)。研究结果可为大口黑鲈养殖中的饲养管理和品种选育提供参考。     

大口黑鲈幼鱼低温耐受、耗氧率和窒息点研究

对大口黑鲈北方亚种（N）、佛罗里达亚种(F)及其正交子代（N♀×F♂）和反交子代（F♀×N♂）幼鱼的耐低温限度、耗氧率和窒息点进行了测定。结果表明：在驯化温度为20 ℃,降温速率为2 h/℃时,北方亚种的半致死低温最低为(3.10±0.17) ℃,佛罗里达亚种最高,为(5.05±0.21) ℃,正、反交子代介于两亲代群体之间,分别为(4.80±0.06) ℃和(4.20±0.17) ℃,对4种鱼的半致死低温进行单因素方差分析,显示4种大口黑鲈的半致死低温具有显著性差异（P<0.05）。采用封闭式流水装置测定大口黑鲈北方亚种、佛罗里达亚种及正反交子代的昼夜平均耗氧率分别为0.136 8 mg/(g·h)、0.1811mg/(g·h)、0.168 1mg/(g·h)和0.138 8 mg/(g·h),4个群体的昼夜平均耗氧率差异不明显。窒息点测定显示佛罗里达亚种的窒息点最高为0.4 mg/L,北方亚种的最低为0.33 mg/L,4个群体在窒息点上差异不显著（P>0.05）     

配合饲料、冰鲜杂鱼对大口黑鲈生长和LPL基因mRNA表达的影响

以体质量为40 g的大口黑鲈Micropterus salmoides为试验对象,分别投喂冰鲜杂鱼（对照）、 A配合饲料（脂肪含量8.2%）和B配合饲料（脂肪含量14.5%）,饲养试验共进行3个月,试验结束时测量各组鱼的生长性状,并检测其肝脏中两种脂蛋白脂肪酶基因LPLtype1和LPLtype2 mRNA的表达量。结果表明：喂食冰鲜杂鱼的大口黑鲈平均体质量增加率显著高于喂食两种配合饲料的大口黑鲈（ P〈0.05）;喂食B配合饲料的大口黑鲈肝脏中LPLtype1和LPLtype2 mRNA的相对表达量与对照组、喂食A配合饲料的组存在显著性差异（P〈0.05）,饲料脂肪水平越高, LPLtype1和LPLtype2 mRNA的表达量也越高。研究表明,脂蛋白脂肪酶LPLtype1和 LPLtype2基因编码的蛋白都具有分解贮存在肝脏细胞中多余脂肪的功能,且LPLtype2与LPLtype1基因可能存在更加精细的分工, LPLtype2比LPLtype1更易受饲料脂肪含量的调节,推测LPLtype2在参与分解肝细胞的脂肪中可能起到更大的作用。     

恩诺沙星在大口黑鲈(Micropterus salmoides)体内代谢动力学研究

给大口黑鲈(Micropterus salmoides)连续5 d口服30 mg·kg^-1剂量(以体质量计)的恩诺沙星,利用液相色谱技术测定不同时间点大口黑鲈各组织中恩诺沙星的含量,建立药时曲线,探讨恩诺沙星在大口黑鲈体内的代谢动力学。结果表明:在(25±2)℃水温下,大口黑鲈血液、肌肉、肝脏中恩诺沙星的达峰时间均为4 h,吸收半衰期分别为0.998、2.176、1.892 h,消除半衰期分别为8.494、23.84、37.53 h,血液中的药时曲线下总面积为132.23 μg·mL^-1·h,肌肉和肝脏中的药时曲线下总面积分别为273.50、247.12 μg·g^-1·h。25 ℃下,恩诺沙星在大口黑鲈体内的建议休药期为15 d。     

饲料中添加植酸酶对大口黑鲈生长和消化酶活性的影响

用添加不同水平植酸酶（0、500、1 000、1 500 U/kg）的饲料喂养初始体重为23 g左右的大口黑鲈Micropterus salmoides56 d,研究植酸酶对大口黑鲈生长和消化酶活性的影响。结果显示：饲料中添加1 000U/kg植酸酶能显著促进大口黑鲈的生长,降低饲料系数（P〈0.05）。1 000、1 500 U/kg组大口黑鲈胃蛋白酶活性较对照组分别提高了28.14%和20.09%,差异显著（P〈0.05）;各处理组鱼幽门盲囊中蛋白酶活力与对照组相比差异显著（P〈0.05）,而肠道中蛋白酶活性差异不显著（P〉0.05）。与对照组相比,各处理组鱼肝胰脏和肠淀粉酶活性有所提高,但差异不显著（P〉0.05）;1 000、1 500 U/kg组大口黑鲈的胃淀粉酶活性有所降低,但差异不显著（P〉0.05）。     

维生素C对大口黑鲈生长与非特异性免疫的影响

用添加不同剂量维生素C(分别为0、0.5、1、2、4 g/kg)的饲料喂养初始体重为19 g左右的大口黑鲈Micropterus salmoides 2个月,研究维生素C对大口黑鲈生长及非特异性免疫的影响.结果显示:饲料中添加维生素C＞1 g/kg,能显著促进大口黑鲈的生长,提高其脾体指数(P＜0.05),然而对大口黑鲈的饲料系数、成活率、肥满度、内脏比指数以及肝体指数等的影响均不显著(P＞0.05);试验前50 d,饲料中添加维生素C能显著提高大口黑鲈血清中溶菌酶的活力(P＜0.05),第60 d,饲料中添加维生素C为2g/kg以上时,能显著提高大口黑鲈血清中溶菌酶活力(P＜0.05);试验前30 d,饲料中添加维生素C能显著提高大口黑鲈血清中超氧化物歧化酶活力(P＜0.05),后30 d大口黑鲈血清中超氧化物歧化酶活力下降;随着饲料中维生素C添加水平的提高,大口黑鲈肝脏中维生素C的积累量显著升高(P＜0.05).试验证明,维生素C能有效地提高大口黑鲈的生长与非特异性免疫能力.     

大口黑鲈遗传连锁图谱的构建

采用AFLP技术结合＂拟测交＂策略,以大口黑鲈Micropterus salmoides选育家系作为亲本进行单对杂交产生的F1代家系为作图群体,初步构建了大口黑鲈雌、雄性遗传连锁图谱。结果表明：用64对AFLP引物组合对父母本和106个子代个体进行遗传分析,共得到398个分离标记。母本分离标记有189个,其中172个符合1∶1孟德尔分离规律;父本分离标记有209个,其中181个符合1∶1孟德尔分离标记。雌性框架图包括75个遗传标记,分布在21个连锁群中,有6个三联体,6个连锁对,标记间平均间隔为18.22cM,图谱总长度为983.8 cM;雄性框架图包括82个遗传标记,分布在22个连锁群中,有7个三联体,5个连锁对,标记间平均间隔为19.22 cM,图谱总长度为1153.2 cM。雌、雄性基因组估算长度分别为1 399.85和1 582.72,图谱的总覆盖率分别达到70.28%和72.86%。     

大口黑鲈虹彩病毒双重PCR检测方法的建立

为同时检测患病大口黑鲈中不同属虹彩病毒感染和带毒情况,针对蛙病毒属和肿大细胞病毒属大口黑鲈虹彩病毒主衣壳蛋白（major capsid protein,MCP）基因的序列,分别设计1对特异性引物Rana-mcp F/R和Mega-mcp F/R,扩增产物片段大小分别为475 bp和262 bp。通过PCR反应体系的优化、反应的特异性和灵敏度试验,建立一种可以同时检测大口黑鲈蛙病毒属和肿大细胞病毒属虹彩病毒感染的双重PCR检测方法,最低DNA检测量分别为6.5 pg和14.5 pg。用此方法,对临床获得的15个大口黑鲈样品进行双重PCR检测和序列测定,获得5个蛙病毒属和1个肿大细胞病毒属虹彩病毒检测阳性结果。本研究中建立的基于MCP基因的大口黑鲈虹彩病毒双重PCR检测方法,可用于养殖大口黑鲈虹彩病毒病快速鉴别诊断和分子流行病学调查。     

MS-222在加州鲈鱼模拟运输中的麻醉效果

研究了加州鲈鱼(Micropterus salmoides)在10、20、30、40、50、60和70 mg/L的MS-222麻醉液中的麻醉效果,并在20 mg/L的MS-222麻醉液中研究了10、15、20和25℃水温对麻醉效果的影响,最后在20℃和20 mg/L的MS-222麻醉液中进行了麻醉模拟运输试验。麻醉试验结果表明:随着MS-222浓度的增加,进入相同麻醉期的时间缩短,完全复苏的时间延长。10~20 mg/L的MS-222适于加州鲈鱼的麻醉运输。麻醉时间随着水温的降低而缩短,复苏时间随着水温的降低而增加。20~25℃水温适于加州鲈鱼的麻醉运输。麻醉模拟运输试验结果表明:运输17 h存活率100%,运输24 h存活率降到70%。麻醉的鱼复苏时间随运输时间的增加而增加。麻醉运输后,肌肉中糖元含量下降,乳酸含量上升。血清皮质醇变化差异不显著但都显著高于基础组(P0.05)。天冬氨酸氨基转移酶(AST)、尿素(UREA)、乳酸脱氢酶(LDH)在运输前10 h差异不显著之后显著升高(P0.05),葡萄糖(GLU)随运输时间的增加而增加。     

大口黑鲈两个亚种EST数据库分析

应用新一代高通量测序技术Roche 454对大口黑鲈(Micropterus salmoides)北方亚种和佛罗里达亚种进行转录组测序并建立ESTs数据库,结果得到北方亚种ESTs序列468 671条,佛罗里达亚种ESTs序列332 322条,两亚种ESTs序列的平均长度分别为306.5 bp 和304.4 bp。将得到的高质量序列进行拼接,大口黑鲈北方亚种和佛罗里达亚种共得到contig序列总数分别为42 056条和35 743条,平均长度分别为612.6 bp和588.2 bp。将大口黑鲈北方亚种和佛罗里达亚种的数据库合并,通过与蛋白数据库比对后,共78 938条EST序列被注释,根据Gene Ontology（GO）信息,对序列按照分子功能、细胞组成、生物学过程进行分类。通过对大口黑鲈合并的EST库信息进行大通量SSR和SNP位点的发掘,发现了含SSRs和SNPs的序列分别为25 469和8 547条。从EST数据库中随机选取75条contigs进行北方亚种和佛罗里达亚种的序列比较,结果表明两个亚种EST序列同源性为99.2%。