巴西橡胶树HbNAC33基因的克隆和表达分析

植物特有的NAC转录因子在植物的生长发育、胁迫应答和激素调节等方面具有重要功能。本研究从橡胶树胶乳cDNA中克隆了HbNAC33基因,生物信息学分析显示该基因的完整开放阅读框（ORF）为1 092 bp,编码363个氨基酸。HbNAC33蛋白的N-端第3～156位氨基酸之间含有一个典型的NAC结构域,酵母试验表明,HbNAC33具有转录激活活性,转录激活区在C-端,具备了NAC转录因子的基本特征。序列比对和系统进化分析表明HbNAC33蛋白属于NAC转录因子家族中的ANAC011亚族。实时荧光定量PCR分析表明,HbNAC33在叶中的表达量显著高于其他部位;割胶,乙烯利（ET）和茉莉酸（JA）处理均能诱导HbNAC33的表达上调。以上结果表明,HbNAC33可能参与植物的生长发育和胁迫应答过程。     

番茄中一个LSm1蛋白同源基因LeLSm1的克隆及表达分析

从番茄品种超级大明星中克隆LSm1蛋白同源基因LeLSm1。LeLSm1基因全长cDNA共有1 038个核苷酸,包含一个387个核苷酸的编码区,以及318个核苷酸的5′非编码区和333个核苷酸的3′非编码区,编码一个含128个氨基酸的蛋白质,分子质量为14.5 ku,等电点为4.94。LeLSm1编码的氨基酸序列包含LSm1蛋白的保守功能域,与截形苜蓿、拟南芥和水稻等植物的类似LSm蛋白具有高度的同源性,在氨基酸水平上的一致性依次为82.8%、82.0%和72.1%。用PCR方法克隆了LeLSm1基因,其全长转录区共4 751 bp,其中包含5个外显子和4个内含子。Southern杂交结果显示,LeLSm1是单拷贝基因。半定量RT-PCR分析表明,LeLSm1在番茄五叶期和结果期的根、茎、叶以及花和果实中均有表达,且表达量无明显差异,是一个组成型表达基因。     

青花菜转录因子基因BoNAC1的克隆与表达分析

为明确青花菜NAC转录因子基因的序列特征和表达特点,本研究以青花菜为试验材料,在克隆Bo NAC1转录因子基因的基础上,采用RT-q PCR研究该基因的表达,以明确其在核盘菌和根肿菌侵染下的表达模式。结果表明,Bo NAC1含2个内含子,长度分别为1 832 bp和670 bp,编码区全长为1 035 bp,编码344个氨基酸,含1个NAM结构域;系统发育树分析结果表明,Bo NAC1与来自芸薹属的NAC亲缘关系最近,并与其他十字花科NAC聚为一组,而与豆科、蔷薇科NAC的亲缘关系相对较远,在系统发育树上处于不同的分支。基因表达分析结果表明,Bo NAC1的表达受核盘菌的诱导,在12 h和24h时的表达量最高,分别为对照的6.28倍和7.03倍;Bo NAC1的表达还受根肿菌的诱导,15 d和20 d时的表达量最高,分别为对照的4.23倍和4.11倍,表明该基因可能参与核盘菌和根肿菌的应答反应。本试验对青花菜Bo NAC1基因的克隆与表达分析,为Bo NAC1基因的功能鉴定和生产应用奠定了理论基础。     

巴西橡胶树HbNAC1基因启动子的克隆及序列分析

NAC转录因子是植物特有的一类转录调控因子,在植物的生长发育、激素调节和境胁迫应答中具有重要的功能。为研究NAC转录因子在巴西橡胶树（Hevea brasiliensis）抗逆胁迫中的功能,本项目组根据巴西橡胶树NAC转录因子-HbNAC1基因序列,通过Genome Walking方法从巴西橡胶基因组DNA中获得了长度为1861bp的HbNAC1基因的5＇调控区片段,序列分析表明该段序列含有一个典型的真核生物核心启动子区域,转录起始位点T位于起始密码子上游52bp处。该启动子序列除了含有TATA-box、CAAT-box等基本顺式作用元件外,还具有茉莉酸响应元件以及大量光顺式作用元件和逆境胁迫诱导相关的顺式调控元件,这表明HbNAC1基因在橡胶树逆境胁迫应答过程具有重要功能,其启动子可能是一个光诱导型和组织特异性启动子。     

花生AhNAC53基因的克隆及干旱胁迫下的表达分析

为探究NAC转录因子在花生生长发育和抗逆反应中的功能,本试验在花生J11叶片中克隆得到一个NAC基因,并利用实时荧光定量PCR技术(RT-qRCR)对NAC基因表达模式进行了分析。结果表明,NAC基因全长1 752 bp,共编码583个氨基酸,分子量64.924 k Da,等电点4.42,亚细胞定位结果预测该NAC蛋白主要在细胞核中,进化树分析结果表明其与大豆GmNAC53亲缘关系较近,将其命名为AhNAC53。RT-qRCR结果表明,AhNAC53基因在花生不同组织中均有表达,其中在叶中的表达量最高;不同程度的干旱胁迫下其表达量存在显著差异,除在10%PEG6000胁迫下基因表达量相对变化较小,其他胁迫程度(5%、15%和20%PEG6000)下,随着处理时间的延长,AhNAC53基因表达量均呈现较大幅度的上调,且均在处理48 h时达到峰值,进一步表明AhNAC53基因可能参与了花生的生长发育和对干旱胁迫的响应。本试验结果为深入研究花生AhNAC53基因的功能奠定了一定的理论基础。     

一个与拟南芥RNA病毒寄主因子同源的水稻基因OsTOM3的克隆与序列分析

从水稻品种桂99中克隆了参与烟草花叶病毒的复制的拟南芥A tTOM 3的同源基因O sTOM 3。该基因全长cDNA共有1 3 0 0个核苷酸,包含一个含8 8 5个核苷酸的编码区、1 7 7个核苷酸的5′非编码区和239个核苷酸的3′非编码区,编码一个含294个氨基酸的蛋白质,分子质量为34.0 ku,等电点为9.51。O sTOM 3的氨基酸序列包含多个高疏水性区域,推测是一种8次跨膜蛋白。O sTOM 3与A tTOM 3的同源性为74.9%。用PCR的方法克隆了O sTOM 3基因的全长转录区,共3 885 bp,包含11个外显子和10个内含子。     

棉花肉桂醇脱氢酶基因GhCAD3的克隆及原核表达

肉桂醇脱氢酶(CAD)是木质素生物合成过程中的一个关键酶类。本研究从棉花中克隆了一个CAD基因,命名为GhCAD3(GenBank登录号为FJ376601)。GhCAD3全长1573 bp,具有1个1080 bp的开放阅读框,5′非编码区为35 bp,3′非编码区为458 bp,编码359个氨基酸,预测分子量约为39.116kD,等电点为7.48。氨基酸同源性分析发现,GhCAD3与其他CAD一致性为64.13%。为了进一步研究GhCAD3基因的功能,构建了该基因的原核表达载体pET-28a-CAD3,经酶切鉴定后转化到大肠杆菌BL21(DE3)中。SDS-PAGE电泳分析表明,最佳诱导表达条件为0.5 mmol/L IPTG在37℃下诱导7 h。     

花生中低温胁迫相关转录因子基因的筛选

为了研究花生低温胁迫下的基因表达调控机理,以花生花育19为材料,通过低温处理后芯片杂交实验,筛选花生叶片中低温胁迫响应转录因子基因。结果表明,175个具有转录调控活性的基因在低温胁迫的花生叶片中表达变化量达到2倍以上,其中92个为上调基因,83个为下调基因。通过基因功能分类分析发现,这些基因中53个上调基因和46个下调基因编码转录因子。进一步分析发现,参与花生低温抗性调控的转录因子主要包括MYB、WRKY、NAC及AP2/ERF等家族蛋白。此外,一些不包含已知保守结构域的转录因子也参与了花生低温抗性调控。本研究为花生低温抗性调控研究提供了新的转录因子基因资源。     

水曲柳SnRK2B基因和启动子的克隆及分析

为了研究水曲柳中同源SnRK2转录因子的功能,在水曲柳干旱响应转录组中寻得SnRK2B的同源序列并克隆得到SnRK2B转录因子基因全长,将其命名为FmSnRK2B。使用SiteFinding-PCR法扩增获得SnRK2B启动子序列,并对FmSnRK2B基因编码区及其启动子进行生物信息学分析和启动子顺式调控元件分析。结果表明,克隆得到的全长序列包含完整的开放阅读框1074bp,编码357个氨基酸。启动子顺式作用元件分析结果表明,其启动子区包含脱落酸应答元件ABRE及胁迫相关元件HSE、MBS等。干旱胁迫下,FmSnRK2B基因的表达随胁迫时间的延长先增加后降低,表明其参与植株的抗逆过程。本研究对进一步揭示水曲柳的抗逆机制具有重要意义。     

甘蔗R2R3-MYB类似基因Sc2RMyb1的克隆及表达特性分析

R2R3-MYB是MYB转录因子基因家族的主要成员,已被证明在次生代谢和非生物逆境胁迫应答中起重要作用。为获得甘蔗(Saccharum complex)R2R3-MYB转录因子基因序列信息及其在不同非生物因子胁迫下的表达情况,本研究通过对甘蔗EST数据的分析,运用电子克隆获得一个甘蔗R2R3-MYB类似基因序列,进而采用PCR方法从甘蔗中克隆了该基因的基因组DNA和cDNA序列,基因命名为Sc2RMyb1(GenBank序列号:JQ823165)。Sc2RMyb1的基因组DNA全长1807bp,由3个外显子和2个内含子构成,编码区长度为1284bp,编码427个氨基酸。构建含有Sc2RMyb1基因的原核表达载体并转入大肠杆菌(Escherichia coli),经IPTG诱导产生的重组蛋白相对分子量约为52kD。在NaCl胁迫的LB培养基上,重组菌生长明显优于对照菌。实时荧光定量PCR分析表明,甘蔗中Sc2RMyb1基因的表达受H2O2和NaCl抑制而下调,推测该基因作为负调节因子参与了NaCl胁迫应答相关基因的调控过程。本研究结果为后续该类转录因子基因在甘蔗抗逆相关机理研究和抗逆育种中的应用提供了基础资料。     

陆地棉小GTP结合蛋白基因GhROP6的克隆及表达初步分析

为探究ROP基因在棉花抵御逆境胁迫中的生物学功能,利用同源克隆的方法获得一个陆地棉GhROP6基因,通过生物信息学方法分析其理化性质、结构及进化关系,利用实时荧光定量PCR(qRTPCR)技术探究GhROP6基因的组织表达特异性及不同逆境胁迫和外源激素处理下的表达模式,构建GhROP6基因的VIGS载体并转化棉花,利用qRT-PCR技术检测其沉默效率。结果显示,GhROP6基因开放阅读框（ORF）为597 bp,编码一个含198个氨基酸的I类ROP蛋白;多重序列比对结果显示,GhROP6符合ROP蛋白结构特征,且与其他物种ROP蛋白高度同源;进化树分析结果显示GhROP6蛋白与拟南芥AtROP6蛋白同源性最高;GhROP6基因在棉花根、茎、真叶及子叶中均有表达,且在真叶中表达量最高;GhROP6基因对干旱、高盐、低温、高温等胁迫和外源脱落酸（ABA）、生长素（IAA）处理均有不同程度的响应,可能在棉花抗逆反应中扮演着重要角色。GhROP6在棉花的叶片和根部均得到有效沉默,表明已获得GhROP6基因沉默植株。本研究为进一步了解GhROP6基因的分子生物学功能奠定了基础。     

番茄PLC基因家族鉴定及抗番茄褐色皱果病毒（ToBRFV）防御反应分析

番茄褐色皱果病毒（ToBRFV）被我国列为检疫性病毒,严重威胁番茄的安全生产。为了明确番茄磷脂酶C(PLC)的种类,探究番茄PCL在植株抗ToBRFV防御反应过程中的潜在作用。本研究首先基于生物信息学鉴定了10个番茄PLC家族成员,其中特异性磷脂酶C(PI-PLC)7个,非特异性磷脂酶C(NPC)3个,7个PI-PLC蛋白均具备3个核心结构域（PLC＿X c、PLC＿Y c、C2）和1个EF＿hand-like结构域,3个NPC蛋白均只具有Phosphoesterase结构域。10个番茄PLC蛋白按照结构相似度可以划分为7个分支,分别为NPC1、NPC2、NPC6、PI-PLC2、PI-PLC3、PI-PLC4、PI-PLC6。另外,10个番茄PLC蛋白的二级结构占比类似,但三级结构存在明显差异。共线性分析结果显示,番茄PLC基因与水稻、拟南芥、雷蒙德式棉PLC基因间分别存在3、12、16对共线性关系。最后,通过转录组测序方法,检测了PLC基因家族在接种ToBRFV后的相对表达水平,结果显示,SlNPC1、SlNPC6、SlPLC4在ToBRFV接种的样本中表达水平较高,其他PLC基因...     

番茄SlJAZ11的表达分析及互作蛋白的筛选与验证

茉莉酸（JA）参与调节植物生长、发育和防御等多种重要生物过程,其中JAZ蛋白作为抑制子,在茉莉酸介导的生物和非生物胁迫响应过程中起到重要作用。为研究SlJAZ11的功能,本研究分析了水杨酸（SA）、茉莉酸等激素以及病原菌侵染处理后SlJAZ11的表达模式。结果表明,SlJAZ11能够响应水杨酸、茉莉酸及丁香假单胞菌（Pst DC3000）的诱导。通过酵母双杂交筛选番茄cDNA文库,获得了14个SlJAZ11潜在的互作蛋白。进一步采用酵母双杂交点对点验证和双分子荧光互补技术（BiFC）对候选的SlENT、SlOOLG与SlJAZ11间的互作关系进行验证,发现SlENT和SlJAZ11存在互作。对SlENT的表达模式进行分析,发现其表达被SA和Pst DC3000显著抑制,而MeJA能显著诱导其表达,表明SlJAZ11可能通过与SlENT互作来调控JA介导的番茄抗病性。本研究可为阐明SlJAZ11功能与作用机制奠定良好的分子基础。     

CRISPR/Cas9靶向敲除番茄SNAC4/9突变体的构建、鉴定及分析

NAC转录因子参与植物生长发育、果实色素积累、细胞壁形态形成和植株衰老等过程。为系统研究SNAC4(SlNAC48,基因ID:101247735)和SNAC9(SlNAC19,基因ID:101248665)在番茄成熟衰老进程中的精准功能,本试验设计SNAC4/9敲除靶点,通过重叠聚合酶链式反应（overlapping PCR）法构建单引导RNA(sgRNA)表达盒,采用金门分子克隆（golden gate）方法将单个或多个sgRNA表达盒组装至pYLCRISPR/Cas9载体。PCR和测序结果表明,SNAC4/9敲除载体构建成功,通过农杆菌转化法将编码Cas9蛋白和sgRNA的基因导入Micro-Tom番茄细胞,对阳性苗进行靶点和脱靶位点检测,结果表明番茄成功突变且未脱靶,通过鉴定T1代突变体进一步证明,CRISPR/Cas9基因编辑番茄的靶点在代际之间可以稳定遗传。与野生型相比,SNAC4/9敲除果实色素积累减少,成熟延迟,表明SNAC4/9在番茄果实成熟中发挥重要作用。本研究为进一步探究SNAC4/9调控番茄果实色素代谢和胞壁代谢机制提供了遗传材料和试验基础。     

毛竹PhcircRNA1的鉴定和调控通路分析

环状RNA(circRNAs)是一类经过反向剪切后,3′末端和5′末端共价结合形成的闭合环状单链非编码RNA,在环境胁迫下对植物生长发育有着重要调控作用。为探索circRNA在毛竹响应胁迫过程中的调控作用,本研究构建了circRNA-miRNA-mRNA调控通路。在分析毛竹的全转录组测序数据后,选择并鉴定了1个在紫外线胁迫（UV）和高温胁迫（42℃）下均差异表达的circRNA(PhcircRNA1),并利用生物信息学分析其调控的miRNA和靶基因。通过核糖核酸酶R(RNase R)法鉴定其转录的稳定性,并通过实时荧光定量PCR(qRT-PCR)方法分析了PhcircRNA1、靶miRNA(Ph-miR156)和靶mRNA的表达特征。本研究进一步选择GLR3.1(Glutamate Receptor–Like Gene 3.1)靶基因作为研究对象,观察毛竹水培苗根尖生长至1 cm后的circRNA-miRNA-mRNA表达调控趋势。结果表明,在UV胁迫和高温胁迫下,PhcircRNA1和靶mRNA表达量都有明显下降趋势,而miRNA表达量增高。在毛竹根尖细胞中,PhcircRNA1和G...     

外源5-氨基乙酰丙酸对番茄成熟过程中果实品质和矿质元素含量的影响

5-氨基乙酰丙酸(ALA)为高等植物中叶绿素等卟啉类化合物的生物合成前体,在促进作物生长、增强抗逆性及提高产量方面发挥着重要作用。为探究ALA对番茄果实成熟过程中品质和矿质元素含量的影响,本研究以原味1号品种为试验材料,向绿熟期番茄果实表面涂抹不同浓度(0、50、100、200、300 mg·L^-1)ALA溶液,筛选出促进设施栽培番茄成熟及品质形成的最佳ALA施用浓度,并进一步研究其对设施番茄果实成熟过程中硬度、可溶性固形物以及矿质元素含量的影响。结果表明,外源ALA通过降低果实硬度促进了果实的成熟,并通过提高番茄果实中可溶性固形物含量提升了果实品质。另外,在坐果后40 d,200 mg·L^-1ALA处理的K、Ca和Fe元素含量分别比对照提高了21.82%、56.25%和12.86%,但P、Mg和Cu元素含量分别比对照降低了9.92%、21.74%和25.00%。相关性分析结果表明,可溶性固形物含量与K含量呈正相关关系,与Cu含量呈负相关关系;果实硬度与K含量呈负相关关系。成熟期番茄果实中P含量与Cu含量呈正相关,与Mn、K和Ca含量呈负相关...     

外源H2S对盐胁迫下红砂幼苗叶片和根系氮代谢的影响

H₂S作为新型气体信号分子在调控植物生长发育和抗逆境胁迫中发挥着重要作用。为探究外源H₂S对盐胁迫下红砂(Reaumuria soongorica)氮代谢的影响机制及最佳叶施浓度,以当年生红砂幼苗为材料,采用盆栽试验,以1/2 Hoagland浇灌为对照(CK)考察在300 mmol·L^-1NaCl胁迫(CK300)下,叶面喷施不同浓度(0、0.010、0.025、0.050、0.100、0.250、0.500、1 mmol·L^-1)H₂S供体硫氢化钠(NaHS)对红砂叶片和根系中硝酸还原酶(NR)、谷氨酰胺合成酶(GS)、谷氨酸合成酶(GOGAT)活性以及硝态氮、可溶性蛋白和游离氨基酸含量的影响。结果表明,盐胁迫下,红砂幼苗根、叶中可溶性蛋白、游离氨基酸、硝态氮含量以及NR、GOGAT、GS活性均较对照(CK)显著下降。经不同浓度外源H₂S处理后,红砂根、叶中可溶性蛋白含量与单独盐胁迫对照(CK300)相比显著降低,NR、GOGAT、GS活性和硝态氮、游...     

小麦胁迫相关蛋白基因TaSAP12-D的耐盐性分析

胁迫相关蛋白（SAPs）是一类具有A20/AN1锌指结构域的蛋白,在植物中主要参与逆境胁迫响应。为探究小麦胁迫相关蛋白基因TaSAP12-D在耐盐胁迫中的功能,本研究以小麦品种旱选10号为试材,克隆得到TaSAP12-D基因,利用农杆菌瞬时注射烟草叶片进行亚细胞定位,利用实时荧光定量PCR(qRT-PCR)进行不同组织和盐胁迫条件下的表达模式分析,利用蘸花法将TaSAP12-D转化到拟南芥（Arabidopsis thaliana L.）中并进行耐盐性分析。结果表明,TaSAP12-D基因全长519 bp,编码172个氨基酸,预测蛋白分子量为18.41 kDa,等电点为9.21。亚细胞定位显示,TaSAP12-D在烟草细胞核和细胞质中均有表达。qRT-PCR结果显示,TaSAP12-D在小麦萌发期和幼苗期的胚芽、根和叶中均有表达,其中在幼苗期的叶中表达量最高。在盐胁迫条件下,TaSAP12-D的表达量显著上调。在150 mmol·L-1NaCl处理条件下,过表达TaSAP12-D拟南芥的存活率显著提高,表明TaSAP12-D可以增强转基因拟南芥的耐盐性。另外,在转基因拟南芥中盐胁迫相关...     

番茄SlPSY1基因转录调控因子筛选及互作验证

番茄八氢番茄红素合成酶(SlPSY1)作为类胡萝卜素生物合成途径的关键限速酶,直接影响果实中类胡萝卜素的积累。为探究SlPSY1基因的转录调控机制,通过克隆SlPSY1基因启动子序列,构建pSlPSY1pro-AbAi诱饵载体,并将诱饵载体转化至酵母细胞中获得诱饵酵母菌株。利用番茄混合组织酵母杂交cDNA文库进行酵母单杂交筛库试验,筛选得到AP2/ERF家族转录因子SlJERF1和10个未知功能蛋白。后续克隆SlJERF1基因序列,构建pGADT7-SlJERF1重组载体,通过酵母单杂交点对点对SlJERF1进行分子验证,结果显示在金担子素(AbA)浓度为150 ng·mL^-1的条件下,对照组酵母不能正常生长,而试验组酵母能正常生长,表明SlJERF1与SlPSY1基因启动子存在互作。这一结果为进一步拓展类胡萝卜素合成调控网络提供了重要的理论依据。     

亚洲棉NCED3基因克隆及其抗旱功能分析

9-顺式-环氧类胡萝卜素双加氧酶(NCED)是脱落酸(ABA)合成过程中的关键限速酶,被证实广泛参与植物的生长发育进程及对非生物胁迫的应答。为了挖掘、鉴定棉花抗旱相关的NCEDs基因,本研究克隆了亚洲棉(Gossypium arboreum)GaNCED3基因,利用实时荧光定量PCR(qRT-PCR)技术分析了干旱胁迫下该基因的表达特性;并遗传转化拟南芥(Arabidopsis thaliana),研究了该基因在干旱应答中的功能。结果显示,GaNCED3基因开放阅读框(ORF)全长为1 794 bp,其编码的蛋白质包含597个氨基酸。该基因在干旱胁迫处理后上调表达,在处理3 h的根中表达量最高,是对照的27.6倍。在萌发期进行甘露醇模拟的干旱处理,超表达GaNCED3的转基因拟南芥种子萌发率和绿苗率均高于野生型。在幼苗期进行自然干旱处理后,转基因拟南芥植株叶片丙二醛含量显著低于对照(P<0.05),游离脯氨酸积累量显著高于对照(P<0.05)。本研究初步证明了外源超表达GaNCED3基因使植株抗旱能力增强,为进一步研究GaNCED3干旱应答的分子机制提供了理论依据,为抗旱育种提供了候选基因资源。