玉米乙烯应答元件结合蛋白基因启动子克隆与功能验证

为了给玉米转基因研究提供更多的非生物逆境诱导启动子,寻找只在逆境胁迫条件下适当驱动外源抗逆基因的表达,在生物信息学分析的基础上,克隆与水稻DREB1B转录因子基因同源的玉米乙烯应答元件结合蛋白基因sb CBF6的启动子psb CBF6,在非生物逆境应答元件分析和实时定量PCR验证其非生物逆境胁迫响应特性后,用以构建驱动报告基因GUS的表达载体,并使用基因枪法转化玉米愈伤组织,通过愈伤组织的GUS荧光值与荧光素酶发光值的比值,评价psb CBF6启动子在非生物逆境胁迫及激素诱导条件下的驱动活性。结果表明,sb CBF6基因在各种非生物逆境胁迫下差异表达。psb CBF6启动子长1 479 bp,存在多种与非生物逆境胁迫应答相关的调控元件,可在非生物胁迫条件下驱动外源抗逆基因在转基因植物中诱导表达。试验结果为研究抗逆转基因玉米提了供参考。     

葡萄WRKY54基因克隆及表达特性分析

为了探究葡萄WRKY54基因的功能,以抗盐葡萄品种Vidal Blanc为材料,采用同源克隆法克隆得到Vv WRKY54基因,并对其进行生物信息学和表达特性分析。结果表明,Vv WRKY54基因c DNA序列为942 bp,编码313个氨基酸。生物信息学分析结果表明,Vv WRKY54蛋白分子量约为35.3091 k Da,等电点为5.45,不稳定系数为55.03,推测其为不稳定蛋白,与已知毛果杨及拟南芥WRKY54蛋白高度同源;亚细胞定位预测结果显示其主要存在于细胞核中。实时荧光定量PCR分析表明,Vv WRKY54在葡萄不同组织中均有表达,其中在梢尖中表达量最高;盐和低温等逆境胁迫因子均能诱导Vv WRKY54上调表达;此外,Vv WRKY54受水杨酸和一氧化氮诱导上调表达,其中水杨酸诱导Vv WRKY54相对表达量在12 h达到最大值,约为对照的50倍。推测Vv WRKY54在植物发育和抵御逆境胁迫中起着重要作用,这为进一步阐明Vv WRKY54的功能及作用机制奠定了分子基础。     

小麦胁迫相关蛋白基因TaSAP12-D的耐盐性分析

胁迫相关蛋白（SAPs）是一类具有A20/AN1锌指结构域的蛋白,在植物中主要参与逆境胁迫响应。为探究小麦胁迫相关蛋白基因TaSAP12-D在耐盐胁迫中的功能,本研究以小麦品种旱选10号为试材,克隆得到TaSAP12-D基因,利用农杆菌瞬时注射烟草叶片进行亚细胞定位,利用实时荧光定量PCR(qRT-PCR)进行不同组织和盐胁迫条件下的表达模式分析,利用蘸花法将TaSAP12-D转化到拟南芥（Arabidopsis thaliana L.）中并进行耐盐性分析。结果表明,TaSAP12-D基因全长519 bp,编码172个氨基酸,预测蛋白分子量为18.41 kDa,等电点为9.21。亚细胞定位显示,TaSAP12-D在烟草细胞核和细胞质中均有表达。qRT-PCR结果显示,TaSAP12-D在小麦萌发期和幼苗期的胚芽、根和叶中均有表达,其中在幼苗期的叶中表达量最高。在盐胁迫条件下,TaSAP12-D的表达量显著上调。在150 mmol·L-1NaCl处理条件下,过表达TaSAP12-D拟南芥的存活率显著提高,表明TaSAP12-D可以增强转基因拟南芥的耐盐性。另外,在转基因拟南芥中盐胁迫相关...     

玉米HVA22基因启动子的克隆与功能验证

利用转基因技术转化利用外源抗性基因,可提高玉米对非生物逆境的抵抗能力,改良其在不良环境下的稳产性。但是,在过去的研究中,大多采用组成型启动子启动外源抗逆基因过量表达,虽然可以改良转基因株系的抗逆性,但其生长发育受到不同程度抑制,适应性代价较大。用非生物逆境诱导启动子,可培育出只在逆境胁迫下表达的转基因抗逆品种,避免正常条件下抗逆基因过量表达的不良影响。本研究以水稻HVA22蛋白质的氨基酸序列为探针,搜索玉米基因组同源mRNA序列HVA22,用PlantCARE软件分析并同源克隆其上游启动子序列,实时荧光定量PCR验证HVA22基因在非生物逆境胁迫下的差异表达,构建HVA22基因启动子HVA22s启动GUS基因的表达载体,基因枪法转化玉米愈伤组织,GUS染色检测启动活性。结果表明,玉米HVA22s启动子长度1478 bp,含有多种与非生物逆境应答相关的调控元件。HVA22基因在高温胁迫,以及脱落酸和乙烯诱导下上调表达。用HVA22s启动GUS基因转化的玉米愈伤组织,在脱落酸诱导、甘露醇模拟高渗处理、低温和高盐胁迫条件下,GUS染色均可显现靛蓝色斑点,说明HVA22s启动子确有非生物逆境启动功能,进一步验证其启动活性后可运用于玉米抗逆转基因研究。     

葡萄UBP基因家族对非生物胁迫的响应及VvUBP基因功能研究

泛素特异蛋白酶是一个广泛存在于真核生物中且高度保守的基因家族，通过去泛素化作用调节细胞蛋白的各种生理活动。为了系统探究葡萄UBP基因家族功能，本研究运用生物信息学方法对葡萄UBP基因家族成员进行鉴定与分析，利用实时荧光定量PCR(qRT-PCR)技术分析VvUBPs基因在不同非生物胁迫下的表达模式。结果表明，VvUBP基因家族包括27个成员，编码序列（CDS）长度为594～4 812 bp，编码氨基酸序列长度为197～1 603 aa。系统进化分析结果显示，UBP基因家族可分为8个亚组（GⅠ～GⅧ）。VvUBPs在茎中的表达水平相对较低，VvUBP27、VvUBP10和VvUBP23分别在卷须、花和叶中表达水平较高。外源茉莉酸甲酯（MeJA）处理可显著诱导VvUBP5、VvUBP12、VvUBP18和VvUBP27等4个基因高表达，外源水杨酸（SA）处理可显著诱导VvUBP5和VvUBP19基因高表达。VvUBP15在盐胁迫浓度0.6%时的表达量增加最明显，VvUBP6在弱光胁迫下表达显著下降以及VvUBP25在高温胁迫6 h时增幅最大。综上，VvUBP基因家族成员能够响应不同的非生物...     

提高外源基因在转基因植物中表达效率的途径

利用转基因技术获得具有目的性状的转基因植株,是进行作物品种改良的有效方式.但基因沉默等现象降低了外源基因在转基因植物中的表达效率.从外源基因的DNA修饰水平、翻译后蛋白的定位、以及转基因方式等方面综述了国内外植物基因工程中的相关研究;分析了外源基因表达效率低的原因;提出了克服基因沉默并实现外源基因高效表达的途径.     

RNA干涉及其在棉花研究中的应用

RNA干涉（RNA interference,RNAi）技术是一门新兴的基因阻断技术,可通过将外源双链RNA导入细胞介导同源靶基因mRNA序列的降解,使靶基因表达沉默,是一种转录后的基因沉默现象。目前,RNA干涉技术在植物研究中已经得到广泛应用。本文简介了植物的RNA干涉研究及RNAi表达载体的构建,综述了RNAi在棉花基因功能和功能基因组学研究、棉花品质性状的遗传改良和棉花的抗虫抗病研究中的应用进展及其在棉花研究中存在的主要问题和应用前景。     

玉米逆境胁迫响应基因ZmbZIP84的克隆与功能验证

碱性亮氨酸拉链(Basic leucine zipper,bZIP)转录因子是真核生物中分布最广泛、结构极其保守的家族之一,在植物生长进程中发挥重要作用。为验证bZIP转录因子在逆境胁迫中发挥的作用,本研究通过分析转录组数据,筛选到27个参与干旱-复水胁迫的bZIP基因,计算相关性系数、构建共表达网络图发现ZmbZIP84(Zm00001d053988)是核心节点基因;该基因位于玉米第4号染色体,具有高度保守的bZIP结构域;分析理化性质,发现该基因是亲水性蛋白且属于不稳定蛋白;构建系统发育树,发现该基因与柳枝稷和高粱的亲缘关系最近;实时荧光定量PCR(qRT-PCR)结果显示,ZmbZIP84在玉米各组织中均有表达,成熟根中的表达量最高;设置20%聚乙二醇(PEG)-6000、42℃高温、200 mmol·L^-1 NaCl以及缺乏铵态氮等模拟试验,发现该基因在高温、干旱、氮处理下表达量显著上调,而在NaCl处理下表达量下调,说明ZmbZIP84基因积极参与并响应非生物胁迫;利用CRISPR/Cas9技术获得ZmbZIP84基因的拟南芥同源基因缺失型纯合突变体,发...     

WRKY转录因子表达谱的研究进展

环境胁迫对植物的生长发育造成重大影响,因此,提高植物的抗逆性是农业面临的重要问题。自然界中存在多种抗逆基因,如抗盐基因、抗旱基因、抗寒基因等。利用植物基因工程和分子生物学技术提高植物对逆境的适应性及其抗逆分子机制的研究已成为当今热点。WRKY转录因子是一类参与多种胁迫反应的诱导型转录因子,本文综述了WRKY转录因子家族的结构特点、WRKY转录因子在非生物胁迫（高温、低温、干旱、盐）、外源物质（激素及O3）处理及生物胁迫下的表达模式。各种胁迫下的表达谱均呈现不同特点,这些差异表达可能与它们所行使的不同生物学功能有关。     

番茄NAC转录因子SlNAP2的克隆、表达及功能分析

为了探究NAC转录因子在番茄生物胁迫响应中的功能,本试验通过逆转录PCR(RT-PCR)技术从番茄中克隆得到一个NAC转录因子基因SlNAP2,其cDNA全长（ORT）1 227 bp,包含142 bp的5′非编码区和257 bp的3′非编码区以及一个长度为828 bp编码275个氨基酸的开放阅读框（ORF）,含1个NAM结构域。同源序列比对及系统进化树分析结果表明,SlNAP2与潘那利番茄SpNAP2亲缘关系最近,并与其他茄科NAC聚为一组,而与菊科、葫芦科、葡萄科、大戟科、杨柳科NAC的亲缘关系较远,在系统发育树上处于不同的分支。生物信息学分析结果显示,SlNAP2相对分子质量为31 877.23 Da,理论等电点pI为8.56,该基因编码的蛋白不存在跨膜结构。实时荧光定量PCR(qRT-PCR)结果表明,SlNAP2基因表达具有组织特异性,在番茄茎中的表达量最高,并参与了番茄对青枯菌胁迫及水杨酸和茉莉酸刺激的响应。利用病毒诱导的基因沉默（VIGS）技术发现,沉默SlNAP2后降低了植株对青枯病的抗性,表明SlNAP2在番茄抗青枯病过程中起正调控作用。本研究为深入探讨SlNAP2基...     

外源H2S对盐胁迫下红砂幼苗叶片和根系氮代谢的影响

H₂S作为新型气体信号分子在调控植物生长发育和抗逆境胁迫中发挥着重要作用。为探究外源H₂S对盐胁迫下红砂(Reaumuria soongorica)氮代谢的影响机制及最佳叶施浓度,以当年生红砂幼苗为材料,采用盆栽试验,以1/2 Hoagland浇灌为对照(CK)考察在300 mmol·L^-1NaCl胁迫(CK300)下,叶面喷施不同浓度(0、0.010、0.025、0.050、0.100、0.250、0.500、1 mmol·L^-1)H₂S供体硫氢化钠(NaHS)对红砂叶片和根系中硝酸还原酶(NR)、谷氨酰胺合成酶(GS)、谷氨酸合成酶(GOGAT)活性以及硝态氮、可溶性蛋白和游离氨基酸含量的影响。结果表明,盐胁迫下,红砂幼苗根、叶中可溶性蛋白、游离氨基酸、硝态氮含量以及NR、GOGAT、GS活性均较对照(CK)显著下降。经不同浓度外源H₂S处理后,红砂根、叶中可溶性蛋白含量与单独盐胁迫对照(CK300)相比显著降低,NR、GOGAT、GS活性和硝态氮、游...     

比利时杜鹃花花青素合成酶基因（RhANS）克隆及其功能分析

花青素合成酶（ANS）是植物花青素合成途径中的关键酶。为探究比利时杜鹃花（Rhododendron hybridum Hort.）ANS基因的功能及表达特性,本研究以比利时杜鹃花不同发育时期花瓣及盛花期的根、茎、叶为试验材料,利用反转录（RT-PCR）和RACE技术克隆RhANS基因cDNA序列;利用超高效液相色谱质谱（Waters UPLC-Qtof）技术分析比利时杜鹃花不同发育阶段花瓣中花青素含量;利用实时荧光定量PCR(qRT-PCR)分析比利时杜鹃花不同发育阶段花瓣和不同器官中ANS基因相对表达量;将RhANS基因重组到原核表达载体（pET-28a）上,并在大肠杆菌（BL21）中进行表达纯化出目的蛋白,并利用高效液相色谱（HPLC）检测目的蛋白RhANS的酶活性。结果表明,从比利时杜鹃花克隆得到RhANS基因cDNA全长序列1 350 bp,开放阅读框（ORF）序列1 074 bp,编码357个氨基酸,含有2-酮戊二酸双加氧酶家族基因结构域2OG-FeⅡ-Oxy;比利时杜鹃花花青素含量随着花的开放呈逐渐上升的变化趋势;RhANS基因表达量在比利时杜鹃花4个花期的花瓣和不同器官（...     

亚洲棉NCED3基因克隆及其抗旱功能分析

9-顺式-环氧类胡萝卜素双加氧酶(NCED)是脱落酸(ABA)合成过程中的关键限速酶,被证实广泛参与植物的生长发育进程及对非生物胁迫的应答。为了挖掘、鉴定棉花抗旱相关的NCEDs基因,本研究克隆了亚洲棉(Gossypium arboreum)GaNCED3基因,利用实时荧光定量PCR(qRT-PCR)技术分析了干旱胁迫下该基因的表达特性;并遗传转化拟南芥(Arabidopsis thaliana),研究了该基因在干旱应答中的功能。结果显示,GaNCED3基因开放阅读框(ORF)全长为1 794 bp,其编码的蛋白质包含597个氨基酸。该基因在干旱胁迫处理后上调表达,在处理3 h的根中表达量最高,是对照的27.6倍。在萌发期进行甘露醇模拟的干旱处理,超表达GaNCED3的转基因拟南芥种子萌发率和绿苗率均高于野生型。在幼苗期进行自然干旱处理后,转基因拟南芥植株叶片丙二醛含量显著低于对照(P<0.05),游离脯氨酸积累量显著高于对照(P<0.05)。本研究初步证明了外源超表达GaNCED3基因使植株抗旱能力增强,为进一步研究GaNCED3干旱应答的分子机制提供了理论依据,为抗旱育种提供了候选基因资源。     

大蒜蔗糖:蔗糖1-果糖基转移酶基因As-1-SST的克隆与表达分析

植物果聚糖是一类重要的可溶性碳水化合物,其在植物中的积累可提高植物的抗逆性。为了解大蒜蔗糖:蔗糖1-果糖基转移酶的序列特征和功能,本研究采用TA克隆方法(Original TA Cloning Kit)得到乐都紫皮大蒜As-1-SST基因全长序列,利用BLAST、DNAMAN、ProtParam、SWISS-MODEL、MEGA等生物信息工具分析其序列特征,通过荧光定量PCR(qRT-PCR)分析As-1-SST基因在大蒜根、假茎、叶片和鳞芽中的表达差异及其对低温和干旱胁迫的响应情况。结果表明,大蒜As-1-SST基因全长1 872 bp, 编码623个氨基酸,推测蛋白质分子质量为69.76 kDa,理论等电点为5.19,为不稳定亲水性蛋白;亚细胞定位预测结果显示,As-1-SST蛋白主要定位于液泡,该蛋白无信号肽,包含2个特异位点,属于糖苷水解酶32(GH32)家族。在进化关系上,大蒜As-1-SST与百合科的洋葱1-SST亲缘关系最为接近。qRT-PCR分析表明,As-1-SST基因在根中的表达量最高,其次是假茎,在鳞芽和叶片中表达水平较低,具有明显的组织特异性;不同组织As-1-SST对于低温及干旱胁迫的响应差异显著,低温胁迫显著诱导了根、假茎、叶片中As-1-SST的表达,而干旱胁迫只显著提高了鳞芽中As-1-SST的表达量,说明大蒜各组织As-1-SST对逆境信号的响应机制不同。本研究为进一步鉴定大蒜果聚糖合成酶基因的生物信息学功能和表达调控机制提供了一定的理论依据。     

毛竹PhcircRNA1的鉴定和调控通路分析

环状RNA(circRNAs)是一类经过反向剪切后,3′末端和5′末端共价结合形成的闭合环状单链非编码RNA,在环境胁迫下对植物生长发育有着重要调控作用。为探索circRNA在毛竹响应胁迫过程中的调控作用,本研究构建了circRNA-miRNA-mRNA调控通路。在分析毛竹的全转录组测序数据后,选择并鉴定了1个在紫外线胁迫（UV）和高温胁迫（42℃）下均差异表达的circRNA(PhcircRNA1),并利用生物信息学分析其调控的miRNA和靶基因。通过核糖核酸酶R(RNase R)法鉴定其转录的稳定性,并通过实时荧光定量PCR(qRT-PCR)方法分析了PhcircRNA1、靶miRNA(Ph-miR156)和靶mRNA的表达特征。本研究进一步选择GLR3.1(Glutamate Receptor–Like Gene 3.1)靶基因作为研究对象,观察毛竹水培苗根尖生长至1 cm后的circRNA-miRNA-mRNA表达调控趋势。结果表明,在UV胁迫和高温胁迫下,PhcircRNA1和靶mRNA表达量都有明显下降趋势,而miRNA表达量增高。在毛竹根尖细胞中,PhcircRNA1和G...     

不结球白菜BcLBD37基因的克隆及其对硝酸盐吸收的调节

LBD转录因子是高等植物特有的一类转录因子。为研究不结球白菜LBD基因对硝酸盐吸收的影响,以紫色不结球白菜自交系NJZX3-4为材料,采用同源克隆的方法克隆BcLBD37基因;通过构建PRI101过表达载体,异缘转化拟南芥,实现BcLBD37基因的过表达;同时借助病毒介导的基因沉默技术(VIGS),使不结球白菜中的BcLBD37基因沉默;并利用实时荧光定量PCR(qRT-PCR)分析BcLBD37基因过表达以及沉默后对硝酸盐吸收相关基因表达量的影响。结果表明,该基因片段长度为840 bp,编码279个氨基酸。与野生型相比,转基因拟南芥中硝酸盐代谢相关基因NIA1、NIA2、NRT1.1、NRT1.7、NRT2.1、NRT2.5的表达量均显著下调,硝酸还原酶活性和硝态氮含量亦显著降低。而在不结球白菜中沉默该基因后,沉默植株PTY-2/4中硝酸盐代谢相关基因的表达显著上调,硝酸还原酶活性和硝态氮含量亦显著提高。综上可知,BcLBD37基因通过抑制硝酸盐代谢相关基因的表达,调节硝酸还原酶的活性,进而抑制$\text{NO}_{3}^{-}$的吸收。本研究为提高不结球白菜营养品质提供了理论依据。     

磷对盐碱胁迫下棉花离子平衡及相关调控基因的影响

[目的]盐胁迫是影响棉花生长的主要非生物胁迫之一,合理施肥促进盐胁迫下作物对养分离子的吸收,是提高作物耐盐性的重要途径.研究施磷随盐胁迫下棉花离子组的响应特征及Na+转运相关基因表达的变化,探讨磷对棉花耐盐性机制.[方法]采用盆栽试验,设置盐胁迫(NaCl)和碱胁迫(NaHCO3+Na2CO3)2个逆境处理,每个逆境下...     

谷子GRAS转录因子家族的全基因组鉴定、表达分析及标记开发

为了鉴定谷子GRAS家族基因并揭示SiGRASs响应外源植物激素和逆境胁迫过程的表达规律,本研究采用生物信息学方法对谷子GRAS转录因子家族进行全基因组鉴定,利用实时荧光定量PCR(qRT-PCR)进行4种激素和2种胁迫处理后的表达分析,并根据SiGRAS23序列差异开发分子标记。结果表明,谷子全基因组共包含52个GRAS转录因子基因,大部分编码亲水性蛋白;82.69%的基因编码酸性蛋白,长度为362~734 aa,分子量为39.81~100.09 kDa,等电点为4.85~9.53。系统发育分析将谷子GRAS家族划分为10个亚家族。组织表达量分析表明,各亚族基因具有明显的组织表达特异性,LISCL、DELLA和SHR亚族基因分别在叶、茎和根中有较高的表达量,PAT1和HAM亚族大部分基因为组成型表达,但在叶中的表达量最高。SiGRASs启动子区含有多种植物激素、逆境响应相关的顺式作用元件;qRT-PCR结果显示,SiGRASs在不同激素和非生物胁迫下的表达水平存在较大差异,其中PAT1亚族中Seita.2G369400对6种不同的处理响应最为敏感;少数SiGRASs基因在各组织和各种激素和非生物胁迫处理下,表达量均在极低水平。DELLA亚族中的SiGRAS23在遗传群体AJF₅的双亲矮宁黄和晋谷21号间存在序列差异,据此开发的分子标记D8-1与该群体株高性状紧密连锁。本研究为解析谷子GRAS家族基因参与激素信号转导及逆境胁迫响应的功能研究奠定了基础,SiGRAS23的分子标记可用于今后谷子种质资源株高等位变异的筛选。