马泰勒虫病PCR检测方法的建立和应用

为寻求一种快速、有效的马泰勒虫 (Theileria equi,T.equi) PCR检测方法。基于马泰勒虫18S rRNA基因序列,在其V4高变区设计特异性引物Te-18F、Te-18R,通过PCR技术获得了531 bp的核酸片段。用该引物对马泰勒虫、马泰勒虫和驽巴贝斯虫混合样本、驽巴贝斯虫、尤氏泰勒虫、中华泰勒虫、环形泰勒虫、绵羊泰勒虫、吕氏泰勒虫和瑟氏泰勒虫基因组模板进行特异性试验。同时对马泰勒虫基因组模板进行不同浓度稀释后扩增,以便于确定试验的敏感性。用本试验建立的方法与常规显微镜镜检方法对45份马属动物血样进行检测。特异性试验显示,在被检测的9个样本中,只有马泰勒虫及马泰勒虫和驽巴贝斯虫混合模板中扩增出了符合大小的特异核酸片段。驽巴贝斯虫、尤氏泰勒虫、中华泰勒虫、环形泰勒虫、绵羊泰勒虫、吕氏泰勒虫和瑟氏泰勒虫的扩增结果均为阴性。灵敏度试验结果表明,PCR对马泰勒虫的扩增效率可达到10^-13。对本试验建立的PCR检测马泰勒虫方法评估结果显示,PCR对马泰勒虫的检出率为17.78%(8/45),显微镜镜检结果只有8.89%(4/45)两者的符合率为100%。本试验建立的马泰勒虫PCR检测方法不失,为一种好的检测方法。     

马泰勒虫和弩巴贝斯虫双重荧光定量PCR检测方法的建立

马梨形虫病(EP)是由巴贝斯虫属的驽巴贝斯虫(B.caballi)和泰勒虫属的马泰勒虫(T.equi)感染引起的蜱传马属动物疾病.为建立EP两种病原的双重荧光定量PCR检测方法,本研究根据GenBank中T.equi和B.caballi 18SrRNA基因序列设计特异性引物和探针,经过反应体系和条件优化,建立了能够同时...     

羊泰勒虫不同PCR检测方法的比较

为寻求快速、有效检测羊泰勒虫的PCR方法,本试验建立了检测羊泰勒虫18SrRNA基因和表面蛋白基因的两种常规PCR方法和一种检测18SrRNA基因的半套式PCR方法,并从其敏感性和临床样本检出率等方面进行了比较。结果显示:上述方法检测羊泰勒虫基因组DNA的最小检测量分别为1.6fg/μL、16fg/μL和0.016fg/μL;检测临床样本阳性检出率分别为31.37%(16/51)、17.64%(9/51)和45.10%(23/51)。3种方法中,检测18SrRNA基因的半套式PCR方法敏感性和临床样本检出率最高,其次为检测18SrRNA基因的常规PCR方法,最后为检测表面蛋白基因的常规PCR方法。结果说明,所建立的半套式PCR方法是一种较好的羊泰勒虫检测方法。     

马泰勒虫流行病学及基因型研究进展

马泰勒虫病是由马泰勒虫引起的一种重要蜱传寄生虫病,是我国的三类动物疫病。马泰勒虫寄生于马、骡、驴、斑马等马属动物的淋巴细胞和红细胞内,可导致宿主贫血、消瘦、运动能力下降、流产、死亡等。感染该病后一般表现为终身带虫,随着宿主年龄增加,感染率也随之增加。由于媒介蜱的广泛分布,马泰勒虫病在全球绝大多数地区流行,只有少数国家为马泰勒虫无疫区国家,且这些国家仅占10.4%。马泰勒虫病对马产业造成严重的经济损失,因患病后会削弱马的性能,治疗成本以及马匹的国际运输检测都给马产业造成了显著的经济损失。该文对马泰勒虫的生活史、临床症状、基因型、治疗方案及预防进行综述总结,为马泰勒虫的进一步研究提供参考。     

羊泰勒虫套式PCR检测方法的建立

为了建立一种特异、敏感、快速检测羊泰勒虫方法,以羊泰勒虫主要表面蛋白(MPSP)基因设计引物,建立羊泰勒虫套式PCR检测方法。结果表明,该方法只能扩增出羊泰勒虫,而对照组羊巴贝斯虫、羊无浆体和弓形虫基因组DNA均未扩出目的条带。该方法敏感性是普通PCR的1 000倍,其最低检测到1拷贝数的MPSP基因。对采自吉林珲春地区30份羊血液样本检测发现,套式PCR阳性率为46.6%(14/30),高于普通PCR(40.00%,12/30)和血液涂片染色(23.33%,7/30),三者阳性符合率为100%。结果表明,所建立的套式PCR可用于羊泰勒虫病的诊断和流行病学调查。     

套式PCR检测马巴贝斯虫

根据GenBank中马巴贝斯虫(Babesia equi)ema-1基因序列,设计合成内外2对引物,其中外引物扩增ema-1基因60～627nt间567 bp片段,内引物扩增ema-1基因259～488nt间229bp片段。从实验室感染马巴贝斯虫阳性马匹全血样本中提取DNA,采取2次扩增的方法,扩增到229bp特异性条带,建立了适合马巴贝斯虫快速检测的套式PCR方法。经重复性试验和特异性试验,结果显示,马巴贝斯虫阳性样本在229bp均出现条带,而驽巴贝斯虫、牛巴贝斯虫扩增结果为阴性。采用该方法对已知阴、阳性的16份马匹全血样品进行检测,有8份为阳性,与实际结果的符合率为100%。表明,所建立的方法具有较高的重复性和特异性,可用于马巴贝斯虫病的临床诊断、病料检测和分子流行病学调查。     

牛瑟氏泰勒虫套式PCR检测方法的建立及初步应用

根据GenBank上发表的牛瑟氏泰勒虫P33基因序列设计2对特异性引物,建立套式PCR检测方法。该方法与弓形虫RH株、猪附红细胞体和犬新孢子虫均无交叉反应,能检测到的最低DNA量为15 fg。在75份临床样本检测中,62份为阳性,阳性率为82.7%。由此可见所建立的套式PCR检测方法具有较高的敏感性和特异性,可用于牛瑟氏泰勒虫急性感染和隐性感染的早期诊断,为该病的临床检测、流行病学调查、进出口检疫和实验室研究提供了新的技术手段。     

马泰勒虫感染新西兰兔的病理组织学观察

旨在研究马泰勒虫感染家兔后器官组织病理变化。以家兔为动物模型,去脾后人工感染马泰勒虫、在其体内进行扩繁,PCR检测是否成功感染,每日进行血液涂片和血常规检查,记录感染率,同时用1只健康兔作为对照;达感染高峰时,试验兔和对照兔进行剖检、制作组织切片,观察其主要器官病理变化。结果显示,感染兔心肌发生颗粒变性及水泡变性,心肌细胞间质增宽;肝脏小叶间静脉淤血,肝细胞呈现水泡变性,甚至气球样变;肺脏呈现典型间质性肺炎的病理变化;肾脏主要表现为急性肾小球肾炎;健康兔的各器官未见明显异常。血常规检测结果显示,感染兔有炎性血象、贫血和轻度脱水;感染兔临死前血液涂片检查发现红细胞中含大量马泰勒虫裂殖子,而健康兔未见异常。PCR检测得到512bp的目的条带,与预期目的片段相符。综上表明,感染兔心脏、肝脏、肺脏、肾脏均有明显的病理变化,与健康兔对比差异明显。     

贝类折光马尔太虫半套式PCR检测方法的建立及初步应用

根据Genbank中折光马尔太虫的基因保守序列,设计了3条特异性引物,通过对半套式PCR扩增条件的优化,研究建立了检测贝类折光马尔太虫的半套式PCR方法.该方法对折光马尔太虫模板进行扩增,得到与实验设计相符的228 bp的特异性扩增带,而对单孢子虫、派琴虫、副溶血弧菌、溶藻弧菌和河弧菌等病原体的扩增,结果全为阴性.敏感性试验结果表明,该技术最低能检测到0.01 fg的折光马尔太虫质粒DNA.用该半套式PCR对福建沿海的贝类样品进行检测,结果从溢蛏中检出折光马尔太虫7份,结果提示福建沿海养殖的贝类中存在折光马尔太虫感染,建立的半套式PCR方法可以用于贝类折光马尔太虫的临床快速检测.     

马梨形虫病病原双重荧光PCR快速检测方法的建立与应用

在序列比对分析的基础上,设计2对引物和2条MGB探针,经体系优化建立了可快速鉴别检测两种马梨形虫病病原（马泰勒虫和驽巴贝斯虫）的双重荧光PCR检测方法。该方法可分别检出22和31基因拷贝的虫体DNA,且不与其他马病病原发生交叉反应。应用建立的荧光PCR检测方法,对采自进出口马匹的10份马全血和20份马血清进行检测,结果从马全血中检出2份马泰勒虫阳性样品。使用一对马泰勒虫EMA1全基因扩增引物,从2份阳性样品中扩增了EMA1基因。克隆测序后,对该基因全序列进行分析,证实其为马泰勒虫特异基因序列;2份样品的基因序列相似性为98.9%,存在6个氨基酸变异;2个样品中的EMA1基因不完全一致,表明2个感染样品中的虫体可能为不同的马泰勒虫虫株。     

牛瑟氏泰勒虫二温式PCR快速检测技术的建立及初步应用

为建立一种牛瑟氏泰勒虫快速检测技术,根据GenBank上已发表的牛瑟氏泰勒虫P23表面蛋白基因序列(D84447)设计1对特异性引物,扩增出大小为244 bp的基因片段,经克隆、测序分析,与已知基因序列同源性为100%。用该对引物建立的牛瑟氏泰勒虫二温式PCR能检测出的最高敏感度为171 fg/μL,与牛新孢子虫、弓形虫和卵形巴贝斯虫不产生交叉反应,对48份临床血液样本进行检测,阳性检出率为66.67%。用同一对引物对28份临床血液样本分别进行二温式PCR和三温式PCR检测,阳性符合率为95%,总符合率为96.43%。结果表明,该方法具有快速、敏感、特异等优点,可用于牛瑟氏泰勒虫病的快速临床诊断及流行病学调查。     

Investigation of Molecular Etiology of Theileria equi Infection in Three Herds

To explore the prevalence of Theileria equi (T.equi) infection in horse in Guizhou province, the antibody level and 18S rRNA gene were detected from blood samples of Guizhou pony, Southwest horse and Yili horse using competitive ELISA and PCR methods.Giemsa-stained blood smear was prepared to observe T.equi in red blood cells.Intact protozoans of T.equi were observed in red blood cells of horses at Giemsa-stained slide smears with a detection rate of 12.5%.The 18S rRNA gene fragment of T.equi was detected in Guizhou pony, Southwest horse and Yili horse, and the consistent rates with the known nucleotide sequence were 97% to 100%.The PCR result indicated that the positive rates of T.equi in Guizhou pony (76.62%) and Yili horse (73.81%) were similar, which were higher than that in Southwest horse (33.33%).Furthermore, the antibody levels against T.equi in Guizhou pony (24.68%) and Southwest horse (12.12%) were lower than that in Yili horse (31.71%).A weak correlation between the antibody level and the blood physicochemical indexes was calculated from Guizhou pony and Southwest horse, including weak positive correlations with neutrophils numbers, gamma-glutamyl transferase and creatine kinase levels, and weak negative correlations with the numbers of red blood cell, white blood cell, platelet and lymphocyte and contents of hemoglobin.It suggested that a higher proportion of T.equi infection present in three herds.     

FTA纸片中保存的马巴贝虫DNA的PCR检测

应用PCR分别检测了保存在FTA纸片中和-20℃保存的37份马抗凝血液样本中的马巴贝虫DNA。结果显示，FTA纸片和马抗凝血液的马巴贝虫DNA检出率均为75．7％（28／37）。证实FTA纸片中的血液样本可以用于PCR检测，而且结果可靠、节省时间。便于送检和保存，有利于疾病的诊断和流行病学调查。     

牛瑟氏泰勒虫ITS基因PCR诊断方法的建立

本试验根据GenBank上登录的牛瑟氏泰勒虫ITS基因序列(AY661522.1),应用Primer Premier 5.0和Oligo 6.31软件设计合成1对特异性引物,以牛瑟氏泰勒虫DNA为模板,建立了牛瑟氏泰勒虫ITS基因PCR诊断方法。该方法扩增片段大小为1020 bp,与参考序列的同源性为98%;建立的PCR方法与猪附红细胞体、犬新孢子虫和弓形虫均无交叉反应,最低DNA检出量为1.5 pg/μL;通过对60份临床样品的检测,并与血涂片方法进行比较,结果显示PCR方法具有特异、敏感等特点,适用于牛瑟氏泰勒虫的检测。     

猪嗜血支原体PCR及荧光定量PCR检测方法的建立和比较

为了解猪嗜血支原体(Mycoplasma haemosuis)对猪群的感染情况并建立该病的检测方法,本研究根据GenBank登录的M.haemosuis 16S rRNA基因序列(FJ263944)设计合成PCR引物以及荧光定量PCR(FQ-PCR)引物和探针.以含16S rRNA基因的重组质粒为模板,通过对PCR反应...     

The sensitivity of PCR and serology in different Theileria parva epidemiological situations in Rwanda

Theileria parva is the causative agent of a lethal tick-borne disease of cattle occurring in eastern, central and southern Africa. Variations in the sensitivity of the serological and molecular tests with seasonal vector occurrence and discrepancies between low PCR prevalence and high T. parva vector density are a setback to estimate true prevalences. Therefore, the objectives of the present studies were to evaluate (1) the sensitivity of three serological tests (IFAT, ELISA and SELISA) and one molecular test (PCR) in the diagnosis of chronic T. parva infections in four different agro-ecological zones of Rwanda and (2) the effect of tick challenge and animal's age on the sensitivity of PCR. Blood samples from 635 bovines were collected in four agro-ecological zones of Rwanda. All sera were screened using the IFAT, ELISA, SELISA and PCR. The binary results of the four diagnostic tests were introduced separately for each agro-ecological zone in a Bayesian model to estimate the prevalence of T. parva infections and the sensitivity of the four diagnostic tests. All test specificities were set to 100%. The estimated T. parva prevalence was much higher (83–85%) than estimations based on single diagnostic tests. The estimated sensitivity of serological tests was relatively constant and ranged from 57 to 75% in the various areas. The sensitivity of PCR showed more pronounced variations, ranging from 66% in the low T. parva transmission (high land) zones compared to 24% in the highly vector infested (low land) zones. Calves and adult cattle (n = 194) were also sampled in regularly and irregularly dipped herds in the low land region. The apparent T. parva prevalence detected by PCR was significantly higher in calves than in adult cattle and in herds regularly treated with acaricides, while no significant differences were found with IFAT. The conditional probability that a sample was positive at PCR while it was positive at IFAT was significantly lower in adults. The implication of these findings in the use of diagnostic assays for epidemiological studies is discussed.     

快速鉴定猪链球菌和马链球菌兽疫亚种双重PCR方法的建立

本试验旨在建立一种快速、特异、敏感的双重PCR鉴定猪链球菌和马链球菌兽疫亚种病原检测方法。根据猪链球菌GDH蛋白和马链球菌类 M 蛋白的基因保守区分别设计引物,优化了该双重PCR检测方法的引物浓度及比例,并筛选了其最佳退火温度;用该双重PCR反应体系以其他几株阴性菌株为对照,检测了该反应体系的特异性。以新鲜培养的猪链球菌倍比稀释后进行菌落计数,对该检测方法的敏感性进行了鉴定。M-like和GDH引物的加入量均为1 μL(20 pmol/L),最佳退火温度为52.3℃;该双重PCR反应体系有较高敏感性,检测马链球菌兽疫亚种和猪链球菌的敏感度分别达100和10 CFU;特异性试验结果显示,常见的5种病原菌在该双重PCR体系中无特异性条带出现;临床应用该方法分离鉴定了1株猪链球菌和2株马链球菌兽疫亚种。本试验建立了一种能同时检测猪链球菌和马链球菌兽疫亚种的双重PCR方法,且该方法应用快速、特异且敏感。