水稻多胚基因CRISPR/Cas9基因编辑载体的构建

为构建水稻多胚基因OsPE的CRISPR/Cas9基因编辑载体,以OsU6a启动子为模板,通过两轮Overlapping PCR构建出一个sgRNA的表达盒.在T4连接酶的作用下,将sgRNA表达盒连接到酶切后的CRISPR/Cas9编辑载体中.先进行菌液PCR验证和酶切验证,后通过测序检测,获得一套多胚基因的pYLC...     

CRISPR/Cas9介导的ASGR1基因敲除猪制备

猪(Sus scrofa)内皮细胞的去唾液酸糖蛋白受体1(asialoglycoprotein receptor 1,ASGR1)是诱发异种肝移植后受体发生血小板减少症的主要诱因之一.本研究在α-1,3-半乳糖基转移酶基因(α-1,3-galactosyltransferase,GGTA1)敲除的五指山小型猪基础上,利用规律成簇间隔短回文重复(clustered regularly interspaced short palindromic repeats/Cas9,CRISPR/Cas9)结合体细胞核移植技术制备ASGR1基因敲除猪,针对猪ASGR1基因设计并构建了靶向表达载体单链导向RNAl (single guide RNA1,sgRNA1),将sgRNA1与增强绿色荧光蛋白(enhanced green fluorescent protein,EGFP)质粒共同电转染GGTA1基因敲除猪耳成纤维细胞,流式细胞仪富集筛选带绿色荧光的细胞后培养单细胞克隆.实验结果表明,PCR测序检测培养获得的41个单细胞克隆,37个克隆发生基因突变,ASGR1基因突变效率为90％,其中双等位基因敲除的细胞克隆30个,效率高达73％.选择4个ASGR1基因敲除类型不同的细胞为核供体进行核移植,将早期重构胚移植到4头受体猪,2头妊娠至终期,产仔猪6头,Western blot显示ASGR1基因敲除仔猪的肝脏中没有ASGR1的表达.对sgRNA1的13个潜在脱靶位点,分别设计引物进行PCR扩增和测序,结果显示没有脱靶现象.总之,本研究利用CRISPR/Cas9结合体细胞核移植技术快速高效地制备了GGTA1/ASGR1基因敲除五指山小型猪模型,有望解决异种肝移植后出现的血小板减少症,为临床过渡肝的应用研究提供了良好的研究材料.     

利用CRISPR/Cas9系统高效敲除斑马鱼lncRNA基因启动子区

斑马鱼(Danio rerio)长非编码RNA(long non-coding RNA,lncRNA)基因Nondret002679与人(Homo sapiens)肿瘤相关基因间长非编码RNA682基因LNC-PHOX2B-2具有同源序列.本研究以斑马鱼为模型,利用成簇规律间隔短回文重复序列/成簇规律间隔短回文重复序列关联蛋白9(clustered regularly interspaced short palindromic repeats/CRISPR-associated protein 9,CRISPR/Cas9)系统,敲除预测的Nondret002679基因启动子区以沉默Nondret0026 79基因的表达,研究IncRNA基因Nondret0026 79在斑马鱼中的调控功能.首先利用启动子区上下游序列设计靶向不同位点的向导RNA(guide RNA) gR1、gR2、gR3、gR4、gR5和gR6.人工合成gRNA转录模板,体外转录为gRNA,与Cas9 mRNA一起显微注射到斑马鱼卵中.PCR鉴定28尾2月龄斑马鱼发现,11尾发生敲除,敲除率为39％.繁殖启动子区敲除的杂合鱼,获得33尾F1代,经鉴定有6尾F1斑马鱼启动子区缺失,其中3尾缺失是在两条同源染色体上.该初步研究表明,CRISPR/Cas9系统可高效敲除lncRNA基因的启动子区,并且这种敲除可以遗传至下一代,为研究lncRNA功能提供了一个有效的基因编辑工具.     

CRISPR/Cas9介导的番茄SlMAPK6突变对植株形态的影响

促分裂原活化蛋白激酶(MAPK)级联信号参与调控植物的多种逆境、生长发育以及花青苷的合成通路。为探究SlMAPK6在番茄中的功能,本研究利用CRISPR/Cas9技术设计3个靶标位点定点编辑SlMAPK6,并获得突变体CRISPR-3和CRISPR-7。PCR和测序结果发现SlMAPK6敲除载体构建成功。通过对T₁植株进行卡那霉素基因筛选、靶位点扩增测序及行脱靶效应分析,结果发现矮番茄植株成功突变且未脱靶,与野生型对照表型相比,所有突变植株表现出根系更发达、侧枝增多的表型,表明SlMAPK6在番茄植株形态建成的过程中发挥了重要作用,为进一步探究SlMAPK6在番茄生长发育中的作用奠定了基础。     

纳米磁性颗粒介导的辣椒遗传转化体系建立

为建立一套可操作性强、广谱性强、高效的基因编辑辣椒遗传转化体系,以辣椒B2为试验材料,磁性纳米颗粒(magnetic nanoparticles, MNPs)和载体质粒pCas9-TPC按质量比1:1复合30 min后,加入混有辣椒花粉的培养基中,于MagnetoFACTOR plate24磁板下室温放置30 min,在磁场作用下导入花粉。将携带CRISPR/Cas9基因载体的花粉进行人工授粉,果实成熟后收获种子。通过载体质粒DNA上携带的抗除草剂(草铵膦)抗性标记,检测转化情况。提取T₀代植株的DNA和RNA及T₂代DNA,以pCas9-TPC为模板设计引物进行PCR扩增,检测T₀和T₂代植株中是否存在pCas9-TPC载体,对T₀代植株进行Southern杂交检测基因编辑载体与辣椒基因组的整合情况。结果显示,平均转化效率约为63.70%,PCR检测显示T₀代植株DNA和RNA及T₂代DNA均扩增出CRISPR/Cas9载体,随机选取8株阳性植株进行Southern杂交,随机出现1~3条条带。本研究表明纳米磁性颗粒介导的花粉转化法可以在辣椒上建立高效的基因编辑转化体系,为辣椒的遗传育种提供更好的工具。     

CRISPR/Cas9基因编辑技术在作物中的应用

CRISPR/Cas9是由小导向RNA介导的基因组定向编辑技术。自2005年以来,该技术得到飞速发展,在生物学、医学和作物遗传育种等多个学科得到广泛应用。与以往的大范围核酸酶、锌指核酸酶(ZFNs)及类转录激活因子效应物核酸酶(TALENs)相比,CRISPR/Cas9技术具有独特的优越性,以其简便的操作和极高的编辑效率成为目前最主要的基因编辑技术。本文系统阐述了CRISPR/Cas9技术的起源发展、基因编辑特点,总结了该技术在作物基因编辑和其他方面的应用,旨在为利用该技术进行农作物种质创新、基因挖掘和育种提供参考。     

CRISPR/Cas9定点编辑水稻LOC_Os05g31750基因位点及靶修饰位点遗传稳定性研究

为明确CRISPR/Cas9系统中Cas9蛋白的持续剪切是否会导致原已突变的靶位点在水稻代际之间传递时再次产生新的突变,本研究以水稻粳稻品种台北309为转基因受体材料,通过CRISPR/Cas9技术定点编辑了水稻基因位点LOC_Os05g31750,并获得了6株靶位点敲除成功的T_0转基因突变体植株,经三代种植收获后,进一步对携带Cas9基因的T_1和T_2群体进行靶修饰位点PCR扩增测序检测。结果表明,来源于2个T_0纯合双等位突变体T_0-8和T_0-12的所有测试后代群体的靶修饰位点序列都与对应的T_0突变体保持一致,进一步证明CRISPR/Cas9基因编辑水稻的靶修饰位点在代际之间可以稳定遗传。本研究结果为利用CRISPR/Cas9基因编辑突变体的遗传后代进行基因功能丧失后的表型分析提供了参考依据。     

CRISPR/Cas9系统在水稻分子育种中的应用

CRISPR/Cas9是目前广泛应用的基因编辑技术,其操作方便、效率高、成本低.水稻作为全球粮食安全的战略作物,优质高产的水稻培育尤为重要,CRISPR/Cas9技术为水稻分子育种带来了突破.本文回顾了基因编辑技术的发展,详细介绍了CRISPR/Cas9系统的结构、组成及原理,重点阐述了该技术在水稻分子育种中的应用,探...     

T7RNAP基因的克隆及其质体定位表达载体的构建

为在番茄成熟果实组织中建立T7/T7RNAP质体转基因特异与高效表达系统,本文克隆了原核T7RNAP基因,在添加上质体定位信号肽编码序列后,由番茄果实成熟特异表达启动子PDS和Tnos终止子控制,构成了含有PDS-ptT7RNAP-Tnos基因表达盒的植物基因双元表达载体。该研究为在番茄质体工程中控制外源质体转基因在番茄成熟果实成熟组织中定点表达奠定了基础。     

CRISPR/Cas9系统构建的水稻OsPht基因突变体材料可用于养分转运评价

【目的】CRISPR/Cas9是细菌和古细菌为免受外来DNA片段侵袭形成的一种适应性免疫系统。CRISPR/Cas9已经被作为一种基因编辑的工具广泛应用到很多动物和植物的基因编辑。磷元素是植物生长过程中必需的营养元素,植物对磷的吸收主要由跨膜磷转运蛋白完成。本研究利用CRISPR/Cas9技术对Oryza Japonica Kitaake水稻中冰叶日中花磷转运蛋白McPht基因的同源体OsPht磷转运蛋白基因进行编辑,构建了McPht转运蛋白基因导入水稻OsPht缺失的突变体,初步验证了该突变体材料的功能。【方法】通过CRISPR/Cas9基因编辑手段,将水稻中与McPht蛋白同源性最高的磷转运蛋白基因进行编辑。首先将待编辑的基因片段连接到U3启动子驱动的pCXUN表达载体上,转化到农杆菌EHA105中,然后通过农杆菌转化到水稻幼胚,将获得的转化后再生T0代株系移栽到田间获得T1代种子,并将T1代株系进行盆栽培养,提取株系叶片基因组DNA用于PCR检测,所有株系PCR产物纯化后进行测序,依据序列变化判定目标基因的编辑位点,并对突变体进行生理指标测定。【结果】1) 基因编辑后的类型可分为两类,一类为目标编辑片段20个碱基中后6个碱基缺失,另一类为目标编辑片段20个碱基中后8个碱基缺失或突变。2) 编辑位点缺失6个碱基的株系占总突变株系的28.6%,编辑位点缺失8个碱基的株系占总突变株系的42.9%,GT碱基突变株系占总突变株系的28.6%。3) 水稻突变体的株高、鲜重、根系活力均小于野生型;根系扫描结果显示水稻突变体的根长、投影面积、表面积和侧根数均大于野生型;Cas-2的叶绿素和可溶性糖含量显著高于野生型,Cas-7的叶绿素和可溶性糖含量小于野生型,但差异不显著。【结论】CRISPR/Cas9基因编辑系统成功将水稻中McPht的同源体OsPht基因进行了编辑,所获得的水稻磷转运蛋白OsPht基因碱基缺失或突变不仅为所编辑基因的功能研究提供有效的科学依据,同时为冰叶日中花McPht磷转运蛋白基因导入OsPht基因功能缺失的水稻株系、验证其生理生化功能提供宝贵的评价材料支持。本研究表明基于CRISPR/Cas9介导的基因编辑系统在功能性评价植物养分转运蛋白基因方面是一条有效的途径。     

番茄SlPSY1基因转录调控因子筛选及互作验证

番茄八氢番茄红素合成酶(SlPSY1)作为类胡萝卜素生物合成途径的关键限速酶,直接影响果实中类胡萝卜素的积累。为探究SlPSY1基因的转录调控机制,通过克隆SlPSY1基因启动子序列,构建pSlPSY1pro-AbAi诱饵载体,并将诱饵载体转化至酵母细胞中获得诱饵酵母菌株。利用番茄混合组织酵母杂交cDNA文库进行酵母单杂交筛库试验,筛选得到AP2/ERF家族转录因子SlJERF1和10个未知功能蛋白。后续克隆SlJERF1基因序列,构建pGADT7-SlJERF1重组载体,通过酵母单杂交点对点对SlJERF1进行分子验证,结果显示在金担子素(AbA)浓度为150 ng·mL^-1的条件下,对照组酵母不能正常生长,而试验组酵母能正常生长,表明SlJERF1与SlPSY1基因启动子存在互作。这一结果为进一步拓展类胡萝卜素合成调控网络提供了重要的理论依据。     

外源5-氨基乙酰丙酸对番茄成熟过程中果实品质和矿质元素含量的影响

5-氨基乙酰丙酸(ALA)为高等植物中叶绿素等卟啉类化合物的生物合成前体,在促进作物生长、增强抗逆性及提高产量方面发挥着重要作用。为探究ALA对番茄果实成熟过程中品质和矿质元素含量的影响,本研究以原味1号品种为试验材料,向绿熟期番茄果实表面涂抹不同浓度(0、50、100、200、300 mg·L^-1)ALA溶液,筛选出促进设施栽培番茄成熟及品质形成的最佳ALA施用浓度,并进一步研究其对设施番茄果实成熟过程中硬度、可溶性固形物以及矿质元素含量的影响。结果表明,外源ALA通过降低果实硬度促进了果实的成熟,并通过提高番茄果实中可溶性固形物含量提升了果实品质。另外,在坐果后40 d,200 mg·L^-1ALA处理的K、Ca和Fe元素含量分别比对照提高了21.82%、56.25%和12.86%,但P、Mg和Cu元素含量分别比对照降低了9.92%、21.74%和25.00%。相关性分析结果表明,可溶性固形物含量与K含量呈正相关关系,与Cu含量呈负相关关系;果实硬度与K含量呈负相关关系。成熟期番茄果实中P含量与Cu含量呈正相关,与Mn、K和Ca含量呈负相关...     

铜胺氧化酶基因PpCuAO4在桃成熟中的功能鉴定

为明确铜胺氧化酶(CuAO)在桃果实成熟过程中的作用,分别采用1.0、5.0和10.0 mmol·L^-1的CuAO抑制剂氨基胍(AG)对黄水蜜桃果实进行喷施处理,并于桃果实成熟后测定果实硬度。结果表明,5 mmol·L^-1 AG处理组桃果实的硬度保持效果最好。进一步采用5.0 mmol·L^-1 AG处理黄水蜜桃果实,并测定果实成熟相关生理指标。结果表明,AG处理下桃果实在采后7 d内果实硬度均显著高于对照水平,乙烯释放量和呼吸强度均显著低于对照水平,表明抑制CuAO介导的多胺分解可显著延缓桃果实成熟。AG处理显著抑制乙烯合成、生长素转运和细胞壁降解相关基因PpACO1、PpACS、PpPIN1、PpGH3.3、PpPG和PpPME1的表达水平。为进一步明确CuAO在桃成熟中的功能,利用病毒诱导的基因沉默(VIGS)技术沉默腐胺(Put)分解关键基因PpCuAO4。结果显示,转基因桃果实PpCuAO4表达水平仅为对照的18%,Put含量和果实硬度显著高于对照水平,而乙烯释放量和呼吸强度均显著低于对照水平。上述结果表明,PpCuAO4介导的Put分解可以促进桃果实成熟。本研究为进一步深入解析多胺(polyamine)调控桃果实成熟的机制提供了重要的理论依据。     

VIGS沉默番茄SlDCL2和SlDCL4破坏Ty-1/Ty-3对TYLCV的抗性

番茄黄化曲叶病毒(TYLCV)严重威胁茄科蔬菜作物的生产。抗性标记Ty-1和Ty-3是一对等位基因,在番茄抗TYLCV育种中应用较为广泛。为了探究Ty-1/Ty-3抗病毒分子机制,本研究以携带Ty-1/Ty-3抗性标记的番茄Y19为材料,利用病毒诱导基因沉默(VIGS)技术,沉默RNA干扰(RNAi)机制关键基因,即番茄核糖核酸内切酶编码基因2a/b/c/d(SlDCL2)和番茄核糖核酸内切酶编码基因4(SlDCL4),初步分析其在Ty-1/Ty-3抗TYLCV中的功能。PCR与测序结果发现SlDCL2、SlDCL4的VIGS沉默载体pTRV2∶SlDCL2和pTRV2∶SlDCL4构建成功。以沉默番茄八氢番茄红素脱氢酶(SlPDS)基因为标记植株,定量PCR检测SlDCL2、SlDCL4沉默株系中SlDCL2、SlDCL4基因的沉默效率,结果显示SlDCL2、SlDCL4沉默株系中对应基因的表达均小于对照植株的50%,表明SlDCL2、SlDCL4沉默载体确实可以降低对应基因的表达,且不影响其他DCL基因的表达。VIGS沉默植株SlDCL2、SlDCL4基因后接种TYLCV,接种TYLCV 30dpi结果显示,Y9材料表现出明显的TYLCV病毒症状,通过比较植株发病严重度发现,SlDCL2、SlDCL4沉默株系发病严重度分别为1.97、2.35,显著高于空载体注射株系(0.14)和对照株系(0.07)。本研究结果表明RNAi通路关键基因SlDCL2、SlDCL4在Ty-1/Ty-3抗TYLCV中发挥着重要作用,这为利用Ty-1/3抗性标记基因育种奠定了基础。     

番茄PLC基因家族鉴定及抗番茄褐色皱果病毒（ToBRFV）防御反应分析

番茄褐色皱果病毒（ToBRFV）被我国列为检疫性病毒,严重威胁番茄的安全生产。为了明确番茄磷脂酶C(PLC)的种类,探究番茄PCL在植株抗ToBRFV防御反应过程中的潜在作用。本研究首先基于生物信息学鉴定了10个番茄PLC家族成员,其中特异性磷脂酶C(PI-PLC)7个,非特异性磷脂酶C(NPC)3个,7个PI-PLC蛋白均具备3个核心结构域（PLC＿X c、PLC＿Y c、C2）和1个EF＿hand-like结构域,3个NPC蛋白均只具有Phosphoesterase结构域。10个番茄PLC蛋白按照结构相似度可以划分为7个分支,分别为NPC1、NPC2、NPC6、PI-PLC2、PI-PLC3、PI-PLC4、PI-PLC6。另外,10个番茄PLC蛋白的二级结构占比类似,但三级结构存在明显差异。共线性分析结果显示,番茄PLC基因与水稻、拟南芥、雷蒙德式棉PLC基因间分别存在3、12、16对共线性关系。最后,通过转录组测序方法,检测了PLC基因家族在接种ToBRFV后的相对表达水平,结果显示,SlNPC1、SlNPC6、SlPLC4在ToBRFV接种的样本中表达水平较高,其他PLC基因...     

东北三省和浙江木耳稳定同位素特征与产地溯源

为探究稳定同位素在黑木耳产地溯源中的可行性,本研究从东北(黑龙江、吉林、辽宁)、浙江产地采集74份代表性黑木耳样品,从新疆采集11份代表性黑木耳样品作为外部验证,采用元素分析-稳定同位素比率质谱仪测定δ¹³C、δ¹⁵N、δ²H、δ¹⁸O值,结合化学计量学方法进行产地溯源判定。结果表明,东北黑木耳δ¹³C、δ¹⁵N、δ²H、δ¹⁸O值分别为-24.5‰～-22.7‰、-0.9‰～3.1‰、-62.2‰～-34.6‰、15.9‰～19.4‰;浙江黑木耳δ¹³C、δ¹⁵N、δ²H、δ¹⁸O值分别为-26.2‰～-24.5‰、-0.9‰～1.2‰、-24.9‰～-9.0‰、19.9‰～22.2‰,两产地黑木耳δ¹⁵N值差异不显著(P>0.05),δ¹³C、δ²H和...     

β-谷甾醇在辣椒疫霉菌生长发育中的作用研究

辣椒疫霉菌是一种缺乏甾醇合成必要基因的疫霉属重要植物病原卵菌,其可利用植物中富含的β-谷甾醇等甾醇类物质完成生活史。为了明确β-谷甾醇在辣椒疫霉菌不同生长发育阶段中的作用,本研究设置系列浓度梯度(0.2、1.0、5.0、25.0、125.0μg·mL^-1),测定了其对辣椒疫霉菌孢子囊和卵孢子形成的影响,观测了β-谷甾醇处理后菌丝的生长及形态结构,探究了其对辣椒疫霉菌细胞膜透性的影响。结果表明,β-谷甾醇对辣椒疫霉菌生长发育具有重要作用,表现为低浓度促进生长发育,高浓度抑制生长发育。具体表现为：当β-谷甾醇浓度为0.2μg·mL^-1时,其对辣椒疫霉菌菌丝生长、孢子囊和卵孢子形成具有促进作用;当β-谷甾醇浓度高于5.0μg·mL^-1时,其对菌丝生长及孢子囊和卵孢子形成表现出抑制作用;且随着β-谷甾醇浓度的升高,其抑制作用随之增强。在β-谷甾醇对辣椒疫霉菌菌丝生长抑制有效中浓度(EC₅₀=10.0μg·mL^-1)下,其对菌丝有明显的致畸作用,细胞膜通透性增大,对菌丝生长、孢子囊和卵孢...     

番茄秸秆堆肥提高番茄果实风味的适宜添加比例研究

【目的】我国蔬菜生产面积大,食用部分收获后的蔬菜废弃物剩余量大,需要妥善处理。本文以番茄秸秆废弃物为原料进行堆肥,研究了其与菜园土混合作为基质用于番茄生产后,对番茄果实挥发性物质含量的影响,为番茄秸秆堆肥的科学应用提供依据。【方法】选用陕西地区的主栽番茄品种‘金棚1号’为试验材料,以常规基质 (氮磷钾总养分含量 ≥ 2%,有机质 ≥ 30%) 栽培为对照 (CK) 进行了盆栽试验,设置6个番茄秸秆堆肥与菜园土混配质量占比为0% (T1)、5% (T2)、7.5% (T3)、10% (T4)、12.5% (T5)、15% (T6)。在果实成熟期取样,利用顶空固相微萃取?气相色谱?质谱联用技术 (SPME-GC-MS) 测定番茄果实挥发性物质成分和含量。【结果】7个试验处理的番茄果实共检测出73种挥发性物质,包括9种酮类、25种醛类、19种醇类、5种酯类和4种烃类与11种其他未分类成分,施用堆肥的各处理挥发性物质种类与常规栽培相比差异较大,主要体现在醛类与醇类物质种类上;不同应用配比的堆肥产物对番茄果实挥发性物质含量影响不同,其总含量由高到低依次为T6 > T5 > CK > T4 > T2 > T3 > T1,整体随堆肥产物施用量的增高而增高,其中T5与T6处理的挥发性物质总含量分别较常规栽培番茄提高了81.0%与137%。被检测出的挥发性物质中包含11种番茄特征效应化合物,影响青香、果香与花香这3种类型的香气成分的总含量与挥发性物质总含量高低顺序一致,且T5与T6处理的番茄特征效应化合物总含量分别较常规栽培番茄提高了24.8%与72.2%;T5处理的番茄产量高于T6处理,且与对照无显著性差异。【结论】番茄秸秆经过堆腐处理后作为有机肥料用于番茄生产,不仅可实现番茄秸秆废弃物资源再利用,还可以有效改善番茄的风味品质,使果实香气丰富,果味浓郁。在本试验条件下,将12.5%的番茄秸秆堆肥产物与园土混配 (质量比) 时,番茄果实挥发性物质成分含量显著高于栽培基质对照,且产量与对照无显著差异,是较适宜的掺混比例。