鸡4种病毒抗原液的浓缩及其四联油佐剂灭活苗的研制

本研究通过超滤浓缩技术对鸡新城疫病毒、传染性支气管炎病毒、产蛋下降综合征病毒和传染性法氏囊病病毒的尿囊液进行了10倍或10倍以上的浓缩处理，并按一定的比例配比研制成四联油乳剂灭活疫苗，对鸡的最小免疫剂量是0.25ml，免疫接种二周后，鸡新城疫和产蛋下降综合征病毒的HI抗体效价分别达到8log     

抗鸡传染性支气管炎病毒单克隆抗体的制备及其特性的研究

本实验将鸡传染性支气管炎病毒（澳大利亚Ｔ株）进行纯化，制成抗原，应用杂交瘤技术建立了５株分泌抗鸡传染性支气管炎病毒的杂交瘤细胞株，其免疫球蛋白的亚类分别属于ＩｇＧ１、ＩｇＧ３、ＩｇＭ。杂交瘤细胞分泌抗体的能力稳定，长期传代对其抗体分泌能力没有影响。５株单克隆抗体与其它１２株鸡传染性支气管炎病毒标准株之间存在不同程度的交叉反应，但对鸡新城疫病毒、传染性法氏囊病病毒、产蛋下降综合征病毒及禽流感病毒均无交叉反应。用此杂交瘤细胞制备腹水的ＥＬＩＳＡ效价为１０－６～１０－７，抗体对热的稳定性有一定的差别。抗体纯化后，经ＳＤＳ－ＰＡＧＥ凝胶电泳表明具有单克隆抗体的特征，经快速蛋白分析鉴定其纯度为８９．４９％。竞争ＥＬＩＳＡ法证明其中４株的单抗与抗原结合位点并不完全相同。采用单抗夹心ＥＬＩＳＡ法，对抗原的检测方法进行了初步探索。     

鸡新城疫La Sota、传染性支气管炎(H120+W93)二联灭活疫苗的研究

将鸡新城疫La Sota-传染性支气管炎H129二联抗原液、鸡传染性支气管炎W93抗原液分别用甲醛灭活，经浓缩后按一定比例混合，与油佐剂乳化制成二联灭活疫苗，对30日龄的雏鸡免疫，每只0．3ml，免疫接种3周后，新城疫病毒的HI抗体平均达9．7log2，免疫鸡只耐受呼吸道型、嗜肾型传染性支气管炎强毒攻击，保护率均达到90％，疫苗使用安全。     

不同毒株鸡传染性支气管炎病毒与鸡新城疫病毒接种鸡胚联合培养相互作用研究

本实验目的在于探讨不同毒株鸡传染性支气管炎病毒和鸡新城疫病毒混合接种同一鸡胚尿囊腔培养时二者之间的相互作用。分别将按２００倍、５００倍、１０００倍不同浓度稀释的鸡传染性支气管炎病毒Ｆ３株、肾型Ｊ株、Ｈ１２０２８／８６株,Ｈ５２和Ｈ１２０株和１００倍稀释的Ｌａｓｏｔａ鸡新城疫病毒联合接种到１０日龄鸡胚尿囊腔,同时设单独培养作对照,９６小时后收取尿囊液,用对流免疫电泳法检测鸡传染性支气管炎病毒效价,用血球凝集试验检测尿囊液鸡新城疫病毒效价。结果表明,鸡新城疫病毒对鸡传染性支气管炎病毒增殖无明显促进作用,但无抑制现象;鸡传染性支气管炎病毒浓度过大时,对鸡新城疫病毒有一定抑制作用,在适当浓度时二者之间无干扰作用。以ＮＤＶ１００倍ＩＢＶ１０００倍稀释混合作用后联合接种培养对二者效价均无明显干扰,ＮＤＶ血凝效价可达１１ｌｏｇ２,ＩＢＶ对流免疫电泳沉淀效价可达９ｌｏｇ２,效果最佳。联合培养省时、省力、节约鸡胚损耗。     

鸡新城疫、传染性支气管炎、减蛋综合征、禽流感四联浓缩油乳剂灭活疫苗的研制

利用PALL滤器分别对鸡新城疫、传染性支气管炎、减蛋综合征和禽流感4种病毒进行10倍浓缩,然后按照一定比例将抗原浓缩液与油佐剂配比,制备了四联油乳剂灭活疫苗。通过了实验室检查,田间试验表明:开产前种鸡免疫后第4周,新城疫和禽流感的HI抗体滴度在10.2log2以上、传染性支气管炎和减蛋综合征均大于9.5log2,且抗体高峰维持时间长;SPF鸡免疫后4周进行攻毒保护试验,结果免疫攻毒组保护率100%,对照组攻毒发病率100%。试验结果表明:采用抗原浓缩技术制备的四联苗抗体水平高,维持时间长,能够有效地保护鸡群。     

鸡新城疫诊断抗原制备方法的研究

将疑似新城疫病料无菌采集后进行RT-PCR鉴定,将阳性病料研磨后接种SPF鸡胚,收获的阳性尿囊液进行血凝试验(HA)及血凝抑制试验(HI)检测病毒效价,病毒效价达到2~7~2~8,病毒凝集效价达到10log2。使用10%蔗糖溶液及18-25k Da透析袋对阳性尿囊液进行浓缩,浓缩至原体积的1/5;10%福尔马林灭活诊断抗原,经过6h后灭活达100%;诊断抗原效价测定:血凝效价为2~(10);血凝抑制效价为10log2。利用制备的鸡新城疫诊断抗原和鸡新城疫标准诊断抗原与鸡新城疫标准检测抗体进行血凝试验(HA)与血凝抑制试验(HI),对比结果:鸡新城疫诊断抗原病毒效价为2~(10),高于鸡新城疫标准诊断抗原的2~9,鸡新城疫诊断抗原凝集效价为10log2,等同于鸡新城疫标准诊断抗原,证明所制备鸡新城疫诊断抗原符合要求,可以应用到生产实践中。     

新支二联苗种毒联合培养和联合免疫的研究

用不同毒株鸡传染性支气管炎病毒(F3株、肾型J株、H120-28/86株、H52、H120株)分别按不同浓度(100倍、400倍、700倍和1000倍)与100倍稀释的Lasota鸡新城疫病毒联合接种到10日龄鸡胚尿囊腔，同时设单独培养作对照，96h后收取尿囊液，用对流免疫电泳法检测鸡传染性支气管炎病毒效价，用血球凝集试验检测尿囊液鸡新城疫病毒效价。结果表明.以NDV100倍和IBV1000倍稀释混合作用后联合培养对二者病毒效价均无明显影响，NDV血凝效价可达1b11，IBV对流免疫电泳沉淀效价可达1b11，效果最佳。然后将上述培养液，用福尔马林溶液对其进行灭活，通过常规途径制备鸡新支二联油乳刑灭活苗。将此苗接种于21日龄雏鸡，接种后0，7，14，21，28，35，42，49d分别检测雏鸡NDV抗体和IBV抗体，检出的抗体平均值分别为2，3.6，4.8，5.8，6.2，6.5，6.8，6.5和2，3.3，4.6，5.9，6、2，6.4，6.6，6.4；攻毒保护率为100％。实验证明。以NDV100倍与IBV1000倍稀释混合作用后联合培养的尿囊液制得的鸡新支二联油乳荆灭活苗可以预防鸡新城疫和鸡传染性支气管炎。     

重大禽病浓缩疫苗的研制

利用PALL滤器将灭活后的新城疫、禽流感、传染性支气管炎、产蛋下降综合征等病毒分别进行10倍浓缩，经检验合格后，分别按照一定比例将抗原浓缩液与灭菌的医用白油配比，经胶体磨制备成三联或四联油乳剂灭活疫苗，均通过了实验室的各项指标检测。经过在隔离器进行实验室安全和效力检验，以及田间试验证明，该疫苗安全有效，抗体水平高，维持时间长，能够保护鸡群抵抗新城疫、禽流感、传染性支气管炎等强毒的攻击。     

盒式超滤系统对四联苗中NDV及IBV的浓缩试验

采用Filtron中型盒式超滤系统，对新城疫病毒（NDV）抗原液和NDV与传染性支气管炎病毒（IBV）混合抗原液进行浓缩试验，结果显示，浓缩抗原液的HA效价按浓缩比率成倍上升，而超滤液的HA为阴性，以浓缩抗原液，未浓缩抗原液及超滤液为水相，分别制成NDV浓缩油苗，NDV未浓缩油苗，四联浓缩苗，四联未浓缩油革以及超滤液乳剂，分别对久．鸡免疫后，NDV浓缩苗与未膛缩苗免疫鸡均产生了对NDV强毒攻击的抵抗力，保护率达100％，而NDV浓缩苗诱导产生的HI抗体效价明显高于未浓缩苗；比较浓缩四联苗与未浓缩四联苗的免疫效力，当2种疫苗注射剂量不同而抗原量相同时，诱导产生的免疫效力相同；浓缩苗与未浓缩苗效价测定及超滤液乳剂免疫试验结果证实，浓缩过程中既无有效抗原丢失，也无抗原活性变化，试验结果显示，该设备浓缩工艺简单，抗原回收率达100％，是一种理想的病毒浓缩齐备。     

鸡传染性支气管炎病毒血凝抑制试验抗原的研制

为应用血凝抑制(HI)试验检验鸡传染性支气管炎疫苗免疫效力(血清、卵黄抗体水平),建立了鸡传染性支气管炎病毒HI试验抗原的制备方法。该方法是通过选取抗原谱最广的鸡传染性支气管炎病毒(IBV)M41株,经SPF鸡胚增殖培养36h后无菌收取鸡胚尿囊液,4℃、12 000r/min离心10min,上清用聚乙二醇(PEG)20000浓缩100倍;兔源A型产气荚膜梭菌中国标准株(C57-1株)37℃增殖培养18h,4℃、12 000r/min离心10min取上清,经PEG 20000透析袋浓缩5倍后通过0.20μm滤膜过滤除菌,然后将IBV液和A型产气荚膜梭菌菌液(含α毒素)二者按一定比例混合后经37℃恒温振荡感作2h,4℃经48h后制成。经大量试验表明,制备的IBV HI试验抗原效价高、稳定性好,可替代进口抗原应用于鸡群IBV疫苗免疫后血清抗体及卵黄抗体的HI效价检测。     

提高鸡传染性支气管炎病毒血凝抗原滴度途径及抗原灭活

将７株传染性支气管炎病毒（ＩＢＶ）标准株（Ｍ４１、Ｈ１２０、Ｈｏｌｔｅ、Ｇｒａｙ、Ｃｏｎｎｅｃｔｉｃｕｔ、Ｉｏｗａ６０９和Ｔ株）和６株分离株（ＮＩＢＶ、ＧＩＢＶ、Ｍ、ＳＨ、Ｊ和Ｈ株）分别接种于鸡胚，收获尿囊液，经浓缩后，用魏氏梭菌培养液处理，制备血凝抗原。其中，Ｈ１２０株血凝滴度最高，Ｔ、Ｍ、Ｊ和Ｈ株无血凝性。应用含有不同滴度ＩＢＶ母源抗体的鸡胚增殖病毒制备抗原，效价与用ＳＰＦ鸡胚增殖病毒制备的抗原效价一致。尿囊液经反复冻融后再制备抗原会使血凝价降低。抗原分别用甲醛、高碘酸钠、硼氢化钾和ＳＤＳ灭活，其中甲醛灭活效果最理想。抗原对氯仿敏感，对乙醚稳定。适宜浓度的Ｎａ＋、Ｍｇ２＋可显著提高抗原的血凝性     

鸡新城疫-传染性支气管炎-传染性法氏囊病三联灭活疫苗对不同日龄雏鸡的免疫效力研究

为评估鸡新城疫(ND)-传染性支气管炎(IB)-传染性法氏囊病(IBD)三联灭活疫苗对不同日龄和不同水平母源抗体雏鸡的免疫效力和持续期,本试验用该疫苗免疫7、14、21日龄SPF雏鸡和有母源抗体的普通雏鸡,免疫后采血测定ND血凝抑制抗体(HI Ab)、IB血凝抑制抗体(HI Ab)及IBD中和抗体(NA),并用传染性法氏囊病病毒(IBDV)强毒攻击。结果显示,7日龄SPF雏鸡免疫后21 d ND HI抗体、IB HI抗体及IBD中和抗体效价分别为7.9log2、6.9log2和14.1log2,SPF鸡日龄越大,抗体水平越高;28日龄SPF鸡免疫后3个月,0.3 mL免疫剂量组试验鸡ND HI、IB HI及IBD中和抗体效价分别达6.5log2、6.1log2和13.6log2,IBDV攻毒保护率均为100%(10/10);不同日龄普通雏鸡免疫效果与SPF鸡试验一致,抗体水平随鸡日龄增大而升高,IBD攻毒保护率也都达到100%(10/10)。试验结果证实,鸡新城疫-传染性支气管炎-传染性法氏囊病三联灭活疫苗可使7、14及21日龄SPF雏鸡和普通雏鸡产生良好的免疫力,对雏鸡的免疫期至少为3个月。     

不同毒株鸡传染性支气管炎病毒与鸡新城疫病毒接种鸡胚联合 …

本实验目的在于探讨不同毒株鸡传染性支气管炎病毒和鸡新城疫病毒混合接种同一鸡胚尿囊腔培养时二者之间的相互作用,分别将按２００倍,５００倍,１０００倍不同浓度稀释的鸡传染性支气管炎病毒Ｆ３株,肾型Ｊ株,Ｈ１２０,２８／８６株,Ｈ５２和Ｈ１２０株的１００倍稀释的Ｌａｓｏｔａ鸡新城疫病毒联合接种到１０日龄鸡胚尿囊腔,同时设单独培养作城疫病毒效价。结果表明,鸡新城疫病毒对鸡传染性支气管炎病毒增殖无明显促进作     

鹅副黏病毒胶体金检测卡的研究

将制备的抗鹅副黏病毒(GPMV)JG04株单克隆抗体3A5标记胶体金颗粒,提纯的鸡IgG(抗JG04株GPMV)喷涂在NC膜上,建立检测GPMV的快速夹心胶体金免疫层析检测卡(ICS)。该检测卡检测鸡减蛋综合征病毒、传染性法氏囊炎病毒、传染性支气管炎病毒、小鹅瘟病毒鸡胚或鸭胚尿囊液和麻疹病毒、犬瘟热病毒细胞培养物呈阴性,与鹅副黏病毒、孔雀源新城疫毒株,鸽源新城疫毒株、新城疫La sota株、鸡源新城疫病毒的尿囊液出现阳性反应。敏感性试验结果表明,该检测卡可检出血凝效价为24以上的鹅副黏病毒尿囊液。     

NDV、IBDV二联灭活苗对蛋雏鸡免疫程序研究

为探讨鸡新城疫病毒(NDV)、传染性法氏囊病毒(IBDV)二联灭活疫苗在蛋雏鸡养殖中的实际应用效果进行本试验。用鸡新城疫、传染性法氏囊二联灭活疫苗及传染性法氏囊活疫苗以不同免疫程序免疫7~14日龄蛋雏鸡,定期监测NDV、IBDV抗体水平,并在雏鸡60日龄时进行攻毒保护试验。结果表明,各二联苗免疫组NDV抗体水平在免疫后14 d即达到NDV血清学最低有效保护价标准,并维持至雏鸡60日龄。免疫后28 d,灭活苗一次性免疫各组IBDV中和抗体水平显著高于活苗两次免疫组,琼扩抗体水平与活苗两次免疫组无明显差异。雏鸡60日龄时攻毒,各免疫组均100%保护,对照组无保护。以上结果说明该二联灭活疫苗可替代IBDV活毒疫苗用于7~14日龄商品雏鸡免疫,免疫期至少为60d。     

单抗夹心ELISA法检测鸡传染性支气管炎病毒的研究

利用常规法建立分泌抗鸡传染性支气管炎病毒（ＩＢＶ）的单抗细胞株，选其中特异性强、稳定性好、分泌抗体效价高的两株单抗２（１）和２（４），用于建立单抗夹心ＥＬＩＳＡ法检测ＩＢＶ，该方法仅与ＩＢＶ，呈阳性反应，而与鸡新城疫病毒、鸡传染性法氏囊炎病毒、禽腺病毒、鸡传染性喉气管炎、鸡支原体等病原体均呈阴性反应。１４日龄ＳＰＦ鸡接种ＩＢＶ后，用本方法对其两周内的口腔棉拭样品进行跟踪检测，结果检出率为８０％。将     

新城疫病毒—减蛋综合征病毒抗原液与抗原浓缩液的HA效价关系

采用Millipore CogentTM超滤系统对新城疫病毒抗原液和减蛋综合征病毒抗原液进行浓缩试验。结果显示,新城疫病毒浓缩抗原液的HA效价按浓缩比率相应上升,而超滤液的HA效价为阴性;减蛋综合征病毒浓缩病毒液的HA效价均比未浓缩病毒液相应增高,而超滤液的HA效价均为零。     

技术成果转让简介

北京市农林科学院畜牧兽医研究所拥有研制、生产、检验“鸡传染性法氏囊病活疫苗”、“鸡传染性法氏囊病灭活苗”、“鸡新城疫油乳剂灭活苗”、“鸡传染性鼻炎油乳剂灭活苗”、“鸡新城疫、鸡传染性法氏囊病二联油佐剂灭活苗”、“鸡新城疫、鸡传染性鼻炎二联油佐剂灭活苗”和“鸡新城疫、鸡传染性支气管炎、减蛋下降综合症、禽脑脊髓炎四联油佐剂灭活苗”等七种非专利性专有技术成果，包括未公开的、未取得知识产权法律保护该疫苗相关产品设计、工艺流程、配方、质量检验和控制等方面的技术资料。该七种疫苗均已获得农业部颁发的《新兽药证书》。     

鸡传染性支气管炎病毒(M41株)血凝抑制试验抗原的制备及检验

用传染性支气管炎病毒(IBV)M41株毒种接种11日龄鸡胚,收获感染鸡胚病毒液,将新鲜的病毒液用小型盒式超滤浓缩系统浓缩,然后用高速离心机离心,去上清,沉淀用原病毒液体积1/100的HA缓冲液悬浮,制备出100倍浓缩的IBV病毒液;将100倍浓缩的IBV病毒液中加入15%^20%的A型魏氏梭菌滤液,充分混匀,放37℃恒温振荡器感作2h,取出置2-8℃条件下48 h.制备出了5批IBV M41株HI杭原.检验结果显示:5批HI抗原的性状均为白色混浊液体,底部有少量沉淀;无菌检验为阴性,HA效价为1:128～1:512,5批杭原与IB阳性血清呈阳性反应,HI效价为81og2,而与阴性血清、新城疫阳性血清、H9亚型禽流感阳性血清、H5亚型禽流感阳性血清及产蛋下降综合征阳性血清呈阴性反应,HI效价低于21og2.各项检验结果均符合要求.     

鸡新城疫－传染性支气管炎－传染性法氏囊病三联灭活疫苗对不同日龄雏鸡的免疫效力研究

为评估鸡新城疫（ND）-传染性支气管炎（IB）-传染性法氏囊病（IBD）三联灭活疫苗对不同日龄和不同水平母源抗体雏鸡的免疫效力和持续期,本试验用该疫苗免疫7、14、21日龄SPF雏鸡和有母源抗体的普通雏鸡,免疫后采血测定ND血凝抑制抗体（HI Ab）、IB血凝抑制抗体（HI Ab）及IBD中和抗体（NA）,并用传染性法氏囊病病毒（IBDV）强毒攻击。结果显示,7日龄SPF雏鸡免疫后21 d ND HI抗体、IB HI抗体及IBD中和抗体效价分别为7.9log2、6.9log2和14.1log2,SPF鸡日龄越大,抗体水平越高;28日龄SPF鸡免疫后3个月,0.3 mL免疫剂量组试验鸡ND HI、IB HI及IBD中和抗体效价分别达6.5log2、6.1log2和13.6log2,IBDV攻毒保护率均为100%（10/10）;不同日龄普通雏鸡免疫效果与SPF鸡试验一致,抗体水平随鸡日龄增大而升高,IBD攻毒保护率也都达到100%（10/10）。试验结果证实,鸡新城疫-传染性支气管炎-传染性法氏囊病三联灭活疫苗可使7、14及21日龄SPF雏鸡和普通雏鸡产生良好的免疫力,对雏鸡的免疫期至少为3个月。