西兰花毛状根悬浮培养体系建立

为建立西兰花毛状根高增殖能力悬浮培养体系,实验对通过发根农杆菌ATCC15834浸染西兰花叶片获得的毛状根进行PCR检测,高增殖液体悬浮培养体系条件的优化,毛状根生长动态与萝卜硫素合成动力学研究。实验结果表明,诱导出的毛状根整合了发根农杆菌ATCC15834的rol B基因。毛状根液体悬浮培养的最佳条件为:接种量为1mg/mL、转速为110r/min、培养基体积100mL、培养温度为25℃,增殖倍数达26.47倍。毛状根悬浮培养生长分为迟滞期、分化期、增殖期、静止期、衰亡期五个时期,萝卜硫素的合成于培养的静止期,并向培养基中少量释放,且最佳收获时间为接种后的第21天。这一研究结果可为次生代谢产物萝卜硫素的生产提供一定的理论基础。     

发根农杆菌转化银杏等药用植物研究进展

利用发根农杆菌转化药用植物,并对毛状根进行离体培养,大量提取重要成分,是药用资源植物可持续发展的有效途径之一。讨论了发根农杆菌影响发根诱导的因素即转化组合的研究、转化条件的研究及影响发根生长量和有效物质含量的研究进展,并对其发展前景和今后的研究方向及重点进行了展望     

罗汉果遗传转化受体再生体系的建立及发根农杆菌转化初探

以罗汉果品种“青皮果”试管苗的茎段和叶片为外植体,研究适合于遗传转化的受体再生系统,并进行了发根农杆菌转化的初步研究。试验结果表明茎段的再生能力强于叶片,且对农杆菌敏感,是进行遗传转化合适的受体材料。在MS基本培养基附加BA 1mg/L、KT 1mg./L、NAA 0.2mg./L、蔗糖30 mg/L培养基中,20d龄的茎段不定芽诱导率为100%,平均每个外植体诱导的不定芽数达到9.7个,移苗成活率90%以上;外植体培养前的割伤处理有利于提高出芽数;发根农杆菌转化茎段诱导出毛状根。罗汉果毛状根的诱导和培养将为罗汉果药用成分的研究和开发提供新的途径。     

谷子毛状根诱导方法的建立与优化

为建立一种快速鉴定谷子基因功能的技术体系,本研究通过比较谷子外植体、品种、乙酰丁香酮、菌液浓度和共培养时间对发根农杆菌K599介导的毛状根诱导效率的影响,发现发根农杆菌浓度在OD600为0.5、以谷子芽尖为外植体、在含有100μmol L–1乙酰丁香酮的毛状根诱导培养基上共培养3 d时,可使毛状根诱导率高达80.24%。将GFP基因进行毛状根遗传转化,通过GFP基因的PCR扩增和GFP荧光观察结果分析,发现谷子毛状根的转基因效率大于70%。利用该体系对谷子SiDVL1和SiDVL3的亚细胞定位和SiNHX2、SiCBL4和SiCBL7基因功能进行了分析和鉴定。结果表明SiDVL1和SiDVL3在谷子毛状根中的亚细胞定位与在烟草叶片中的一致;SiNHX2、SiCBL4和SiCBL7转基因谷子的存活率显著高于空载体转化谷子。说明本研究建立了一种高效快速鉴定谷子基因定位和功能的方法。     

二倍体马铃薯基因编辑载体快速验证体系的建立

基于马铃薯熟性基因StCDF1的序列,构建了含有绿色荧光蛋白CRISPR/Cas9-StCDF1载体,并建立了农杆菌介导二倍体马铃薯遗传转化快速验证基因编辑载体的实验体系。结果表明,在发根农杆菌介导的遗传转化过程中,在生根培养基中添加2mg·L^-1的抗生素特美汀,能有效抑制发根农杆菌且不影响发状根的生长。利用荧光检测可实现对转化再生的阳性发状根进行快速筛选。结合对阳性根中拟编辑靶标序列的测序分析,发现所筛选出的阳性发状根中出现多种缺失类型,证明所构建的基因编辑载体和荧光筛选方法的可靠性。进一步利用根癌农杆菌介导转化马铃薯茎段,通过稳定的遗传转化最终获得1株StCDF1缺失5bp的杂合突变体。本研究在二倍体马铃薯中建立了快速验证基因编辑载体的方法,并获得了1株基因编辑植株,为后续研究StCDF1基因的调控网络提供了材料。     

发根农杆菌诱导毛状根合成次生代谢物的研究及应用

在大健康背景下植物的药用价值日益突出,但植物自身产生的具有药用价值的次生代谢物有效成分产量低,因此根据发根农杆菌(Agrobacterium rhizogenes)的遗传转化机制和毛状根遗传稳定等特点提高次生代谢物产量是有效手段。本研究从毛状根诱导的影响因素和植物毛状根合成次生代谢物研究进展两个方面展开论述,对毛状根诱导中需注意的问题,以及基于毛状根体系的植物次生代谢物合成的研究现状和存在的问题进行述评,旨在为发根农杆菌诱导毛状根可以高效合成目标次生代谢物提供参考。     

四倍体菘蓝毛状根的诱导及其植株再生

利用发根农杆菌A4和R1000感染四倍体菘蓝子叶,毛状根诱导频率和得根率分别达72.5%和27%以上.A4诱导四倍体菘蓝毛状根优于R1000,光照对毛状根的诱导起着重要作用,外源激素IAA能明显地促进毛状根的诱导作用.rolB、rolC基因的PCR分析表明,Ri质粒中的T-DNA片段已整合到毛状根细胞基因组中.毛状根能在不含激素的MS固体培养基上分化出不定芽,6-BA能促进毛状根不定芽的诱导;NAA促进不定芽生根,再生完整植株.     

乌拉尔甘草离体根尖培养方法的建立

建立甘草的离体根尖培养体系有助于研究甘草的根系营养、形态建成以及某些次生代谢产物的合成、代谢等。为建立乌拉尔甘草的离体根尖培养体系,对影响乌拉尔甘草离体根尖生长的培养基、激素以及维生素等因素进行了研究,并对其中的药用有效成分进行分析。结果表明：在培养基中附加0．10mg／L的IBA,可诱导乌拉尔甘草离体根尖伸长并产生较多的侧根;B,大量元素＋B5微量元素和1/3MS大量元素＋1／3MS微量元素适宜乌拉尔甘草离体根系的生长。表现为主根和侧根发达而均匀,具有较强的生长活力;培养基中附加0．50mg/L的VB1可显著促进乌拉尔甘草离体根系鲜重的增加;液体悬浮培养适于乌拉尔甘草离体根尖的培养。在悬浮培养条件下甘草离体根中甘草总黄酮物质的含量为0．75％,但没有检测到甘草酸的产生。     

发根农杆菌介导的向日葵遗传转化

本研究首次报道了发根农杆菌介导的向日葵遗传转化和毛状根形成的优化条件。由发根农杆菌诱导向日葵子叶和下胚轴形成的根在含卡那霉素（200 mg/L，kanamycin）的选择培养基(1/2 MS)上选择，12 d后存活的根转到无激素培养基上能快速生长，经分子检测证实其为毛状根。同时着重研究了不同诱导条件对向日葵毛状根形成的影响。结果发现适用于毛状根形成的最优条件为菌株R1205，菌液浓度（OD₆₀₀）1.0，15 min感染，共培养3 d，培养基pH 6.5，30 μmol/L乙酰丁香酮（acetosyingone）。在此条件下，子叶和下胚轴的毛状根形成率分别达到23.7％和81.6％。     

中国甘草的组织培养研究进展

概述了国内在甘草植株再生、快速繁殖和毛状根培养方面的研究进展情况。甘草组织培养的基本培养基为MS,诱导培养基主要附加激素为2,4-D、6-BA和NAA,其中6-BA(0.2￣1.0mg/L)必不可少;分化培养基以MS无机元素和B5的有机成分为基本培养基,并附加ZT、BA、KT,三者可单独使用或配合NAA使用;生根培养基主要是添加NAA(0.05￣0.01mg/L)。能分化成苗的外植体仅有下胚轴,而且分化率极低,仅为3%￣6%。快速繁殖方法有腋芽丛状茎生根成苗和带叶茎段直接生根成苗两种,其中带2叶茎段成苗繁殖系数最高,达到98%。发根农杆菌ATCC15834感染甘草下胚轴诱导产生毛状根效果最好,诱导率高达30%。毛状根的最佳培养条件是:50mg/LKNO3,100mg/LCaCl2·2H2O,0￣225mg/LKH2PO4,640mg/LMgSO4·7H2O,微量元素及有机物质采用B5水平,32.5g/L蔗糖,转速100r/min,pH6.2左右,通过毛状根的培养可获得原植物中含有的或者不含有的化合物。     

种皮颜色对乌拉尔甘草种子质量的影响

乌拉尔甘草种子中存在着颜色的差异,可以分为绿籽与黑籽。为了确定不同颜色甘草种子的使用价值,为乌拉尔甘草的清选分级及选购提供参考,比较了绿籽与黑籽的千粒重、种子直径、电导率、发芽率、硬实率、活力指数、ATP、TTC及种子带菌情况的差异,结果表明,绿籽的硬实率、发芽率、活力指数、ATP活力、TTC活力等均显著高于黑籽,内外部带菌种子比率、电导率则显著低于黑籽,说明绿籽质量要明显高于黑籽。     

盐胁迫对甘草种子发芽与子叶抗氧化指标的影响

研究了不同naCl浓度对甘草种子发芽与子叶抗性的影响.结果表明,当NaCl浓度低于100mmol/L时,甘草种子的发芽正常;在NaCl浓度达到200 mmol/L时,种子发芽受到显著抑制.子叶内活性氧、SOD、POD、可溶性蛋白和膜透性都随NaCl浓度的升高而增加,甘草的抗逆性可能与上述酶活性的变化有关.     

三种中药提取物对桃褐腐菌（Monilinia fructicola）的抑菌作用

为筛选出对桃褐腐病菌具有抑制作用的中草药抑菌活性物质,采用三次浸渍提取法对中草药进行提取,通过菌丝生长速率法、单位面积产孢量计算法和凹玻片悬低法进行抑菌活性测定,再经过光学显微镜观察抑菌活性物质对桃褐腐菌的形态、结构的破坏作用,得出结果：黄芩、甘草和威灵仙的4种溶剂提取物对桃褐腐病菌（M. fructicola）均有不同程度的抑制作用,其中黄芩丙酮提取物和黄芩80％乙醇提取物的抑制作用较强,抑菌率达到80％以上,对菌丝细胞有明显的破坏作用,且能够抑制分生孢子的产生与萌发;同时对供试的16种植物病原真菌也有不同程度的抑制效果,抑菌谱较广。说明黄芩丙酮和黄芩80%的乙醇提取液中均含有抗菌成分。     

盐胁迫对甘草幼苗生长及其生理指标的影响

研究了不同盐浓度(0,50,100,200 mmol/L)条件下甘草幼苗生长和生理生化各项指标,结果表明,随着盐浓度的升高,甘草幼苗根长变化最小,株高、鲜重和干重呈下降趋势,但低盐浓度(50,100 mmol/L)之间差异不明显;叶绿素含量和叶绿素荧光参数Fv/Fm在低盐浓度下显著上升,在高盐浓度(200 mmol/L)下显著下降;电导率和MDA、可溶性糖、脯氨酸含量以及POD和CAT都随盐浓度升高而上升,而SOD和ASP在低盐浓度下上升,在高盐浓度下下降。甘草幼苗的耐盐上限为100~200 mmol/L。     

甘草离体培养物中总黄酮提取工艺的优化

【研究目的】对甘草离体培养物中总黄酮提取和测定工艺进行优化,以建立在室内筛选高产细胞系和试管苗株系的方法;【方法】采用超声波提取技术,对提取液、浸泡时间、提取温度等进行优化;【结果】将样品以75%甲醇浸泡6h后在32℃下超声提取两次,比色法测定总黄酮含量,加样回收率为95.3%～101.4%,相对标准偏差为1.61%。测得甘草初代愈伤组织中总黄酮含量为0.0012%～0.05%,子叶愈伤组织调控后含量高达0.08%,试管苗中总黄酮含量为1.04%～1.31%,移栽后高达4.5%。【结论】此工艺准确度较高、稳定性好、简便可行,为优良细胞系的筛选和试管苗的早期鉴定奠定了技术基础。     

Induction of Shikonin production in hairy root cultures of <Emphasis Type="Italic">Arnebia hispidissima</Emphasis> via <Emphasis Type="Italic">Agrobacterium rhizogenes</Emphasis>-mediated genetic transformation

Data presented herein provides a rapid and efficient method for Agrobacterium rhizogenes-mediated genetic transformation of Arnebia hispidissima for hairy root cultures as well as for enhancing Shikonin production. Etiolated explants viz. shoot tip, nodal, leaf and internodal segments were co-cultivated with Agrobacterium rhizogenes for induction of hairy root. Among the various explants employed, leaf explant showed maximum 70.7% response followed by shoot tip 48.3%, nodal segment 38.7% and internodal segment 9.3%. Integration of Ri plasmid rolB gene in the transformed hairy root cultures was confirmed by PCR analysis using forward (FrolB) and reverse (RrolB) primers of rolB gene resulting in the amplification of 0 ∼ 0.8 kb fragments. Medium compositions have been optimized for in vitro induction of Shikonin in hairy root cultures of Arnebia hispidissima. Hairy roots on hormonefree MS medium showed red spots in the older part of the tissues which turned white after a second subculture. Whereas hairy roots cultured on RC medium showed faster growth and produced large amount of Shikonin. The Shikonin content in transformed hairy root culture was estimated by recording absorbance at 620 nm and quantified against authentic sample of Shikonin. Shikonin content was estimated to be 0.85 mg g⁻¹ fresh weight of tissue at the end of the 50 days of culture. The results presented herein will help to design strategies for bridging the gap between ever increasing demand and supply of raw products necessary for obtaining Shikonin for cosmetic, dyeing, food, medicinal, and pharmaceutical industries.     

甘草不同时期愈伤组织细胞形态与线粒体变化的研究

此实验为甘草愈伤组织继代培养和进一步研究提供方法依据。以乌拉尔甘草不同来源愈伤组织为材料,采用石蜡切片法观察了不同时期甘草愈伤组织细胞大小变化;采用悬滴法观察了不同时期甘草愈伤组织线粒体形态、大小变化。试验结果表明：愈伤组织细胞大小受外植体来源影响显著（P<0.05）,芽来源愈伤组织细胞大小（均值31.40 μm）大于叶来源愈伤组织细胞大小（均值29.41 μm）且大于根来源愈伤组织细胞大小（均值25.67 μm）;愈伤组织细胞大小受培养时期影响极显著（P<0.01）,培养到30天时细胞达最大,均值为37.45 μm,之后到40天时,细胞平均减小到29.55 μm。芽和叶来源愈伤组织细胞内的哑铃状线粒体数目高于根来源愈伤组织细胞内的哑铃状线粒体数目。愈伤组织细胞线粒体大小与外植体来源及培养时期有显著交互作用（P<0.05）,根来源愈伤组织在培养30天时线粒体长度均值最大,达2.60 μm。芽来源愈伤组织在培养40天时线粒体长度均值最大,达2.07 μm。叶来源愈伤组织在细胞培养40天时线粒体长度均值最大,达2.01 μm;培养时期对愈伤组织细胞线粒体大小影响极显著（P<0.01）,培养到30天时细胞最大,均值为2.06 μm。此研究结果,为甘草愈伤组织继代培养奠定了基础,同时为甘草脱分化及再分化调控提供细胞学方面的依据。