山苍子AFLP反应体系的建立及其引物筛选

通过对山苍子幼嫩叶片、顶芽、花蕾3种组织的DNA提取效果分析和对影响酶切及选择性扩增效果的4个主要因素(酶切时间、Mg²⁺浓度、dNTPs浓度、引物浓度)的比较研究,建立了适合于山苍子AFLP分析的技术体系。结果表明,山苍子的顶芽是较好的DNA提取材料;山苍子基因组DNA经5 U EcoR I和5 U Mse I酶切1 h即可完全酶切;最佳的选择性扩增体系为20 μL反应体系中含有1.0 U rTaq聚合酶、2.0 μL 10×PCR缓冲液、1.8 μL 25 mmol·L^-1MgCl₂、1.4 μL 2.5 mmol·L^-1dNTP、100 ng·μL^-1引物各1.0 μL。使用该反应体系获得了清晰、稳定的DNA指纹图谱,并筛选出10对多态性较好的AFLP引物组合,为利用AFLP标记技术进一步开展山苍子种群遗传结构、遗传分化等研究奠定了基础。     

毛红椿AFLP体系优化及引物筛选

以江西九连山国家级自然保护区毛红椿天然林为研究材料,对毛红椿AFLP反应体系中的DNA提取方法、酶切与连接步骤、连接产物稀释倍数、预扩增产物稀释倍数等影响因子进行优化,并筛选AFLP多态性高的引物。结果表明：不同提取方法对DNA质量有很大影响,试剂盒法提取的DNA杂质少,质量高;酶切与连接采用一步法完成;连接产物最适稀释倍数为3倍,预扩增产物最适稀释为10倍;利用4个天然居群的毛红椿基因组DNA从64对引物组合中筛选出4对具有多态性扩增条带的引物,总扩增出147个位点,其中多态性位点122个,平均多态位点百分率84.36%,多态性较高,适用于毛红椿AFLP分析的4对引物组合分别是：E1/M6、E4/M7、E5/M3、E5/M8,为毛红椿遗传多样性和种质资源研究奠定了基础。     

八角RAPD-PCR反应体系的建立及引物筛选研究

在提取高质量八角基因组DNA的基础上,通过对其RAPD反应体系的Taq DNA聚合酶、dNTPs浓度、Ｍg2+浓度、引物浓度等因子的优化,建立了稳定、重复性高的八角RAPD-PCR反应体系.研究结果表明,在25 μL PCR反应体系中,含1.0 UTaq DNA聚合酶,0.15 mmol·L-1 dNTPs,2.0mmol·L-1 Mg2+,2.0 μmol·L-1引物,20～ 80 ng模板.最佳反应程序为,94℃预变性5 min,扩增后94℃变性30 s,31 ～37℃退火30 s,72℃延伸30 s,35个循环;72℃完全延伸7 min,4℃保存.在建立RAPD-PCR反应体系的基础上,从240条RAPD引物中筛选出15条扩增条带清晰、稳定性好的引物,并通过各引物的退火温度梯度实验,确定了各引物的最适退火温度.     

润楠ISSR-PCR优化反应体系建立及引物筛选

以润楠基因组总DNA为材料,利用单因素试验设计方法,对影响ISSR-PCR扩增的模板DNA、Mg2+、dNTPs、引物、Tag DNA聚合酶以及去离子甲酰胺等试验因子进行了优化试验,筛选出16条有效引物并确定了它们的退火温度,并检测了体系的重复性。优化后的反应体系为:20μL PCR反应体积中,10×PCR Buffer 2μL,2.0mmol/L Mg2+1.6μL,0.2 mmol/L dNTPs 2μL,0.4 mmol/L引物0.8μL,0.5U Taq DNA聚合酶0.1μL,40 ng DNA模板1.0μL,1.5%去离子甲酰胺0.3μL,ddH2O 12.2μL。扩增程序为:94℃预变性5 min,94℃变性30 s,据不同引物的退火温度复性45 s,72℃延伸90 s,反应37个循环,最后在72℃延伸7 min。润楠ISSR-PCR反应体系的建立为利用ISSR分子标记技术研究润楠的遗传多样性奠定了良好的基础。     

红椿SSR-PCR体系建立和多态性引物筛选

[目的]本研究旨在建立红椿SSR-PCR最佳反应体系,并筛选适于红椿SSR分析的高多态性引物。[方法]通过L16(45)正交试验设计,确立红椿SSR-PCR最佳反应体系;利用优化后的体系对来自楝科植物的135对SSR引物,在6个不同的红椿居群中进行扩增,筛出能有效扩增的引物并进一步筛选出适于红椿的高多态性引物。[结果](1)10μL基于荧光d UTP的SSR-PCR体系中包含:10×buffer 1.0μL,Taq酶(5 U·μL-1)0.1μL,Mg Cl2(25mmol·L-1)0.8μL,d NTP(200 mmol·L-1)0.025μL,荧光d UTP(1 nmol·μL-1)0.01μL,引物(10 mmol·L-1)0.8μL,DNA模板45 ng剩余用dd H2O补足;(2)筛选出29对能有效扩增的引物,复选后获得了12对适于红椿SSR分析的高多态性引物。[结论]建立了SSR-PCR最佳反应体系并筛选出高多态性引物,为红椿的分子标记等遗传学研究提供了基础。     

苦楝SSR-PCR反应体系优化及引物筛选

[目的]借鉴以往楝属文献报道的SSR引物,筛选高度多态性、稳定性高、重复性好的苦楝SSR引物,为苦楝遗传图谱构建、QTL定位和分子标记辅助选择育种等研究领域应用奠定基础.[方法]本研究采用单因素法和正交试验设计进行SSR-PCR反应体系优化,并利用该体系以8个不同种源的苦楝基因组DNA为模板,从135对候选SSR引物中进行引物筛选.[结果]苦楝SSR-PCR最优反应体系为:1.0 μL 50 ng·μL^-1模板DNA,1.2 μL 100 μmol·L^-1引物,1.0 μL 10 mmol·L^-1 dNTPs,0.8 μL 25 mmol·L^-1 Mg²⁺,0.15 μL 5 U·μL^-1 Taq酶,1.5 μL 10×Buffer,补ddH₂O至15 μL;最终筛选出15对具有高度多态性、稳定性高、重复性好的SSR引物.[结论]本研究成功优化了苦楝SSR-PCR反应体系,并成功筛选出15对适用于苦楝的SSR引物.     

火炬松SSR-PCR反应体系的建立及引物筛选

以火炬松(Pinus teada)幼嫩针叶为材料,采用单因素试验设计分析各组分对SSR-PCR扩增结果的影响,并进一步应用正交试验设计,从DNA模板、引物、d NTPs、Mg2+和Taq酶5个因素3个水平对SSR扩增效果进行研究,确定火炬松SSR-PCR的最佳反应体系。结果表明:各因素不同水平浓度对SSR-PCR反应结果均有影响,火炬松SSR-PCR优化后的反应体系为:DNA模板80 ng、引物0.3μmol/L、dNTPs 0.20 mmol/L、Mg~(2+)2.0 mmol/L、Taq酶1.00 U、1×PCR Buffer,总体积25μL。运用该体系从60对引物中筛选出扩增条带清晰、多态性丰富的SSR引物8对,并用不同火炬松家系进行了检验,证明该体系稳定可靠。     

乌桕SRAP-PCR体系优化与引物筛选

乌桕是我国重要木本油料树种,目前有关乌桕SRAP-PCR相关研究罕有报道.笔者以乌桕优树总基因组DNA为模板,建立了乌桕的SRAP最佳反应体系:20μLPCR反应体积系中,2μL10×PCR buffer、0.2mmol/L dNTPs、0.25mmol/L引物、1.5U Taq聚合酶和40ng模板DNA.并从100个...     

江南油杉ISSR-PCR反应体系建立与引物筛选

为了建立江南油杉(Keteleeria fortunei var.cyclolepis)ISSR-PCR最佳反应体系,以江南油杉嫩叶为材料,采用改良CTAB法提取基因组DNA,通过单因素实验设计,进行ISSR-PCR反应体系和反应条件优化,并筛选出多态性ISSR引物。实验结果表明:江南油杉ISSR-PCR最佳反应体系为25μL体系中模板DNA 40 ng,引物浓度为0.8μmol/L,2×Taq PCR Master Mix用量为12μL。利用该体系从100条ISSR引物中筛选出扩增条带清晰、特异性好的6条引物(UBC807、UBC809、UBC811、UBC812、UBC835、UBC841)。     

红椿SRAP反应体系优化及引物筛选

[目的]优化相关序列扩增多态性(SRAP)体系内的不同组分,建立适用于红椿SRAP分子标记的反应体系,并进一步从SRAP引物组合中筛选出稳定、多态性好的引物组合,为红椿遗传多样性研究奠定试验基础。[方法]针对SRAP-PCR反应体系中5个因素各设置8个水平,先利用单因素试验确定浓度梯度,后在确定的梯度范围内选定4个水平,按照正交试验L16(45)进行优化,结合正交直观分析法和新复极差法对各因素进行优化筛选。[结果]确定最优体系为总体系25μL,模板DNA 25 ng,上下游引物各0.3μmol·L~(-1),Taq DNA聚合酶1U,Mg2+2.5 mmol·L~(-1),d NTP 0.3 mmol·L~(-1)。利用稳定的SRAP-PCR体系,从1 505对SRAP引物组合中筛选出30对优质引物组合。[结论]通过不同种源红椿基因组DNA的重复验证,获得了稳定清晰、多态性较强的扩增条带,表明所确定的最优体系稳定可靠,适用性较强,可用于不同种源红椿遗传多样性研究的后续实验。     

刺五加AFLP分子标记技术体系的建立

用改良的的试剂盒法提取刺五加叶片的基因组DNA,可以获得高质量的刺五加基因组DNA,DNA降解较少、污染低、电泳条带清晰,可以用于PCR扩增反应,可以被内切酶EcoRⅠ和MseI彻底消化。通过优化酶切反应、引物连接、预扩增、选择扩增,建立了优化的刺五加AFLP分析技术体系,从64对引物中筛选到5对高效扩增引物,并利用这5对引物在6个刺五加种源中获得了89个多态性AFLP分子标记。建立了利用红外荧光检测技术和Li-Cor4300DNA分析系统,进行刺五加AFLP分析的分子标记技术。     

闽楠、红楠AFLP反应体系建立

以闽楠、红楠总基因组DNA为模板,对AFLP分析各环节的条件进行了优化和筛选,建立了适合于闽楠、红楠AFLP分析的最佳反应体系.其中:酶切反应条件为在20μL反应体系中,加入模板DNA 150 ng,Buffer22μL,BSA 0.2μL,EcoRI 3U,Msel 2U,37℃酶切4 h,65℃变性10 min,4℃保存;连接反应条件为将酶切产物中加入5μL连接体系(包括T4 Buffer 2.5μL,EcoRI接头5 pmol,MseI接头50 pmol,T4连接酶1U),16℃连接过夜.预扩增反应条件为在20μL体系中,加入稀释25倍的连接产物5μL,Mg2+(25 mM/L)1.6μL,dNTP(2 mM/L)2 μL,预扩增引物E00、M00各30 ng,Taq酶1U.选择性扩增反应条件为:在20μL体系中,加入稀释100倍的预扩增产物5μL,Mg2+ 1.2μL,dNTP 2μL,选择性扩增引物(E+3/M+3)60 ng,Taq酶1U.本实验结果为闽楠、红楠AFLP分析打下了良好的实验基础.     

人心果AFLP反应体系的建立与优化

为给人心果分子生物学研究奠定基础,以人心果嫩叶为材料,采用改良CTAB法提取到高质量的总DNA,可用于AFLP实验分析。通过优化酶切—连接反应、预扩增和扩增反应过程中的关键因素,建立了适合人心果的AFLP实验体系和反应条件,得到了带型清晰、多态性丰富的AFLP指纹图谱。研究结果对人心果遗传多样性分析及其分子标记辅助育种具有重要意义。     

红花木AFLP指纹图谱的构建

为了获得红花檵木的清晰AFLP指纹图谱,以进一步研究红花橙木种质资源的鉴别与分类问题, 、以红花檵木的嫩叶、成熟叶、果实为材料,采用改进后的CTAB+Tris-HCI洗涤法、CTAB法、SDS+Tris-HCI洗涤法、SDS法,获得了HMW基因组DNA,其中以CTAB+Tris-HCI洗涤法提取的成熟叶片的DNA的纯度和浓度都很高,且获得了清晰的AFLP指纹图谱,这为AFLP技术在红花橙木种质资源的研究与应用奠定了基础.     

枣叶片DNA的提取以及AFLP反应体系的建立

扩增片断长度多态性(AFLP)实验过程中,DNA提取质量和适合的PCR扩增反应体系是2个关键因素.利用CTAB法对枣树叶片DNA的提取方法进行探讨.结果表明:改良CTAB法抽提到了较高质量的枣基因组DNA,可用于AFLP实验分析;通过对酶切-连接体系和PCR扩增体系中的关键因素实验分析,建立了适合枣AFLP荧光反应体系,并得到清晰的DNA指纹图谱.     

刺槐AFLP分析体系的建立与优化

以10份刺槐种质资源为试材,通过对影响AFLP反应体系关键因素的优化,建立了刺槐AFLP分析的反应体系,即15ng/μL模板DNA在37℃下双酶切(MseI、EcoRI各0.15U/μL)2h,0.075U/μL T4DNA连接酶连接12h,连接产物、预扩增产物稀释10倍后扩增效果最佳。并利用该体系筛选出引物E+3/M+3,构建了刺槐种质资源的AFLP指纹图谱。     

香榧AFLP实验体系的建立

以香榧(Torreya grandis)的叶片和胚乳为材料,利用改进的CTAB-硅珠吸附法提取DNA,分别就叶片与胚乳建立了香榧的AFLP银染反应体系。结果表明:采用EcoRⅠ/MseⅠ酶切体系,64对引物中有36对引物既不适合叶片也不适合胚乳;适合胚乳AFLP分析的引物有20对,适合胚乳叶片AFLP分析的引物组合有15对,既适合胚乳又适合叶片的引物有7对。实验结果为利用AFLP标记对香榧进行深入研究打下了基础。     

一种适合AFLP分析的油茶DNA提取方法

以油茶的成熟叶片为材料提取DNA,40个样品用改良的提取纯化方法成功提取出适用于AFLP分析的高质量DNA,OD260/OD280在1.7-2.0之间,可以用于AFLP反应。该方法打破了仅能用幼嫩叶片作为提取材料的限制,具有更广泛的适用性和重要的实用性。