三种对虾病毒多重实时荧光PCR检测方法的建立

根据基因库中白斑综合征病毒（WSSV）、传染性皮下及造血器官坏死病毒（IHHNV）和桃拉综合征病毒（TSV）的基因序列,设计了WSSV 、IHHNV和TSV的三对特异性引物和三条用不同荧光基团标记的TaqMan探针。对反应条件和试剂浓度进行优化,建立了能够同时检测WSSV 、IHHNV和TSV的三重实时荧光PCR方法。该方法特异性好,对WSSV 、IHHNV和TSV的检测敏感性分别达到20000、20和20000个模板拷贝数;此外抗干扰能力强,对WSSV 、IHHNV和TSV不同模板浓度进行组合,仍可有效地同时检测这三个病毒。对保存的45份经常规PCR检测仅为WSSV 、IHHNV和TSV阳性的样品进行二重实时荧光PCR检测,结果都为阳性,其中2份为WSSV和IHHNV混合感染。本研究建立的三重实时荧光PCR方法用于WSSV、IHHNV和TSV的检测具有特异、敏感、快速、定量等优点。     

多重PCR筛查检测进口转基因玉米

为获得进口转基因玉米筛查检测策略,并根据策略建立多重PCR方法,对15个进口转基因玉米分子特征进行分析。结果表明,将P-Ca MV 35S、T-NOS等2个基因组合作为检测策略可全部检出15个进口转基因玉米至少1次;将P-Ca MV 35S、P-ract1、T-NOS、bar、pat、PMI等6个基因组合作为检测策略,除MON810检出1次外,其他每个转化体可检出至少2次。同时,利用获得的筛查检测策略建立多重PCR体系,对2个基因组合的策略优化,结果表明适宜退火温度为58℃,适宜引物终浓度(μmol·L-1)配比为0.2∶0.2;对6个基因组合的策略优化,结果表明适宜退火温度为60℃,引物终浓度配比为0.2∶0.1∶0.1∶0.1∶0.1∶0.05。采用已知样品对多重PCR体系进行验证,图谱显示与转化体分子特征完全一致。该研究结果将为进口转基因玉米筛查检测提供参考。     

鲢微卫星标记的荧光多重PCR体系建立及其应用

为了提高鲢微卫星(SSR)分型效率,本研究从已开发 SSR 标记中筛选出 14 对具有高多态性和扩增稳定性的SSR 引物,并组成一个四重 PCR(A)和两个五重 PCR(B 和 C)。以单对引物 PCR 为对照,对多重 PCR 的条件进行优化,包括退火温度、Taq DNA 聚合酶浓度、dNTPs 浓度、Mg2+浓度、PCR Buffer 使用量等。优化结果为,各体系最佳退火温度时,25 μL体系中包括 2 U Taq DNA 聚合酶,0.4 mmol/LdNTPs,2.3 mmol/L Mg2+,以及 3 μL的 10×PCR Buffer。优化后的多重 PCR 扩增稳定,各对引物扩增良好,SSR分型效率显著提高。利用建立的多重 PCR 体系对采自石首老河四大家鱼原种场和监利老江河四大家鱼原种场各 100 尾鲢(Hypophthalmichthys molitrix)样本进行 SSR 分析。结果显示,石首和监利两个原种场的样本都保持有较高的遗传多样性,其中观测杂合度分别是 0.8479 和 0.9443,期望杂合度分别为0.7967 和 0.8134。群体间分子方差分析(AMOVA)FST=0.00613,说明两个原种场鲢群体间没有发生遗传分化。本研究最终建立了三个准确、稳定的荧光标记多重 PCR 体系,具有较大应用价值。运用建立好的 3 个荧光标记多重PCR 对 2 个鲢群体进行遗传多样性分析,结果为两处原种场的进一步科学管理提供了可靠依据。     

多重PCR检测耐除草剂转基因作物

为建立耐除草剂转基因作物的高通量检测方法,本试验以目前生产上广泛应用的5种除草剂抗性基因dmo、pat、CP4EPSPS、bar和aad1为靶标进行多重PCR(MPCR)研究。通过引物适用性测试、反应体系中的不同引物浓度和反应程序中的退火温度测试、灵敏度和特异性验证等,建立了能同时检测5种除草剂抗性基因的MPCR检测方法。结果表明,当dmo、pat、CP4EPSPS、bar、aad1基因的检测引物终浓度分别为0.2、0.2、0.3、0.4、0.2μmol·L^-1,退火温度为63℃时5种靶标扩增效果较好,且特异性条带清晰且均一。此外,MPCR检测方法具有较好的特异性,对每种靶标的检测灵敏度均可达到0.1%。适用性测试结果显示,MPCR检测方法可对含有5种除草剂抗性基因的多种转基因作物的单个品系或多个品系混合物进行筛选检测。无假阳性和假阴性结果表明,MPCR检测方法对实际样品具有很好的适用性。本试验结果为筛选高效耐除草剂转基因作物检测技术提供了一定的理论依据。     

一种新型对虾白斑综合症病毒和桃拉综合症病毒复合快速检测技术-二温式多重PCR的建立

摘要：本研究建立了一种二温式多重PCR技术，用于对虾白斑综合症病毒（white spot syndrome virus ,WSSV）和桃拉综合症病毒(taura syndrome virus ,TSV)的复合检测。根据对虾白斑综合症病毒和桃拉综合症病毒的基因序列分别设计了两对特异引物F1 、R1和 F1、 R2，利用该PCR能特异扩增出WSSV和TSV基因片段，结果表明：二温式多重PCR技术具有较高的特异性和敏感性，最低能检测到WSSV核酸模板10pg,TSV核酸模板100pg，且对其它一些对虾病原呈现阴性。     

2007～2012年浙江省及周边地区猪圆环病毒2型(PCV2)分子流行病学调查

为了进一步探索浙江省及周边地区猪圆环病毒2型(Porcine circovirus type 2,PCV2)的分子进化特征。本研究运用实验室已建立的PCR方法,采集2007~2012年期间浙江省及周边地区疑似PCV2感染的180份病例的肺脏、脾脏及淋巴结,并制成混合的组织样本,进行猪PCV2感染情况检测,并抽提组织细胞DNA作为模板,进行PCV2目的片段的全基因组扩增及测序,研究结果表明:浙江省及周边地区PCV2在2007~2012年阳性率分别为41.7%、52.0%、44.1%、37.0%、40.5%和33.3%,总阳性率41.4%。与以往相比,PCV2感染率基本保持一致。随机选取的45份阳性病料PCV2全基因组测序结果显示,45个毒株均属于Group1(PCV2b),很显然,浙江省及周边地区PCV2的主导基因型依然是Group1。45个毒株中属于1A分支的有11个毒株,属于1B分支的有10个毒株,属于1C分支的有22个毒株,所占比例分别是23.9%、21.7%和47.8%,同时发现随着PCV2在本地区的流行,1C分支从无到有,且在其中的比例也越来赿高,并逐步占据主导地位。对PCV2毒株Cap变异的分析能更好掌握检测区域毒株同源性情况。     

利用复合PCR方法同时检测三种转基因水稻

我国在转基因水稻研究方面处于国际领先地位,但由于研究材料扩散到商品化生产水稻中而引起的贸易纠纷时有发生。加强转基因水稻检测与监管,从源头控制转基因水稻基因扩散对于保障生物安全、促进米制品贸易有重要意义。本研究针对我国当前转基因水稻监管重点,结合已有相关检测方法标准,针对三种不同转基因水稻：抗虫水稻TT51-1、抗病水稻M12、抗除草剂水稻LLRICE62,以水稻内源基因RBE4为参照基因,建立转基因水稻四重复合PCR检测方法,可在同一反应体系中同时检测鉴定三种转基因水稻品系,检测限可达250个拷贝。利用此方法可快速地定性检测和鉴定转基因水稻TT51、M12、LL RICE62。     

转基因玉米多重PCR-基因芯片联用检测方法的研究

根据七种转基因玉米的重组DNA结构分别对Bt11、Bt176 、Mon810 、Mon863 、TC1507、 GA21 和NK603设计转化体特异性引物,进行多重PCR检测。在此基础上分别设计和筛选了七种转基因玉米转化体特异性oligo探针,制备转基因玉米的寡核苷酸芯片。实验表明,该探针特异性好,同常用的凝胶电泳检测方法相比,芯片杂交的灵敏度（0.01%）,优于凝胶电泳检测（0.1%）,由于采用了多重PCR技术一次可同时检测多个基因,提高了检测的准确率和效率。     

猪圆环病毒复合PCR检测方法的建立及初步应用

猪圆环病毒(porcine circovirus,PCV)属单股DNA的圆环病毒科.根据致病性及基因组序列,PCV可分两种血清型,即PCV-1和PCV-2.     

实时荧光PCR检测Ⅱ型猪链球菌方法的建立

建立了一种检测Ⅱ型猪链球菌(Streptococcus suis serotype 2)的实时荧光PCR(real-time fluorescence polymerase chain reaction)方法。用Primer Express2.0和Oligo6.0设计针对Ⅱ型猪链球菌荚膜抗原基因簇中cps2I基因的引物和Taqman荧光探针。通过常规PCR方法扩增得到81 bp DNA片段，克隆到pMD18-T载体，测序表明得到的序列为目的基因片段。在Lightcycler荧光PCR仪上对Ⅱ型猪链球菌的扩增曲线表明，该实时荧光PCR具有良好的特异性，可成功地扩增Ⅱ型猪链球菌，而参考猪链球菌(S.suis)、大肠杆菌(Escherichia coli )、沙门氏菌(Salmonella)、金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureu)、志贺氏菌(Shigella)、单增李斯特氏菌(Listeria monocytoge)和空白对照都是阴性；该检测方法可达到检测10个细菌的灵敏度，反应过程仅需30 min完成；在两个不同时间检测同一浓度的菌液，每次做20个重复，2次检测所得的Ct (threshold，阈循环)值之间无统计学差异(P > 0.05)，方法稳定性好。该实时荧光PCR检测Ⅱ型猪链球菌的方法可用于出入境检疫和动物防疫监督部门的疫情监测。     

用复合PCR方法检测6种转基因玉米中外源DNA的特异性

利用本实验室研制的植物DNA提取试剂盒，从玉米（Zea mays）种子中提取符合PCR检测要求的DNA。根据不同转基因玉米中重组DNA的结构，分别设计引物，可对Btl1、Event176、T25、MON810、GA21和NK603等6种转基因玉米进行特异性PCR检测。在此基础上建立了针对6种转基因玉米的特异性DNA片段和玉米内参照基因（zein）的复合PCR检测方法，能同时对7对引物进行扩增，通过产物的长度差异对不同的转基因玉米进行辨别，实现了在同一个PCR反应管中同时对6种不同转基因玉米的特异性检测。     

两轮多重反转录巢式PCR方法扩增全长GalUR基因

研究了两轮多重反转录巢式PCR扩增全长基因的方法.先用多重巢式引物和cDNA进行第1轮PCR扩增;再用纯化的第1轮PCR产物和相同的引物进行第2轮扩增;最后通过改变Mg^2＋浓度、退火时间和退火温度进行PCR条件的优化,以增加PCR扩增的产量,用于克隆.结果显示该方法方便和快速地扩增出了草莓（Fragaria ananassa cv.SweatCharlie）高产量和高质量的全长GalUR基因,也非常快速地扩增出了用于基因构建的带有酶切位点的全长GalUR基因.该方法也可以用于其它全长基因的克隆.     

甘肃甘南传统发酵牦牛乳中细菌菌群的多样性研究

为了研究甘肃甘南传统发酵牦牛乳中细菌菌群的多样性,本试验以甘肃甘南地区传统发酵牦牛乳为研究对象,基于Illumina MiSeq高通量测序技术,对13份发酵牦牛乳的16S rRNA中V3-V4区进行测序,分析甘肃甘南地区传统发酵牦牛乳中细菌菌群的多样性.结果表明,最终获得720 221条高质量16S rRNA基因序列,...     

应用PCR技术检测饲料中的鱼源性成分

PCR方法在动物源性饲料检测中有很好的应用前景。为了有效检测反刍动物饲料中的鱼源性成分，降低疯牛病传播风险，本研究根据鱼线粒体1DNA 6S rRNA序列设计并筛选了鱼源性特异引物，使用Qiagen公司的组织DNA提取试剂盒提取核酸。PCR特异性检测结果表明，引物NC_Fish2480/2501F/ NC_Fish2565/2586R与牛、羊、猪、鸡成分无交叉反应；灵敏性检测结果表明，该引物可以检测到0.1%的鱼源性成分。该方法的建立为饲料中鱼源性成分的PCR检测提供了依据。     

海产品中副溶血弧菌PCR检测方法的建立与评价

副溶血弧菌(Vibrio parahaemolyticus)是引起食源性疾病的一种重要致病菌,但是目前法定的副溶血弧菌检测方法仍采用传统培养方法,操作繁琐、耗时。本研究从Kim et al.(1999)报道的副溶血弧菌toxR基因中找出一段特异性高的序列设计PCR引物,期望建立一种特异性高、快速和灵敏的副     

应用PCR技术检测饲料中的转基因成分

成功地从成品饲料中提取DNA，并采用PCR检测技术从中检出35S启动子，NOS终止子，EPSPS耐除草剂基因和CryLA(b)抗虫基因等转基因成分，同时通过扩增玉米（Zea mays)自身zein蛋白基因及大豆（Glycine max)自身lectin基因的引物和阴阳性对照，阴阳性质控，避免产生假阳性，假阴性结果。该方法已在口岸进口饲料转基因检测中得到初步应用。