几丁质酶基因和β-1.3-葡聚糖酶基因的克隆及双价基因在枯草芽胞杆菌B-908中的表达

 本文综述了几丁质酶和β-1,3-葡聚糖酶的研究历史及特点,几丁质酶和β-1,3-葡聚糖酶的分子生物学方面研究进展,以及几丁质酶基因和β-1,3-葡聚糖酶基因在植病生防方面的应用概况。以几丁质酶产生菌粘质沙雷氏菌Serratia marcescens和β-1,3-葡聚糖酶产生菌环状芽孢杆菌Bacillus circulans为供体菌株,提取其染色体DNA。经Sau3 Al部分酶切后,插入克隆质粒pUC19,分别建立了几丁质酶基因文库和β-1,3-葡聚糖酶基因文库。     

β-1,3-葡聚糖酶和几丁质酶活性与大豆对疫霉根腐病抗性的关系

 为了明确β-1,3-葡聚糖酶和几丁质酶与大豆抗疫霉根腐病的关系,测定了不同抗性大豆品种接种大豆疫霉菌后β-1,3-葡聚糖酶和几丁质酶活性的变化情况和2种酶对大豆疫霉菌的抑制作用。结果表明,大豆疫霉菌能诱导大豆β-1,3-葡聚糖酶和几丁质酶的活性增强,但2种酶在积累速度和幅度上,抗病品种和感病品种有显著的差异。与感病品种"857-1"相比,抗病品种"垦农4号"2种酶活性不仅升高的速度快、幅度大,且高活性维持的时间长。β-1,3-葡聚糖酶和几丁质酶混合液对大豆疫霉菌的菌丝生长、孢子囊形成和孢子萌发的抑制作用明显,其次是β-1,3-葡聚糖酶,而几丁质酶对大豆疫霉菌的抑制作用不明显。表明大豆对大豆疫霉根腐病的抗性与β-1,3-葡聚糖酶和几丁质酶的活性呈正相关关系。β-1,3-葡聚糖酶和几丁质酶混合对大豆疫霉菌的抑制具有协同增效作用。     

木霉REMI突变株主要生防酶活性改变及其基因部分序列差异的研究

本文探讨了来源于同一出发菌株木霉T21的不同木霉REMI突变株的主要生防酶活性的改变及其基因部分序列的差异,利用生化技术测定了木霉几丁质酶和β-1,3-葡聚糖酶酶活性,并对这两种酶的基因部分序列进行了分析.结果表明,木霉REMI突变株几丁质酶和β-1,3-葡聚糖酶活性变化较大;相对于出发菌株T21,菌株Ttrm68和Ttrm31酶活性极显著高于出发菌株T21,而Ttrm94则极显著低于T21.采用简并引物克隆几丁质酶和β-1,3-葡聚糖酶基因的部分序列,发现菌株Ttrm68、Ttrm31在几丁质酶基因中插入了GGTATCGATATCGAC片段,菌株Ttrm94在β-1,3-葡聚糖酶基因中插入了GTC片段.     

香蕉采后炭疽病发生与几丁酶和β-1,3-葡聚糖酶的关系

 几丁酶和β-1,3-葡聚糖酶普遍存在于植物体内,但迄今未在植物中发现有几丁质存在。植物中几丁酶提取液能高度抑制真菌的生长,而β-1,3-葡聚糖酶能起协同作用。     

脂肽对稻瘟病菌几丁质酶和葡聚糖酶的影响

 研究经比基尼链霉菌(Streptomyces bikiniensis)HD-087发酵产物脂肽处理后的稻瘟病菌(Magnaporthe grisea)菌丝体内的几丁质酶活性和β-1,3葡聚糖酶活性的变化情况,分析chit基因和β-1,3 glu基因的表达量变化,旨在探究脂肽抗稻瘟病菌的作用机理。采用HPLC分析法鉴定了S. bikiniensis HD-087产生的脂肽种类,利用荧光定量PCR技术检测稻瘟病菌菌丝中chit基因和β-1,3 glu基因mRNA的表达情况。结果表明S. bikiniensis HD-087产生的脂肽主要是伊枯草素。经EC₉₀浓度的脂肽提取物处理6 h后,稻瘟病菌菌丝中几丁质酶活性和chit基因的mRNA表达量分别比对照组上调了6.77倍和51.27倍;处理12 h后,β-1,3葡聚糖酶的活性和β-1,3 glu基因的mRNA表达量分别比对照组上调了2.44倍和14.13倍。表明脂肽能够诱导稻瘟病菌菌丝体chit基因和β-1,3 glu基因的大量表达,从而破坏细胞壁结构,推测脂肽阻遏了稻瘟病菌的细胞自噬进程。     

产酶溶杆菌OH11菌株胞外酶调控相关基因ctp的克隆及功能的初步分析

利用mariner转座子对产酶溶杆菌Lysobacter enzymogenes OH11进行转座诱变,构建菌株OH11的突变体文库.筛选到1株4种胞外酶(蛋白酶、纤维素酶、几丁质酶和β-1,3-葡聚糖酶)产生均减少的突变株D-11.通过亚克隆,鉴定转座子的插入位点,涉及1个羧基末端蛋白酶(carboxy-terminal protease)编码基因ctp.通过同源重组的方法对该基因进行敲除,对缺失突变体Δctp表型分析发现:(1)Δctp与野生型OH11在营养丰富型(2YT)与营养缺陷型(MMX)培养基中生长速率基本一致;(2)Δctp降低了蛋白酶、纤维素酶和β-1,3-葡聚糖酶的产生,但不影响几丁质酶的产生;(3)Δctp生物膜的产生量明显减少.研究还表明,突变体基本不改变其对油菜菌核病菌Sclerotinia sclerotiorum、水稻纹枯病菌Rhizoctonia solani和辣椒疫霉病菌Phytophthora capsici的拮抗能力.互补菌株均恢复了野生型的相关功能.     

链霉菌几丁质酶基因分子检测、克隆及原核表达

随着分子生物学的发展,近几年生物防治分子水平的研究也发展很快,在植物抗性基因和病原菌无毒基因的鉴定与分离、真菌酶抑制剂、抗真菌蛋白质等方面取得了很大进展。在抗真菌蛋白方面, 报道最多的是几丁质酶,它催化几丁质的水解,从而破坏植物病原真菌细胞壁的主要组分。链霉菌是一类重要的天然抗生素和几丁质酶生产菌,能分泌多种胞外酶,如纤维素酶、几丁质酶和木聚糖酶等,以分解和利用土壤环境中的多种有机质。本试验建立的PCR分子检测方法,可以从土壤细菌中直接筛选产生几丁质酶的链霉菌菌株,发掘几丁质酶资源。在此基础上克隆了一株链霉菌菌株的几丁质酶基因,并在大肠杆菌中进行了表达。     

通过染色体整合几丁质酶基因提高伯克氏菌生防能力

为了提高伯克氏菌Burkholderia vietnamiensis的生防能力,通过Tn5转座子介导,将其携带的来自枯草芽孢杆菌Bacillus subtilis的几丁质酶基因整合到野生伯克氏菌B418染色体DNA上,获得工程菌株B418-37。对获得的转化子进行Southern杂交和几丁质酶活性检测,结果证实几丁质酶编码基因已整合到伯克氏菌B418-37染色体DNA上并能表达几丁质酶。生物学特性研究发现几丁质酶基因整合到伯克氏菌染色体中,没有影响野生菌的解磷、解钾、固氮及其在植物根际的定殖能力。平板抑菌试验和温室盆栽试验显示,与野生型相比,该工程菌株对多种病原真菌的抑菌效果增强,说明几丁质酶在植物病害的防治中具有重要作用。上述结果说明通过染色体整合几丁质酶基因是获得多功能生防工程菌的有效途径之一。     

木霉几丁质酶及其基因的研究进展

现已报道8种木霉的39个几丁质酶基因,其中22个为42kD内切酶基因.这些42kD内切酶基因的核苷酸序列及其编码的前体蛋白的氨基酸序列极为相似.42kD几丁质酶基因开放阅读框一般有3个内含子,前体蛋白一般有约22AA的信号序列,引导输出.成熟蛋白具有催化域、磷酸化域和耱基化域.基因的表达是诱导型的,受几丁质及真菌几丁质细胞壁的强诱导,受代谢物阻遏.转入植物的木霉几丁质酶基因可正确表达.本文就木霉生防菌株几丁质酶及其基因克隆、几丁质酶基因结构和功能、几丁质酶基因的表达和调控,以及木霉几亍质酶的生防应用前景等几方面进行了综述.     

芒果采后潜伏真菌活化与几丁酶、β-1,3-葡聚糖酶的研究

芒果采后潜伏病原真菌活化与果实的生理状况有关。几丁酶、β－１，３－葡聚糖酶随着果实的后熟进程或病理过程的发展，活性逐渐提高，但果实出现明显病害症状时活性下降。两种酶的活性下降，可能是由潜伏真菌产生的代谢产物所抑制，其抑制因子不能被丙酮所沉淀。果实内几丁质含量的高低与真菌侵染的情况及果实组织染病率相一致。     

螺旋毛壳ND35 β-1,3-葡聚糖酶的诱导、性质及其抑菌作用

 以病原菌Rhizoctonia solani的细胞壁为诱导物,模拟毛壳菌自然的重寄生过程,研究了内生真菌螺旋毛壳(Chaetomium spirale) ND35 β-1,3-葡聚糖酶的产酶条件、性质,尤其是不同碳源的调控作用。结果表明,不同种类的真菌细胞壁及几丁质和昆布多糖,均可诱导产生β-1,3-葡聚糖酶,而作为分解代谢产物的葡萄糖则抑制产酶。经硫酸铵沉淀、DEAE-Sepharose阴离子交换层析及Phenyl-Sepharose疏水层析,并通过SDS-PAGE鉴定,纯化了一种分子量约为73 kDa的内切β-1,3-葡聚糖酶GLUC73。其最适反应温度为55℃,在40℃以下较稳定;最适pH值为5.5,在pH 5-9范围内均很稳定;酶活性受Hg²⁺、Fe³⁺、Zn²⁺、Mg²⁺等金属离子不同程度的抑制,Mn²⁺和Co²⁺对酶有激活作用;以昆布多糖为底物时,该酶的米氏常数K_m为0.412 mg·mL^-1,最大反直速度V_max为3.876 U·mL^-1。粗酶液同时具有β-1,3-葡聚糖酶和几丁质酶活性,离体抑菌试验表明,对苹果炭疽病菌(Glomerella cingulata)、杨树腐烂病菌(Valsa sordida)、苹果树腐烂病菌(Valsa mali)的菌丝生长和孢子萌发有明显的抑制作用。通过对β-1,3-葡聚糖进行免疫细胞化学标记和超微结构观察,间接证明了β-1,3-葡聚糖酶在螺旋毛壳重寄生过程中的作用。     

枯草芽孢杆菌XF-1中脱乙酰几丁质酶在大肠杆菌中的表达及其抑茵活性

根据脱乙酰几丁质酶同源基因序列设计引物,扩增、克隆和测序了枯草芽孢杆菌Bacillussubtilis菌株XF-1的脱乙酰几丁质酶基因（CSrlo该基因编码区为834bp,编码由277个氨基酸组成的约30kD的蛋白质,其基因序列与枯草芽孢杆菌菌株B168的脱乙酰几丁质酶基因的相似性达到99％,氨基酸序列相似性为98％,在第19、47、60、256和257位的氨基酸发生了变化,分别由异亮氨酸代替了菌株B168脱乙酰几丁质酶中的甲硫氨酸、缬氨酸代替了谷氨酸、苏氨酸代替了异亮氨酸、天冬氨酸代替了谷氨酸、赖氨酸代替了天冬酰胺。菌株xF一1对稻瘟病菌Magnaportheoryzae和芸薹根肿菌Plasmodiophorabrassicae有抑制作用,而菌株B168没有。菌株xF－1和B168的CSFI基因在大肠杆菌Escherichiacoli中的表达产物均具有脱乙酰几丁质酶活性,但前者的表达产物对稻瘟病菌及芸薹根肿菌具有抑制作用,而后者没有。表明脱乙酰几丁质酶是xF－1抑制根肿病作用机制之一,且上述5个氨基酸替代可能与抑菌机制有关。     

爪哇根结线虫-β1,4-内切葡聚糖酶基因cDNA全长克隆和序列分析

 以爪哇根结线虫为材料,根据同源序列法分别进行3'末端和5'末端的RACE,获得-β1,4-内切葡聚糖酶基因cDNA全长。此cDNA全长序列为1 675 bp,包括1 521 bp的完整ORF,编码一含506 aa的多肽。该基因命名为Mj-eng3-,其推导蛋白的编码氨基酸与南方根结线虫的-β1,4-内切葡聚糖酶基因MI-ENG-1、MI-ENG-3和MI-ENG-4的同源性为95.3%、95.8%和85.3%,与另外5个植物寄生线虫β-1,4-内切葡聚糖酶基因推导蛋白PP-ENG-1、GR-ENG-1、GT-ENG-1、HG-ENG-1、HS-ENG-1编码氨基酸的同源性分别为51.2%、43.7%、43.7%、46.8%和45.3%。     

寄生于南方根结线虫卵的长梗木霉几丁质酶基因TlChi46的克隆

为进一步筛选高效寄生线虫真菌和阐明其寄生线虫卵的机理,本研究从湖北省烟草南方根结线虫雌虫分离到1株具高效生防潜力的菌株HBF1。形态学、rDNA-ITS和翻译延长因子tef1-α序列分析鉴定该菌为长梗木霉菌Trichoderma longibrachiatum,其对南方根结线虫卵第10 d寄生率为80.45%。通过简并引物设计和RACE技术克隆其几丁质酶基因,分析该基因序列及与其他几丁质酶的同源性。该菌是1株可以产生几丁质酶的南方根结线虫卵寄生真菌,第10 d几丁质酶的活性达到高峰,为24.88μmol/h/mL。本研究首次从长梗木霉HBF1菌株中克隆到1个几丁质酶基因TlChi46,该基因DNA全长1 793 bp,含3个内含子和1个1 272 bp的开放阅读框,编码423个氨基酸,理论分子量45.9 kDa,等电点5.23。同源性比对表明和昆虫寄生菌几丁质酶的亲缘关系较远。从长梗木霉HBF1中克隆得到的几丁质酶基因编码的几丁质酶的功能域可供进一步研究,高效产几丁质酶并有效寄生南方根结线虫卵的长梗木霉对南方根结线虫具有良好的生防潜力。     

产酶溶杆菌OH11双精氨酸转运系统关键基因tatC的功能分析

本研究采用同源重组的方法对产酶溶杆菌Lysobacterenzymogenes OH11中双精氨酸转运系统关键基因tatC进行缺失突变,通过对突变体表型及表型相关基因表达分析来研究该基因在菌株OH11中的功能,重点分析该基因与产酶溶杆菌中热稳定抗真菌因子HSAF生物合成的关系。研究结果表明,基因tatC的突变显著提高了HSAF生物合成的产量,以及HSAF生物合成的关键基因pks／nrps转录水平;改变了菌株OHll的细胞形态,使细胞从棍棒状变为椭圆状;并降低了菌株OH11生物膜的形成和滑动能力以及在营养缺陷型（10％TSB）培养基中的生长速率,但不改变其在营养丰富培养基（100％TSB）中的生长速率。此外,与野生型OH11相比,基因tatC突变株不改变其蛋白酶、纤维素酶、β-1,3-葡聚糖酶和几丁质酶的产生水平以及其对瓜果腐霉Pythiumapanidermamm、立枯丝核菌Rhizoctoniasolani和禾谷镰刀菌Fusariumgraminearum的拮抗能力。     

受黄色镰刀菌侵染的马铃薯薯块的抗氧化酶、细胞壁防御酶及StLTPa1基因的表达特性

黄色镰刀菌Fusarium culmorum为黑龙江省马铃薯干腐病主要致病菌,干腐病可以导致马铃薯在窖藏过程中发生腐烂,影响薯块的商品价值和食用价值,为进一步研究马铃薯干腐病的发生和防治,本研究采用黄色镰刀菌对不同抗性的马铃薯块茎进行侵染,对病原菌侵染过程中薯块的抗氧化酶及细胞壁降解酶变化及病程相关基因的表特性进行了研究。结果表明,当黄色镰刀菌侵染块茎时,块茎中的可溶性蛋白和丙二醛(malondlaldehyde,MDA)含量,超氧化物歧化酶(superoxide dismutase,SOD)、过氧化物酶(peroxidase,POD)活性、几丁质酶(chitinase)和β-1,3-葡聚糖酶(β-1,3-glucanase)活性都呈现不同程度的上升趋势。非特异性脂质转移蛋白基因StLTPa1表达量随着黄色镰刀菌的侵染时间呈波动性,在植物防御反应中发挥一定的作用。     

贝莱斯芽孢杆菌Bacillus velezensis YB15β-葡聚糖酶的抑菌作用与基因克隆

本文在对峙法验证贝莱斯芽孢杆菌B. velezensis YB15具抑菌作用的基础上,用透明圈法、DNS法研究其产β-葡聚糖酶特性,利用对峙法验证该酶抑菌作用,通过PCR法获得目的基因,分析克隆序列并预测其蛋白质结构与功能。结果表明,该菌株对多种病原真菌有拮抗作用,杨树紫纹羽病菌拮抗带达11.0 mm,该菌提取的葡聚糖酶粗酶液对杨树紫纹羽病菌抑菌带为10.6 mm,说明葡聚糖酶在菌株YB15抑菌中有重要作用。不同接种方法影响菌株YB15葡聚糖酶水解透明圈形成,点种法水解圈与菌落直径之比在72 h可达14.1,效果最好。克隆所得菌株YB15葡聚糖酶基因命名为Bglu1,该基因序列长732 bp,编码243个氨基酸,此酶蛋白氨基酸序列与解淀粉芽孢杆菌TB2β-1,3-1,4-葡聚糖酶同源性较高,属糖基水解酶16家族,N端疏水区存在信号肽并具跨膜区域,推测其为分泌蛋白。     

黄蓝状菌几丁质酶基因tfchi1的克隆、表达及抗菌活性

 为研究黄蓝状菌（Talaromyces flavus）几丁质酶性质和作用,通过RT PCR、3′ RACE及5′ TAIL PCR技术克隆了一个黄蓝状菌几丁质酶基因tfchi1,该基因全长为2 561 bp,含有6个内含子,包含一个1 194 bp的ORF,编码397个氨基酸,分子量为43.47 kDa,属于糖苷水解酶第18家族。利用基因重组的方法构建酵母分泌型表达载体pPIC9K/tfchi1,并转化毕赤酵母,筛选得到一株高效表达几丁质酶的工程菌GS TFCHI1 9,甲醇诱导第7 d酶活性最高,达32.29 U·mL-1。SDS PAGE检测纯化重组蛋白的分子量约44 kDa。重组几丁质酶Tfchi1最适反应温度为35℃,最适反应pH值为5.5,在pH 6～8之间稳定。Zn2+、Cu2+对 Tfchi1活性有明显的抑制作用。抑菌活性测定结果显示,Tfchi1可明显抑制敏感植物病原真菌的菌丝生长和分生孢子萌发。该酶在几丁质资源的开发利用和生物防治等领域具有较广的应用前景。     

几丁质酶在植物保护中的研究与应用进展

随着越来越多的几丁质酶基因被克隆 ,目前几丁质酶在植物保护上的应用日益受到重视 ,利用几丁质酶基因培育抗真菌基因工程植物新品种正逐渐成为植物防御真菌病害的一种有效途径。本文概括了几丁质酶的抗菌活性、诱导表达特性及其在植物抗真菌病害中的应用等方面的研究进展     

哈茨木霉S30胞外几丁质酶的纯化及特性

哈茨木霉Ｓ３０在ＳＭＣＳ液体培养基中恒温摇床（２００ｒ／ｍｉｎ,２７．５℃）上培养１５天,培养滤液经硫酸铵分级沉淀、ＤＥＡＥ－Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ Ｆａｓｔ Ｆｌｏｗ阴离子交换柱层析、Ｐｈｅｎｙ。－Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ Ｆａｓｔ Ｆｌｏｗ疏水层析、ＣＭ－Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ Ｆａｓｔ Ｆｌｏｗ阳离离子柱层析、Ｐｈｅｎｙｌ－Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ ＨＰ疏水柱层析获得了凝胶电泳谱带单一的几丁质酶。几丁质酶反应的