Preparation and Identification of Specific Monoclonal Antibody against Porcine Circovirus Type 2

以人工合成 PCV2 Cap蛋白表位的串联多肽作为抗原免疫 BALB/c小鼠,利用淋巴细胞瘤杂交技术获得了1株稳定分泌抗PCV2-rCap 蛋白的杂交瘤细胞株,命名为670#。该株杂交瘤细胞诱导同品系小鼠产生的腹水抗体效价为l∶100000。 Western blot结果显示,该株单抗可与表达原核 PCV2 PET32a-ORF2重组蛋白、真核表达 ORF1-ORF2串联蛋白及 PCV2全病毒细胞培养物反应;间接 ELISA证明该单核可与 ORF1-ORF2串联蛋白结合;IFA结果表明,该单抗可与天然PCV2病毒结合。该单抗的制备为 PCV2抗原表位分析及分子诊断提供了技术手段。     

猪圆环病毒2型衣壳蛋白单克隆抗体的制备及鉴定

为获得猪圆环病毒2型(PCV2)衣壳蛋白单克隆抗体,将516 bp的ORF2基因片段克隆入pET-28a(+),转化入大肠杆菌,在IPTG的诱导下表达,用SDS-PAGE和Western blot对表达产物进行鉴定。将纯化的重组蛋白免疫小鼠,制备单克隆抗体,叠加ELISA方法检测两株单克隆抗体识别的抗原表位关系。SDS-PAGE和Western blot结果表明重组蛋白ORF2得到高效表达;筛选获得两株稳定分泌抗ORF2单克隆抗体的杂交瘤细胞系3H3和3F2,其分泌的单体均为IgG1亚型;且均具有较高的特异性和敏感性;叠加ELISA显示,两株单克隆抗体识别不同的抗原表位。本研究制备的单抗有较好的生物学特性,为PCV2的研究及快速准确诊断方法的建立提供了平台。     

猪圆环病毒2型Cap蛋白核定位信号区抗原表位的鉴定

【目的】猪圆环病毒2型(PCV2)是引起断奶仔猪多系统衰竭综合症(PMWS)的重要病原,其基因组ORF2编码的Cap蛋白为病毒的主要结构蛋白,起保护性抗原作用,对其进行抗原表位鉴定十分必要。【方法】本研究采用杆状病毒表达的重组Cap蛋白作为免疫原制备5株单克隆抗体,通过原核表达系统对ORF2基因进行了截短表达,先行对Cap蛋白抗原表位进行宽幅定位,然后利用合成多肽对Cap抗原表位做精确扫描定位。【结果】5株单抗中有4株针对同一抗原表位,坐落在Cap蛋白N末端核定位信号区,经多肽扫描证实,核心序列为26RPWLVHPRHRY36;另1株单抗(1D2)仅与重组Cap蛋白产生免疫活性反应,对4个分段截短表达的Cap蛋白无免疫活性反应,鉴于该单抗具有中和病毒活性,针对的可能是构象表位。【结论】本研究首次鉴定出位于Cap蛋白核定位信号区的一个抗原表位,为以后Cap蛋白功能及核定位机理的研究奠定基础。     

猪圆环病毒衣壳蛋白单克隆抗体的制备

以大肠杆菌表达的猪圆环病毒2型(PCV2)重组衣壳蛋白(GST-CAP2)为抗原,以一定的免疫程序接种BALB/c小鼠后,取其脾细胞与骨髓瘤细胞SP2/0按常规杂交瘤技术进行融合.以GST-CAP2以及猪圆环病毒1型(PCV1)重组衣壳蛋白(GST-CAP1)为包被抗原,经间接ELISA筛选获得2株能稳定分泌针对PCV的单克隆抗体的杂交瘤细胞株(M1和G1).通过dot-ELISA、Western-blotting以及间接免疫荧光(IFA)技术证明G1株分泌的单抗同时识别PCV1和PCV2, 而M1株分泌的单抗则特异性针对PCV2.该单抗的制备将为进一步建立快速检测PCV的方法奠定基础.     

抗鸭坦布苏病毒NS5蛋白单克隆抗体的制备及鉴定

【目的】制备抗鸭坦布苏病毒(Duck Tembusu virus,DTMUV)NS5蛋白的单克隆抗体。【方法】将实验室保存的PET28a-NS5载体转化入Rosetta(DE3)感受态细胞中进行诱导表达,利用纯化的鸭坦布苏病毒NS5蛋白作为抗原免疫BALB/c小鼠,应用淋巴瘤细胞杂交技术结合有限稀释法制备单抗,并对单抗的特异性、反应性及其抗原表位和亚类进行鉴定。【结果】筛选获得2株稳定分泌针对DTMUV的NS5蛋白单抗的杂交瘤细胞,分别命名为A4D1和B4B8。此2株杂交瘤细胞诱导BALB/c小鼠的抗体效价均可达到1∶64 000。间接ELISA、Western blot和间接免疫荧光(IFA)检测结果表明,所获细胞分泌的抗体能与DTMUV及纯化的NS5蛋白发生特异性反应。经鉴定2株单抗的亚类均为IgG1型,通过叠加ELISA方法,初步判定2株单抗识别不同的抗原表位。【结论】成功获得了抗鸭坦布苏病毒NS5蛋白的单克隆抗体,为研究NS5蛋白的功能奠定了基础。     

猪Ⅱ型圆环病毒ORF1、ORF2基因串联重组腺病毒的构建及其免疫效果

【目的】构建含PCV2ORF1和ORF2基因的串联重组腺病毒,并对其免疫效果进行评价。【方法】扩增PCV2的ORF1和ORF2基因,串联克隆入pMD18-T载体后亚克隆入腺病毒穿梭质粒pAdTrack-CMV中,阳性穿梭质粒经PmeⅠ酶线性化后与骨架载体pAdeasy-1在细菌BJ5183内完成重组,获得重组腺病毒质粒。将重组腺病毒质粒用PacⅠ酶线性化后转染293细胞,包装成重组腺病毒,然后从致细胞病变、荧光检测及PCR检测等方面对该重组腺病毒进行了鉴定。以该重组腺病毒免疫小鼠,对免疫鼠血清中PCV2的特异性抗体进行检测。【结果】得到了PCV2的ORF1和ORF2基因,pMD18-ORF1-ORF2和pAdCMV-ORF1-ORF2载体构建成功,获得了含有PCV2ORF1和ORF2基因的重组腺病毒。该重组腺病毒免疫小鼠后,在小鼠血清中可检测到PCV2的特异性抗体。【结论】成功构建了含PCV2ORF1和ORF2基因的重组腺病毒,此腺病毒可诱导机体产生针对PCV2的特异性抗体。     

鹅星状病毒刺突蛋白单克隆抗体的制备与鉴定

为了制备鹅星状病毒(goose astrovirus, GAstV)刺突(Spike)蛋白的单克隆抗体,并对获得的单克隆抗体的生物学特性进行鉴定,将大肠杆菌表达的截短Spike蛋白免疫BALB/c小鼠,经细胞融合和单克隆抗体的筛选来获得阳性杂交瘤细胞,并进一步利用免疫印迹和间接免疫荧光技术进行单抗的鉴定;采用ELISA技术进行单克隆抗体亚型、抗体效价的测定;同时根据GAstV XX株Spike蛋白序列合成重叠的多肽库进行单抗识别的抗原表位鉴定。共获得3株阳性杂交瘤细胞,分别命名为1A5、2B4、12E6;免疫印迹和间接免疫荧光实验显示3株单克隆抗体均与Spike蛋白具有良好的免疫反应,其中2B4、12E6可与GAstV发生反应;亚型鉴定结果显示单抗12E6、2B4为IgG2b亚类,单抗1A5为IgG2a亚类;轻链均为κ链;敏感性结果显示,抗体效价都在1∶51 200以上;抗原表位的鉴定结果表明单抗1A5识别的抗原表位为(EP16)ELRNRLNIADGDYVI,单抗2B4识别的抗原表位为(EP21)AGDSNPGETFQNFKM。本研究成功制备了针对GAstV Spike蛋白的单克隆抗...     

猪δ冠状病毒NS7蛋白单克隆抗体制备及其抗原表位鉴定

猪δ冠状病毒(PDCoV)是1种新型猪冠状病毒,该病毒对各年龄段的猪均易感,尤其是对新生仔猪具有较高的致病性,可引起严重腹泻和高病死率。为获得抗PDCoV NS7和NS7a蛋白的单克隆抗体,先以PDCoV-GX2021-1毒株为模板扩增目的基因并构建原核表达载体,经IPTG诱导表达和SDS-PAGE切胶洗脱方法纯化目的蛋白。再按照免疫程序免疫小鼠并运用间接免疫荧光试验检测小鼠血清中特异性抗体;将血清阳性的小鼠脾细胞与骨髓瘤细胞融合后进行亚克隆筛选,获得1株可持续传代并产生抗NS7和NS7a蛋白抗体的单克隆杂交瘤细胞(命名为1-A08)。运用间接免疫荧光试验鉴定该单抗可特异性标记PDCoV感染细胞,Western blot和IP试验发现该单抗可特异性结合NS7和NS7a蛋白。此外,通过Western blot试验鉴定出该单抗的B细胞线性表位为₁₁₁PSTLEED₁₁₇。将该单抗的抗原表位序列与NCBI中发布的168株PDCoV NS7蛋白这一区域的氨基酸序列进行比对分析,发现该单抗的抗原表位较为保守,与其中160株的氨基酸序列一致。     

新城疫病毒F_(48)E_9株重组NP蛋白单克隆抗体制备及鉴定

制备新城疫病毒(NDV)NP蛋白单抗,以期为NDV抗原表位研究及检测方法建立方面奠定基础。利用NDV F48E9株pET32a-NP重组蛋白免疫BALB/c小鼠,采用杂交瘤细胞技术,间接ELISA筛选,获得了2株稳定分泌抗NP重组蛋白单克隆抗体的杂交瘤细胞株,分别命名为1G3、4B12。经间接ELISA测定,腹水抗体效价分别为1 2.56×105、1 5.12×105。亚类鉴定结果表明这两株单抗均为IgG1。Western blot分析结果显示,1G3、4B12均能特异性识别重组NP蛋白。与NDV感染细胞经间接免疫荧光试验检测均呈黄绿色荧光。经相加ELISA测定表明两株单抗识别的抗原表位不同。     

猪圆环病毒Ⅱ型Cap蛋白单克隆抗体的制备及初步应用

利用PCV2病毒免疫8周龄BALB/c雌性小鼠,取其脾细胞与SP2/0骨髓瘤细胞融合,原核表达的PCV2病毒Cap蛋白作为检测抗原进行ELISA检测,获得了1株PCV2单抗,命名为2E9。用PCV2全病毒免疫小鼠,能获得特异性针对PCV2病毒的单克隆抗体。为建立特异性强、敏感性高、简便快速的PCV2检测方法打下了基础。     

盖塔病毒E2蛋白单克隆抗体的制备及其抗原表位鉴定

为制备盖塔病毒(GETV) E2蛋白单克隆抗体,通过大肠埃希菌表达系统表达重组E2蛋白,经过镍柱吸附、切胶纯化,获得E2蛋白,将其作为免疫原免疫BALB/c小鼠,3次免疫后加强免疫,细胞融合,通过间接免疫荧光筛选阳性杂交瘤细胞,最终筛选出1株针对GETV E2蛋白的阳性杂交瘤细胞9E8,将该杂交瘤细胞注射入小鼠腹腔内生产腹水。经间接免疫荧光试验和蛋白免疫印迹试验鉴定,该单抗可与GETV发生特异性反应。经IP试验证明,该单抗可识别天然结构的GETVE2蛋白。对E2单抗进行抗原表位鉴定,确定其所识别的多肽序列为⁶⁶KIRYIAGHD⁷⁴。与GenBank上登录的其他GETV毒株序列对比,发现该段序列高度保守。综上,E2单抗9E8免疫学反应特性良好,为研究该病毒提供了有效的免疫学检测工具。     

猪圆环病毒2型贵州株ORF1基因的生物信息学分析

为了解猪圆环病毒2型贵州株(PCV2-GZ)ORF1基因的生物学特性,针对ORF1基因设计1对特异性引物,取PCV2阳性病料DNA为模板进行PCR扩增,克隆测序后进行生物信息学分析。结果表明:PCV2-GZ ORF1基因序列与GenBank登录的14株PCV2(06-06274,CC1,HUB-5,HUN-11,JX-1,LN-3,P710-1,PCV2HERD D,SC-10,SVP-321,SX-1,VOS 2689006,ZJ-38,N1)相应序列核苷酸的同源性为96.8%~99.7%,与国内HUB-5和ZJ-38的同源性最高,均为99.7%;PCV2-GZ编码的Rep蛋白与P710-1、HUB-5、SC-10、ZJ-38株的氨基酸序列同源性较高,均为99.4%。PCV2-GZ Rep蛋白可形成优势抗原表位,且不存在跨膜结构和信号肽,推测可进行PCV2 ORF1基因的全基因表达。     

猪繁殖与呼吸综合征病毒S1株单抗AG1的生物学特性及夹心ELISA诊断方法的建立

用纯化的猪繁残呼吸综合征病毒沪1株（PRRSV-S1）病毒液作抗原，免疫BALB/C小鼠，获得1株稳定分泌抗PRRSV单抗的杂交瘤细胞株，命名为AG1。ELISA交叉试验和阻断试验表明，AG1具有高度特异性。AG1可与PRRSV-S1、美洲株VR-2332、欧洲株LV反应，对猪细小病毒（PPV）、猪伪狂犬病毒（PRV）、猪乙型脑炎病毒（JEV）均不反应。阳性杂交瘤细胞的上清液效价AG1属于IgG2b，腹水效价在1：10^-3-10^-5之间。AG1有100条染色体，琼脂双扩散试验结果表明AG1属于IgG2b。Western bloting试验表明AG1是针对N蛋白抗原表位的特异性单抗。以AG1为捕捉抗原抗体和酶标抗体，建立了快速检测PRRSV抗原的单抗夹心ELISA法，该方法具有快速、灵敏、准确、广谱等特点。     

一株高病毒载量 PCV2 毒株的基因组特征及序列分析

【目的】了解广东省某猪群中猪圆环病毒 2 型（Porcine circovirus type 2,PCV2）流行毒株的遗传进化情况,丰富 PCV2 分子流行病学数据,为当地 PCV2 疫苗候选株的选用和研发提供参考。【方法】使用 qPCR 方法对疑似 PCV2 的样品进行检测,发现 1 株具有高病毒载量的 PCV2 毒株,命名为 GD222858。通过 PCR 方法进行全基因组分子克隆及遗传进化分析。使用 MegAlign 软件将该毒株 ORF1、ORF2 基因编码的氨基酸序列与 PCV2 同亚型参考毒株进行比对,分析氨基酸序列的相似性;采用 DNAStar 预测该毒株的 Cap 蛋白二级结构及 B 细胞表位,并与 4 株疫苗株 DBN-SX07-2（HM641752）、LG（HM038034）、SH（HM038027）、ZJ（AY686764）的 Cap 蛋白抗原指数进行比对分析。【结果】GD222858 毒株基因组长度为 1 767 bp。遗传进化分析表明该毒株属于 PCV2d 亚型。与国内外 82 株参考毒株的核苷酸相似性为 91.4%~99.6%,与越南毒株 Han8（GenBank 登录号：JQ181600）的亲缘关系最近。在 ORF1 编码的 Rep 蛋白处发现多个特异性突变位点 F70Y、F77L、W202R、N256S;ORF2 编码的Cap 蛋白相对保守。Protean 预测 Cap 蛋白的氨基酸第 5~18、24~25、39~41、48~49、57~65、99、101、112~114、139~140、145~150、162~165、175~181、188~189、205~211、227~232 位 置 处 均 可 能 存 在 潜 在 的 B 细 胞 表 位。GD222858 毒株的 Cap 蛋白抗原指数与 4 株疫苗株均有差异,在氨基酸 45~57、124~132、223~233 位置处抗原指数明显高于 4 株疫苗株,且与疫苗株 HM038034 差异最大。【结论】GD222858 毒株感染猪群的原因可能是 Rep 蛋白多个位点发生特异性突变及疫苗株选用不当所致。     

免疫组织化学方法诊断猪圆环病毒病

以猪圆环病毒Ⅱ型ORF2(PCV2-ORF2)重组蛋白为抗原,按常规免疫方法免疫家兔,制备兔抗猪圆环病毒Ⅱ型ORF2重组蛋白的IgG,以此IgG为第一抗体,采用免疫组织化学二步法,对临床疑似猪圆环病毒病例及RT-PCR确诊为阳性猪圆环病毒病例的肺脏组织切片进行检测。试验结果证明,该免疫组织化学方法具有良好的特异性、直观性,简单易行,可以对猪肺巨噬细胞中的存在的PCV2病毒抗原进行准确的定性和定位诊断。     

H9N2亚型禽流感病毒单克隆抗体的制备及其表位鉴定

[目的]制备H9N2亚型禽流感病毒单克隆抗体和鉴定表位。[方法]选取H9N2亚型禽流感病毒(AIV)WD-1株的纯化抗原免疫BALB/c小鼠,对获得2株抗H9N2亚型禽流感病毒的特异性单抗4C10和6E3表位进行鉴定。[结果]单抗4C10和6E3分别属于IgG1和IgG2b亚型,ELISA检测效价分别为1∶10~3和1∶10~5;HI效价分别为2~(15)和2~(14);2株单抗均具有鸡胚中和活性。利用噬菌体展示表位技术对2株单抗的抗原表位进行鉴定,结果显示均为针对HA蛋白的1个线性表位。[结论]该研究为禽流感病毒快速诊断方法的建立提供了依据。     

猪圆环病毒Ⅱ型ORF2重组蛋白抗体诊断试剂IgG的研制

应用猪圆环病毒Ⅱ型(Porcine circovirus 2,PCV2)ORF2重组蛋白,研制诊断PCV2的抗体试剂.利用原核表达系统表达PCV2 ORF2蛋白,经12%浓度的SDS-PAGE凝胶电泳分析后免疫家兔制备抗PCV2 ORF2重组蛋白抗体,并用间接酶联免疫吸附试验(indirect-ELISA)确定其效价,然后以Western blotting法分析该抗体特异性.结果表明:PCV2 ORF2重组蛋白被表达,且在免疫家兔后获得效价高、特异性好的抗体.兔抗PCV2-ORF2重组蛋白抗体以其特异性好的特点可以作为免疫诊断试剂.     

猪圆环病毒Ⅱ型Cap蛋白单克隆抗体的制备及鉴定

以纯化复性的猪圆环病毒Ⅱ型(PCV2)Cap重组蛋白作为免疫原,按常规方法免疫BALB/c小鼠,取其脾细胞与SP2/0细胞融合,经间接ELISA筛选,获得了3株分泌PCV2-Cap蛋白单克隆抗体的杂交瘤细胞,分别命名为1C7A4、4F3F5和4G8F7,其染色体平均数为98～103,间接ELISA检测3株细胞培养上清效价分别为1:3125、1:3125、1:15625,小鼠腹水效价分别为1:390000、1:390000、1:1950000.ELISA结果显示,1C7A4、4F3F5和4G87F仅与融合表达的PCV2-Cap蛋白反应,而与PET-32a载体表达的蛋白不反应.相加ELISA结果显示3株单克隆抗体对应两个不同的病毒抗原位点.间接免疫荧光结果显示,1C7A4、4F3F5和4G8F7能与PCV2发生反应,而不与PCV1发生交叉反应.结果表明所获得的3株单抗是PCV2型特异性的,为PCV1和PCV2鉴别诊断方法的建立奠定了基础.     

猪圆环病毒2d亚型病毒样颗粒的制备

为了制备猪圆环病毒2d亚型病毒样颗粒,根据GeneBank上公布的PCV2d亚型HB-MC1株的序列和大肠杆菌密码子使用频率表优化合成PCV2d亚型ORF2基因,克隆到原核表达载体pET30a(+),获得重组表达质粒pET30a-Cap2d,将该质粒转化入Rosetta(DE3)宿主菌,IPTG诱导表达。利用SDS-PAGE对目的基因的表达及产物的可溶性进行分析,利用Western blot和琼脂凝胶免疫扩散试验鉴定重组蛋白的免疫原性,并利用电镜技术鉴定重组Cap2d蛋白形成的病毒样颗粒。SDS-PAGE结果表明PCV2d的ORF2基因在大肠杆菌中得到了高效可溶性表达;电镜下观察超声破碎后的上清中存在大量直径约17 nm的病毒样颗粒;Western blot和琼脂凝胶免疫扩散试验结果表明该可溶性蛋白可与猪PCV2阳性血清特异性结合,具有较好的免疫原性。本研究为制备PCV2d亚单位疫苗和相关检测试剂盒奠定了基础。     

抗猪瘟病毒E2蛋白单抗9A4H4的鉴定

为鉴定抗猪瘟病毒E2蛋白单克隆抗体9A4H4与不同猪瘟病毒(CSFV)株的反应性,将其与猪瘟病毒石门株、猪瘟兔化弱毒疫苗株和前期分离获得的106株猪瘟流行毒株进行IFA验证。在此基础上,利用昆虫杆状病毒系统表达的基因1型、2型和3型代表性毒株的E2蛋白进行了Western blot验证。试验还利用含有或不含β-巯基乙醇的SDS上样缓冲液对真核表达和原核表达的石门株E2蛋白进行处理,并与单抗9A4H4进行反应,初步鉴定了该单抗所识别抗原表位的类型,并利用石门株进行中和试验验证该抗体对CSFV的中和能力。间接免疫荧光试验结果表明:单抗9A4H4能与石门株、猪瘟兔化弱毒疫苗株、基因1型以及大多数的基因2.1b亚亚型、2.2、2.3基因亚型的毒株反应,与绝大多数的2.1a、2.1c、2.1g和2.1h基因亚亚型的毒株不反应,该结果与单抗和病毒E2蛋白的反应结果完全一致。Western blot结果表明:单抗9A4H4只与真核表达的非还原型石门株E2蛋白反应,与真核表达的还原型E2蛋白以及原核表达的石门E2蛋白不反应,表明该抗体识别的抗原表位为构象表位。中和试验结果表明,单抗9A4H4对CSFV...